АКТИВНІСТЬ РИБОНУКЛЕАЗ ЯК МОЖЛИВИЙ ДІАГНОСТИЧНИЙ І ПРОГНОСТИЧНИЙ МАРКЕР РАКУ ПЕРЕДМІХУРОВОЇ ЗАЛОЗИ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-3-2021-g.9665

Рак передміхурової залози (РПЗ) — одне з найбільш поширених злоякісних новоутворень у чоловіків. Темпи підвищення захворюваності на РПЗ є найвищими серед усіх злоякісних новоутворень [1], а значне збільшення кількості хворих на цю онкопатологію відзначено за останні два десятиліття. Значна поширеність РПЗ спостерігається і в Україні. Незважаючи на 5-річну виживаність в 98,9% випадків при раку передміхурової залози, у 20–30% чоловіків через 5 років виявляється рецидив [2]. Саме із цим пов’язаний той факт, що діа­гностиці та лікуванню цієї патології останнім часом приділяється все більше уваги як за кордоном, так і в Україні. Таким чином, існує нагальна потреба в розробці нових підходів для більш ефективної терапії РПЗ. Вирішальне значення як для прогнозу перебігу онкопатології, так і для розробки нових схем персоніфікованого лікування має вивчення нових маркерів у тканині злоякісних пухлин перед­міхурової залози.

Рибонуклеази (РНКази) — велика і гетерогенна група гідролітичних ферментів, які виконують в клітині різноманітні функції, що робить їх важливим чинником епігеномної регуляції [3]. Вони відповідають за утворення і процесинг різноманітних видів РНК, включаючи мРНК, усіх видів мікроРНК, а також визначають тривалість існування різних РНК в клітині. Ці особливості визначають їх роль у таких важливих життєвих процесах, як синтез білка, проходження через клітинний цикл, диференціювання, а також реалізації апоптозу. Клітинні популяції, що швидко проліферують, відзначаються низькою активністю РНКаз, що зумовлено високою інтенсивністю синтезу білка і необхідністю активного функціонування великої кількості різноманітних РНК, задіяних у процесах трансляції. Цей фермент представляє інтерес, оскільки його активність пов’язана з функцією багатьох органів і систем цілісного організму та часто змінюється при багатьох захворюваннях, включаючи пухлини, під час яких виявляються зміни активності РНКази. Передміхурова залоза належить до органів, функція яких залежить від гормональних впливів та ряду допоміжних сигналів, зокрема багатьох регуляторних РНК, наявних у біологічних рідинах. Рівень багатьох мікроРНК та інших некодуючих РНК значною мірою залежить від ферментів, що знаходяться в крові, лімфі та рідинах позаклітинного середовища. Численна група ферментів гідролізу РНК — РНКаз недостатньо вивчена у цьому напрямку, зокрема мало відомостей про конкретний біологічний вплив кожного з таких ферментів. У той же час відомо, що відсутність або зміни внаслідок мутації у структурі молекули РНКази L можуть бути однією з причин виникнення раку передміхурової залози. Дані літератури свідчать, що перспективним у плані діагностики та прогнозування перебігу РПЗ є визначення активності та гетерогенності РНКаз [4]. Є також дані про те, що мутації гена, який кодує синтез РНКази L, мають пряме відношення до виникнення РПЗ у людини. Shook і співавт. вважають РНКазу L маркерним ферментом при РПЗ [5]. Наведені дані свідчать про доцільність вивчення РНКаз при цій онкопатології у людини. Поява нових методів дослідження, зокрема методики зимограм, що поєднує у собі високу розділяючу силу електрофорезу в поліакриламідному гелі з технікою виявлення ферментативної активності безпосередньо в електрофореграмах, розширила можливості досліджень у цьому напрямку. Застосування методу зимограм дає можливість не тільки оцінити загальну активність ферменту, але і виявити зміни його молекулярної маси та наявності ізоформ. Такий підхід допоможе покращити діагностику пухлин передміхурової залози і краще обґрунтувати тактику лікування. Отже, дослідження активності РНКаз в пухлинах передміхурової залози та біологічних рідинах хворих на РПЗ є досить перспективними. Однак асоціативні зв’язки між активністю РНКаз та клініко-патологічними особливостями раку передміхурової залози (рівень простато­специфічного антигену (ПСА) та шкала Глісона) вимагають подальших досліджень. Тому метою роботи було дослідити зв’язок рівня активності РНКаз у злоякісних пухлинах передміхурової залози та у біо­логічних рідинах хворих на РПЗ з клініко-патологічними особливостями неопластичного процесу та оцінити можливості їх застосування в якості діагностичних і прогностичних критеріїв для персоналізованої оцінки перебігу РПЗ та для розробки нових схем персоніфікованого лікування (прогнозування чутливості злоякісних пухлин до протипухлинних агентів).

