ЦИТОХРОМ Р450, МЕТАБОЛІТИ ЕСТРОГЕНІВ ТА СУПЕРОКСИДНІ РАДИКАЛИ В ІНІЦІАЦІЇ ТА ПРОГРЕСУВАННІ РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ
Бурлака А.П.1, Мотузюк І.М.2, Сидорчук О.І.2, Вірко С.В.3
- 1Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
- 2Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України
- 3Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України, Київ, Україна
Мета: дослідити вміст цитохрому Р450 та його ізоформ CYP 1A2, CYP 1В1 у пухлинній тканині (ПТ) та мамарній жировій тканині (МЖТ) хворих на рак молочної залози (РМЗ). Об’єкт і методи: в дослідження залучено 28 хворих на РМЗ ІІ стадії (T3N0M0) тричі негативного молекулярного підтипу. У 15 пацієнток відзначали нормальну масу тіла (ІМТ <25 кг/м2), 13 — надмірну (ІМТ ≥25 кг/м2). Досліджено 28 зразків ПТ, 25 зразків МЖТ, відібраної на відстані 3 см від пухлинного вузла, та 27 — МЖТ, яка контактує з пухлиною. Рівні окисненого, низько- та високоспінового цитохрому Р450 та ізоформи CYP 1А2, CYP 1В1 досліджували методом електронного парамагнітного резонансу, спектрофотометрично. Результати: встановлено, що рівні цитохрому Р450 CYP 1А2 у ПТ та МЖТ, що контактує з пухлиною, нижчі, ніж відповідні рівні Р450 CYP 1B1 незалежно від ІМТ пацієнток. У МЖТ, яка вилучена на відстані 3 см від пухлини, співвідношення рівнів досліджених ізоформ Р450 було зворотним. На відстані 3 см від пухлинного вузла рівень семихінонів становив 0,48 ± 0,02 відн. од., а в МЖТ, яка контактує з пухлинним вузлом, цей показник зріс до 0,89 ± 0,05 відн. од. (р < 0,05). ПТ характеризується найвищими рівнями вільнорадикальних метаболітів естрогену (2,23 ± 0,09 відн. од). Хінони та їхні аніон-радикали — семихінони — представляють клас токсичних інтермедіатів естрогенів, що можуть індукувати ряд негативних проявів. Механізм токсичного ефекту хінонів є складним. Очевидно, основними процесами є пряме окиснення SH-груп у FeS-білках мітохондрій та продукування супероксидних радикалів. Висновки: у хворих на РМЗ виявлено посилення окисного метаболізму естрогенів за рахунок зростання рівнів CYP 1B1 та зниження активності CYP 1А2 у клітинах ПТ та МЖТ, яка контактує із пухлиною. Нерегульоване зростання рівнів метаболітів естрогену викликає перепрограмування метаболізму мітохондрій клітин МЖТ, посилення генерування супероксидних радикалів, клітинну гіпоксію та нестабільність функціонування геному. Регулювання активності цитохрому Р450 є критично важливим механізмом у гомеостазі естрогену при профілактиці РМЗ та моніторингу пухлинного процесу.
DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-22-1-2020-g.8582
Рак молочної залози (РМЗ) є одним із найпоширеніших злоякісних новоутворень у жінок [1]. Із підвищеним ризиком розвитку РМЗ асоціюється тривалий вплив статевих гормонів — естрогенів (Е). Результати епідеміологічних та клінічних досліджень свідчать, що фактори, які спричиняють підвищення рівня Е протягом життя