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Пацієнти. У дослідженні взяли участь 120 хворих з різними стадіями РПЗ (Т1–Т4) (середній вік становив 65,0 ± 7,88 років), 30 пацієнтів з простатичною інтраепітеліальною неоплазією (ПІН) (середній вік становив 60,2 ± 3,6 років), які лікувалися в Національному інституті раку МОЗ України протягом 2017–2018 рр. та 30 умовно здорових чоловіків (група контролю). Усі пацієнти не отримували неоад’ювантну гормональну терапію. Від пацієнтів була отримана інформована згода на використання зразків у дослідницьких цілях. Дослідження було проведено відповідно до Гельсінської декларації та затверджено Комітетом з етики Національного інституту раку МОЗ України. Клінічний діагноз встановлювали на підставі визначення ПСА в сироватці крові, пальцевого ректального дослідження, комп’ютерної томографії органів малого тазу та/або трансректального ультразвукового та патоморфологічного дослідження передміхурової залози, остеосцинтиграфії, рентгенографії грудної клітки. У всіх пацієнтів діагноз підтверджено після трансректальної мультифокальної біопсії передміхурової залози під контролем ультразвукового дослідження (УЗД). Стадію пухлинного процесу визначали згідно з Міжнародною системою класифікації пухлин 2016 [6]. Проведено патоморфологічне дослідження видаленої пухлини відразу після операції для визначення ступеня поширення пухлинного процесу за шкалою Глісона. Видалені зразки тканини передміхурової залози фіксували протягом ночі у 10% буферному нейтральному формаліні (рН 7,2) за кімнатної температури, зневоднювали у градуйованій серії розчинів етанолу і вносили у парафіновий блок за стандартною процедурою. З парафінових блоків готували зрізи товщиною 5 мкм. Кожен десятий зріз фарбували гематоксиліном та еозином [7]. Оцінку прогресування пухлинного процесу проводили за шкалою Глісона [8]. Вимірювані бали становили від 6 до 10 (табл. 1). Залежно від показників шкали Глісона пацієнтів розподіляли на дві різні групи (<7 та ≥7). Рівні ПСА (отримані з передопераційних клінічних оцінок) знаходилися в інтервалі від 5,0 до 30,4 нг/мл із середнім значенням 13 г/мл.

Приготування екстрактів пухлинної тканини. Заморожену тканину (100 мг) хворих на РПЗ подрібнювали до тонкого порошку за допомогою ступки, періодично додаючи рідкий азот, який запобігає відтаванню тканини. Для визначення активності РНКаз порошок гомогенізували в 5 обсягах буферного розчину Гронова. Гомогенат центрифугували при 5000 об/хв (5 хв) у центрифузі з охолодженням (модель L7–70; Sigma). Для дослідження використовували супернатант, отриманий після центрифугування. Усі процедури одержання екстрактів проводили на льоду. Концентрацію білка визначали із застосуванням спектрофотометра NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, США).

Приготування фракції еритроцитів та плазми крові. Приблизно 6–9 мл периферичної крові пацієнтів (до радикальної простатектомії) та здорових донорів (добровольців лабораторії) було зібрано натщесерце у 9 мл пробірки, VACUTEST PLAST (VACUTEST KIMA, Італія), що містять K₃ EDTA 16,2 мг для вимірювання активності РНКаз у плазмі крові та еритроцитах.

Фракція цитозолю еритроцитів. Для видалення макрофагів та інших ядерних клітин суспензію крові пропускали через мікроколонку з целюлозою (4•18 мм) і центрифугували при 5000 g протягом 5 хв. Осад, що складається з еритроцитів, суспендували в 7 об. розчину NaCl (154 мМоль/л) і знову центрифугували. Процедуру промивання розчином NaCl повторювали тричі. Отримані таким чином еритроцити ресуспендували в розчині 0,05 М Na-фосфатного буфера рН 7,4 і центрифугували при 3000 g протягом 15 хв. Супернатант видаляли і додавали до осаду 7 об. деіонізованої води. Після 30 с ретельного перемішування гемолізат центрифугували протягом 2 хв при 5000 g. Надосадову рідину, яка складалася з гемолізату та уламків еритроцитів, збирали для подальшої обробки. Осад відкидали. Надосадову рідину еритроцитів центрифугували протягом 30 хв при 30 000 g для видалення уламків та мембранної фракції еритроцитів. Отримана фракція цитозолю еритроцитів не мала виявлених елементів клітинної структури.

Фракція плазми крові. Досліджувані зразки крові (10 мкл) змішували зі 100 мкл охолодженого (4 °С) 0,14 М розчину хлориду натрію і вносили в пробірки 1,5 мл (Еппендорф), ретельно перемішували і центрифугували при 5000 g протягом 5 хв. До супернатанту додавали 500 мкл охолодженого ацетону, після чого поміщали в морозильну камеру при -20 °С на 10 хв, потім центрифугували при 5000 g протягом 5 хв. Для дослідження використовували осад, отриманий після центрифугування.

Приготування зразків сечі. Ранкові зразки сечі (15–40 мл) отримували у всіх учасників без ректального обстеження передміхурової залози або масажу, а потім центрифугували при 10 000 g протягом 30 хв для видалення уламків клітин та осаду.

Визначення концентрації білка. Концентрацію білка в отриманих екстрактах та фракціях визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, США). Для визначення активності ферменту використовували 5 мкг білка в 10 мкл/зразок. До 30 мкл фракції (пухлини, цитозолю еритроцитів, плазми та сечі) додавали 30 мкл 2% SDS в 4 мМ буфері трис-HCl рН 8,8, що містив 0,005% бромфеноловий синій з додаванням 5% сахарози. Суміш нагрівали при 90 °С протягом 10 хв, центрифугували при 3000 g протягом 10 хв і над­осадову рідину (7 мкл) вносили у лунки поліакриламідного гелю. Застосовано метод зимограм для виявлення активності РНКаз у крові (еритроцитах і плазмі крові) та сечі [9].

Визначення активності РНКаз методом зимограм. Одержані екстракти досліджували методом ензимо­грам із застосуванням електрофорезу в 15% поліакриламідному гелі у системі Laemmli [9, 10, 11]. У лунки гелю вносили по 7 мкл досліджуваного зразка. Електрофорез проводили у вертикальних блоках гелю, товщиною 0,8 мм. Для цього в якості субстрату до складу гелю вводили 20 мг/мл високополімерної РНК дріжджів Torula (Torulopsis utilis) (Sigma-Aldrich, США). Електрофорез проводили за кімнатної температури та за постійної напруги (100 В) в електродному буфері, що містив 1,4% гліцин, 27,5 мМ Трис-HCl та 0,1% додецилсульфату натрію. Після електрофорезу додецилсульфат натрію видаляли з гелів обробкою в 40 мл 25% ізопропанолу в 0,01 М Трис-HCl буфері протягом ночі. Ізопропанол видаляли і гелі інкубували в 0,05 М ацетатному буфері рН 5,5 протягом 60 хв за 37 °С. Після інкубації гелі промивали 0,01 М Трис-HCl протягом 10 хв і фарбували 0,2% розчином толуїдинового синього (Sigma-Aldrich, США) в 0,01 М Трис-HCl протягом 20 хв. Гелі промивали один раз протягом 10 хв і двічі протягом 20 хв в 0,01 М Трис-HCl. Після остаточного промивання 10% розчином гліцерину 0,01 М Трис-HCl гелі сушили на целофані. Гелі сканували за допомогою сканера HP Scanjet 5590. Результати оцінювали з використанням стандартної програми TotalLab 1.01.

Вивчення впливу двовалентних металів на активність РНКаз у хворих на РПЗ. Після закінчення електрофорезу електрофореграми виймали з апарату і після видалення додецилсульфату розрізали вздовж доріжок на три фрагменти, які містили однакову кількість розділеного матеріалу. Перший фрагмент інкубували в незміненому буфері, другий — у буфері, що містив 20 мкМ, а третій — 200 мкМ сульфату цинку або сульфату міді. Проби інкубували в термостаті протягом 60 хв за 37 °С як описано вище. Ензимограми обробляли у програмі TotalLab.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою математичної програми медико-біо­логічної статистики STATISTICA 6.0. Для оцінки достовірності отриманих результатів використовували t-критерій Стьюдента; достовірними вважали розбіжності при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Активність РНКаз у злоякісних пухлинах перед­міхурової залози у хворих на РПЗ. Дефіцит продукції РНКази L клітинами передміхурової залози вважається однією з вірогідних причин злоякісної трансформації клітин і РПЗ. Зокрема. встановлено, що алель гена HPC1 кодує специфічну однониткову РНКазу RNASEL, пов’язану також з антивірусною дією інтерферону. Ця РНКаза ензиматично активується шляхом зв’язування з незвичайним 2’-5’ фосфорильованим олігоаденілатом (2–5A). Активована 2–5A РНКаза запускає процес апоптозу в пухлинних клітинах. У клітинах з мутацією гена HPC1 апоптоз блокується і пухлинні клітини виживають [12, 13]. Тому вивчення РНКаз при пухлинах передміхурової залози може сприяти розробці нового маркера діагностики цього захворювання. У роботі проведено дослідження активності РНКаз в пухлинах передміхурової залози хворих на ПІН та РПЗ.

У цьому розділі досліджень вивчали активність РНКаз у тканині пухлини залежно від стадії захворювання у порівнянні з рівнем ПСА та ступенем поширення процесу (за шкалою Глісона). Одержані дані представлені на рис. 1.

Ферментативна активність РНКаз реєструється в ензимограмах у вигляді двох дискретних зон (див. рис. 1а). Зона 1, у вигляді одиночної вузької смуги, що виявляє найбільшу електрофоретичну рухомість, представляє собою рівень активності немодифікованого ферменту. Зона 2 — набір РНКаз, модифікованих глікозидними залишками, за даними ряду авторів [14, 15, 16] вони представляють ферменти, модифіковані приєднанням залишків сіалових кислот і тому виявляють активність у поліакриламідному гелі у вигляді широкої зони із значно меншою рухомістю. Важливо відмітити, що ферментативна активність в електрофореграмах реєструється у чистому вигляді, оскільки природний інгібітор РНКаз має значно більшу молекулярну масу і рухається у даній системі електрофорезу значно повільніше, ніж РНКази (див. рис. 1а). Змін рухомості або появи нових зон ферментативної активності РНКаз при РПЗ не відмічено. У даному розділі досліджень представлені результати середніх значень активності, обрахованих для обох зон (див. рис. 1б). Найбільш висока активність РНКаз виявляється у тканині перед­міхурової залози при ПІН. На наступних стадіях розвитку пухлини (Т1–Т4) спостерігається прогресивне зниження ферментативної активності. Одночасно спостерігається зростання рівня ПСА у плазмі крові хворих та величини поширення процесу за шкалою Глісона (див. табл. 1).

Рис. 1. Активність РНКаз у тканині передміхурової залози хворих на ПІН та РПЗ: а — типова ензимограма: трек 1 — ПІН, трек 2 — Т1, треки 3–5 — Т2, треки 6–7 — Т3, треки 8–11 — Т4; б) — активність РНКаз у тканині передміхурової залози хворих на ПІН та РПЗ на різних стадіях захворювання (Т1–Т4).

При дослідженні активності РНКаз велике значення має йонне оточення ферменту. Особливу роль у прояві активності відіграють йони цинку. Відомо, що йони цинку беруть участь у багатьох метаболічних процесах. Цей життєво важливий елемент відіграє важливу роль у синтезі та перетвореннях нуклеїнових кислот. Цинк належить до найбільш важливих і незамінних для життєдіяльності організму людини мікроелементів. За поширенням в організмі людини цей елемент — на другому місці після заліза. Здатність цинку брати участь у процесах лігандоутворення з органічними молекулами пояснює надзвичайно широкий спектр його участі у різних біологічних системах. Це поєднується з відносною безпекою цього елемента, особливо відсутністю оксидантних властивостей (на відміну від заліза і міді), що покращує транспорт і метаболізм цинку в організмі та швидке біологічне засвоєння його клітинами. Цинк є незамінним для генної експресії і метаболізму нуклеїнових кислот, а, відповідно, і всіх процесів росту і диференціації клітин. Він також є структурним компонентом біологічних мембран, клітинних рецепторів, протеїнів, входить до складу понад 200 ензиматичних систем, що регулюють основні процеси обміну речовин [17]. Цинк є структурним компонентом таких ферментів, як РНК-полімераза, ДНК-полімераза, алкогольдегідрогеназа, карбокси­пептидаза А і В, піруваткарбоксилаза, супероксиддисмутаза та багатьох інших, що дозволяє зробити висновок про широкий спектр метаболічної активності цього елемента [18, 19]. В організмі людини загалом міститься близько 2 г цинку (у м’язах, кістках та інших тканинах). Найвища концентрація його в еритроцитах, передміхуровій та підшлунковій залозах. Більша частина цинку в крові (75–85%) зв’язана з карбоангідразою еритроцитів. Цинк є інгібітором формування і трансформації еритроцитів у їх гемолізовані форми, а також стабілізатором клітинних плазматичних мембран проти дії вірусної інфекції і токсинів. Високий вміст цинку у шкірі, волоссі, нігтях, а також у чоловічих репродуктивних органах, зокрема у передміхуровій залозі. Середній вміст цього елемента в сироватці крові становить близько 960 мкг/л; добова потреба в ньому — 0,3 мкМ/кг, при деяких захворюваннях вона може зростати до 0,7 мкМ/кг [20]. Йони цинку активують ряд гідролітичних ферментів, зокрема нуклеаз.

Передміхурова залоза є органом, у якому концентрується цинк в організмі людини. Відомо, що при злоякісному перероджені передміхурової залози рівень цинку в залозі різко знижується. Тому важливо було оцінити безпосередній вплив цинку на активність РНКаз у цьому органі. Мідь є біологічним конкурентом цинку, а тому важливо було порівняти вплив цього металу на активність РНКаз передміхурової залози. Особливу перевагу має при цьому застосування методу ензимограм, оскільки у процесі ферментативної реакції в електрофореграмі фермент виступає у практично ізольованій формі і на нього не діють сторонні фактори. На рис. 2 представлені результати вивчення впливу іонів двохвалентних металів (міді та цинку) на активність РНКаз у тканині передміхурової залози хворих на РПЗ.

Під час дослідження впливу йонів міді на активність РНКаз РПЗ виявилася чітка закономірність. При всіх застосованих концентраціях (20 мкМ і 200 мкМ) йони міді виражено інгібують активність РНКаз передміхурової залози (див. рис. 2а), що відрізняє їх від дії йонів цинку (див. рис. 2б). У багатьох метаболічних процесах їх вплив виявляється взаємно протилежним. Дослідження впливу йонів цинку проводилися аналогічно такому з йонами міді (див. рис. 2б). З представлених даних видно, що невисокі концентрації цинку (20 мкМ) стимулюють активність РНКаз. Однак при подальшому підвищенні концентрації цинку (200 мкМ) активність РНКаз не відрізняється від контрольних показників (див. рис. 2б). Можливо, одним із факторів, що визначають низький рівень активності РНКаз у передміхуровій залозі при прогресуванні пухлини (Т4) (див. рис. 1б), є відомий факт зниження рівня цинку в цьому органі.

Рис. 2. Залежність активності РНКаз в тканині пухлини у хворих на РПЗ від концентрації йонів міді (а) та цинку (б). Контроль — 0,05 М трис-HCl-буфер, рН 7,5

Активність РНКаз у цитозолі еритроцитів донорів та хворих на ПІН та РПЗ. Ізольована РНКаза з цитозольної фракції еритроцитів людини являє собою полі-С-авідну РНКазу з максимальною активністю при pH 6,5. Фермент стійкий до обробки сильними кислотами та нагрівання до 95 °С. Молекулярна фільтрація еритроцитарної РНКази показує, що вона складається з двох фракцій, що відрізняються за молекулярною масою 19 кДа та 15 кДа [21]. Оскільки еритроцити не метаболізують РНК, то не можна передбачати жодної функції для РНКази­ та інгібітора, пов’язаного з РНКазою, в еритроцитах. Якщо припустити, що спостережувана еритроцитарна РНКаза є залишковим ферментом, оскільки вона функціонувала в ядерних попередниках еритроцитів, можна вважати, що рівні вільної та інгібованої активності еритроцитарної РНКази можуть бути пов’язані з нормальним або аномальним механізмом дозрівання еритроцитів.

У периферичній крові донорів найбільш високу ферментативну активність виявляє цитозоль еритроцитів (335 ± 75,1 у.о.) та сеча (352 ± 98,0 у.о.) (див. табл. 1). РНКази цитозолю еритроцитів на ензимограмах представлені у вигляді однієї зони активності (рис. 3а; треки 1–8). Інтенсивність цієї зони в цитозолі еритроцитів хворих (ПІН та РПЗ) значно знижена порівняно з еритроцитами донорів (див. рис. 3а; трек 1). Відзначається різке зниження загальної активності РНКаз в цитозолі еритроцитів у пацієнтів на різних стадіях захворювання порівняно з донорами (табл. 2). У деяких пацієнтів рівень активності знижується до 0 (див. рис. 3а, трек 6). Можна відмітити виражене падіння активності РНКаз в цитозолі еритроцитів у хворих з діагнозом ПІН та РПЗ (в 22,7 та 12,0 разів відповідно, порівняно з донорами) (див. табл. 2). Також була вивчена активність РНКаз в цитозолі еритроцитів хворих на РПЗ  залежно від ступеня поширеності процесу. Хворих було розподілено на дві групи відповідно до показника поширення пухлини за шкалою Глісона: група І — хворі з показником за шкалою Глісона <7, група ІІ — хворі з величиною показника за шкалою Глісона ≥7 (рис. 4). Порівнюючи величини активності РНКаз у цитозолі еритроцитів, можна помітити, що у хворих з поширеним неопластичним ростом в групі ІІ активність ферменту знижена в 9 разів (р < 0,05) порівняно з активністю ферменту у хворих групи І. Цей показник може бути використаний як додатковий діагностичний і прогностичний маркер поширеності пухлинного процесу.

Рис. 3. Активність рибонуклеаз: а — у цитозолі еритроцитів донорів (1); хворих на РПЗ (Т2) (2) та ПІН (3–8); б — в цитозолі еритроцитів (1, 4, 7), плазмі крові (2, 5) та сечі (3, 4, 6, 8) хворих на РПЗ; в — активність рибонуклеаз у сечі донорів (1, 2, 3, 4) та хворих на РПЗ (5, 6, 7, 8) (типові ензимограми)

*p<0,05 порівняно з показниками донорів

На рис. 3 представлені типові ензимограми активності РНКаз у цитозолі еритроцитів, плазмі крові та сечі донорів та хворих на ПІН або РПЗ. Було встановлено, що в цитозолі еритроцитів, плазмі крові та сечі спектри РНКаз радикально відрізняються між собою, що виключає можливість прямого потрапляння ферментів з еритроцитів у плазму крові, а з плазми крові через нирковий бар’єр — у сечу.

Активність РНКаз у плазмі крові. Плазма крові містить ряд РНКаз, які продукуються клітинами кровотворної системи, ендотелію судин та органів людського організму. Активність РНКаз у плазмі крові хворих на РПЗ в ензимограмах (див. рис. 3б; треки 2, 5) виявляється у вигляді ряду зон (4–8), з нечіткими межами, що пов’язано, згідно з даними літератури, з утворенням міжмолекулярних агрегатів та модифікацією частини ферменту вуглеводневими залишками. Плазма крові як у донорів, так і у хворих на ПІН та РПЗ виявляє значно нижчу питому активність порівняно із сечею, що частково пов’язано з великою кількістю загального білка в плазмі крові. Під час порівняння 2 груп хворих на РПЗ за поширеністю пухлинного процесу за шкалою Глісона було показано, що рівень активності РНКаз в плазмі крові в групі ІІ (за шкалою Глісона ≥ 7) в 5 разів вищий (р <0,001), ніж у групі І (за шкалою Глісона <7) (рис. 4). Згідно з нашими даними, активність РНКаз у плазмі крові теж може бути важливим додатковим прогностичним маркером поширеності пухлинного процесу.

Активність РНКаз у сечі. Сеча людини виявляє активність РНКази, що пов’язано з діяльністю багатьох органів і систем організму. При дослідженні РНКази сечі методом ензимограм виявляється її гетерогенність. У сечі хворих на РПЗ (див. рис. 3в; треки 3, 6, 8) реєструється дві або навіть три зони активності. З представлених даних видно, що активність РНКаз у сечі донорів, хворих з ПІН та РПЗ варіює в значних межах, від високої (див. рис. 3в; треки 1, 2, 5, 7) до дуже низької (див. рис. 3в; треки 3, 4, 6, 8). Появи нових ферментів, або зміни величини молекулярної маси у хворих на РПЗ порівняно з донорами не відмічено (див. рис. 3в).

Рис. 4. Активність РНКаз у крові та сечі хворих на РПЗ залежно від прогресування процесу за шкалою Глісона *р < 0,05; **р < 0,001

За статистикою Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ) у 2018 р. РПЗ є другою провідною причиною смерті від раку серед чоловіків із 1,2 млн нових випадків у всьому світі [22]. У західних країнах рівень захворюваності високий порівняно зі східними, що спричинено способом життя та харчуванням [23]. Через мультифокальну природу більшості РПЗ, клональну гетерогенність у кожного пацієнта та неможливість відбору проб всієї пухлини, інформація з однієї біопсії тканини, як правило, є недостатньою і не відображає динаміку пухлини у всій передміхуровій залозі. Застосування методу ензимограм дозволяє більш детально прослідкувати значення активності РНКаз та їх ізоформ у розвитку злоякісних новоутворень передміхурової залози. Зокрема показана зворотна залежність між активністю РНКаз у пухлинній тканині, рівнем ПСА, ступенем поширеності процесу (за шкалою Глісона) та стадією розвитку захворювання. У процесі розвитку РПЗ та його поширення спостерігається зростання рівня ПСА та одночасне зниження активності РНКаз у пухлинній тканині.

Метаболом плазми крові відображає загальну реакцію організму пацієнта як на захворювання (рак), так і на проведене лікування (хіміо-, гормональна або променева терапія). Тому нова стратегія рідинної біопсії виникла як перспективний малоінвазивний метод отримання генетичного профілю РПЗ, який долає ці обмеження [24, 25]. Вивчення активності РНКази в біологічних рідинах (крові та сечі) за допомогою неінвазивної аналітичної процедури забезпечує отримання більш повної інформації про прогресування пухлини. Визначення активності РНКази в цитозолі еритроцитів та плазмі крові показало здатність відрізняти РПЗ від здорових донорів та корелювання зі стадією захворювання. Активність РНКази в цитозолі еритроцитів та плазмі крові є дуже перспективним кандидатом на діагностичний та прогностичний біомаркер, що може відкрити більше можливостей для діагностики та прогнозування перебігу РПЗ. Для ранньої діагностики метод ензимограм є простим і доступним за ціною, не вимагає хірургічного втручання, потребує мінімальної кількості досліджуваного матеріалу і може бути використаний для досліджень у пацієнтів з РПЗ та іншими захворюваннями сечостатевої системи.

ВИСНОВКИ

1. Застосування техніки ензимограм дозволило встановити, що у тканині пухлин хворих на РПЗ спостерігається зниження ферментативної активності РНКаз при прогресуванні пухлини, що асоціюється зі зростанням рівня ПСА у плазмі крові хворих та величиною поширеності процесу за шкалою Глісона.

2. Показано, що в цитозолі еритроцитів периферичної крові хворих на ПІН та РПЗ спостерігається зниження активності РНКаз (в 22,7 та 12,0 разів відповідно, порівняно з донорами). У хворих на РПЗ з поширеним неопластичним ростом (за шкалою Глісона ≥ 7) активність РНКаз знижена в 9,0 разів (р < 0,05) порівняно з активністю ферменту в групі хворих з менш поширеним процесом (за шкалою Глісона < 7).

3. Показано, що активність РНКаз в плазмі крові хворих на РПЗ з поширеним неопластичним ростом (за шкалою Глісона ≥ 7) в 5 разів вища (р < 0,001), ніж у хворих з менш поширеним процесом (за шкалою Глісона < 7).

4. Одержані дані свідчать, що активність РНКаз у цитозолі еритроцитів та плазмі периферичної крові хворих на РПЗ може бути можливим додатковим біомаркером для діагностики і розробки тактики лікування з урахуванням індивідуальних особливостей, яка допоможе уникнути побічних реакцій при застосуванні радикальних методів лікування та виникненні рецидивів.

Робота виконувалася в рамках НДР «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» (0117U002034) за фінансової підтримки Цільової програми наукових досліджень Відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології НАН України «Молекулярно-генетичні і біо­хімічні механізми регуляції клітинних та системних взаємодій за фізіологічних та патологічних станів» (2017–2021).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Ferlay J, Parkin DM, Steliarova-Foucher E. Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 2008. Eur J Cancer 2010; 46 (4): 765–81.
2. Rosario S. Polyamine Biosynthetic Metabolic Dysregulation: Targeting and the Adaptive Response. 2020.
3. Shlyakhovenko VO. Ribonucleases. Possible new approach in cancer therapy. Exp Oncol 2016; 38 (1): 2–8.
4. Silverman RH. Implications for RNase L in prostate cancer biology. Biochemistry 2003; 42 (7): 1805–12.
5. Shook SJ, Beuten J, Torkko KC, et al. Association of RNASEL variants with prostate cancer risk in Hispanic Caucasians and African Americans. Clin cancer Res 2007; 13 (19): 5959–64.
6. Brierley JD, Gospodarowicz MK, Wittekind C. TNM classification of malignant tumours. John Wiley & Sons, 2016.
7. Popescu LM. Adaptation Biology and Medicine. Alpha Science International Limited, 2013.
8. Gleason DF. Histologic grading of prostate cancer: a perspective. Hum Pathol 1992; 23 (3): 273–9.
9. Yasuda T, Nadano D, Tenjo E, et al. The zymogram method for detection of ribonucleases after isoelectric focusing: analysis of multiple forms of human, bovine, and microbial enzymes. Anal Biochem 1992; 206 (1): 172–7.
10. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227 (5259): 680–5.
11. Yen Y, Green PJ. Identification and properties of the major ribonucleases of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 1991; 97 (4): 1487–93.
12. Cussenot O, Valeri A, Berthon P, et al. Hereditary prostate cancer and other genetic predispositions to prostate cancer. Urol Int 1998; 60 (2): 30–4.
13. Xiang Y, Wang Z, Murakami J, et al. Effects of RNase L mutations associated with prostate cancer on apoptosis induced by 2′, 5′-oligoadenylates. Cancer Res 2003; 63 (20): 6795–801.
14. Sakakibara R, Hashida K, Kitahara T, et al. Characterization of a unique nonsecretory ribonuclease from urine of pregnant women. J Biochem 1992; 111 (3): 325–30.
15. Thomas JM, Crisp M, Hodes ME. Sialic acid residues contribute to the heterogeneity of human serum ribonuclease: demonstration by isoelectric focusing and neuraminidase treatment of serum. Clin Chim acta 1984; 142 (1): 73–81.
16. Mizuta K, Awazu S, Yasuda T, et al. Purification and characterization of three ribonucleases from human kidney: comparison with urine ribonucleases. Arch Biochem Biophys 1990; 281 (1): 144–51.
17. Silva CS, Moutinho C, da Vinha A, et al. Trace Minerals in Human Health: Iron, Zinc, Copper, Manganese and Fluorine. Int J Sci Res Methodol 2019; 13 (3): 57–80.
18. Bhagavan NV, Ha C-E. Essentials of medical biochemistry: with clinical cases. Academic Press, 2011.
19. Crichton RR. Biological inorganic chemistry: a new introduction to molecular structure and function. Elsevier, 2012.
20. Sandstead HH. Zinc deficiency: a public health problem? Am J Dis Child 1991; 145 (8): 853–9.
21. Czajkowska B, Naskalski JW, Sznajd J. Ribonuclease from cytosolic fraction of human erythrocytes. Clin Chim Acta 1986; 154 (1): 19–27.
22. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2018; 68 (6): 394–424.
23. Ying M, Zhao R, Jiang D, et al. Lifestyle interventions to alleviate side effects on prostate cancer patients receiving androgen deprivation therapy: a meta-analysis. Jpn J Clin Oncol 2018; 48 (9): 827–34.
24. Arancio W, Belmonte B, Castiglia M, et al. Tissue Versus Liquid Biopsy: Opposite or Complementary? In: Liquid Biopsy in Cancer Patients. Springer, 2017: 41–9.
25. Ghosh RK, Pandey T, Dey P. Liquid biopsy: a new avenue in pathology. Cytopathology 2019; 30 (2): 138–43.

Адреса для листування:
Шляховенко В.О.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: doctorvlad38@gmail.com

Одержано: 28.09.2021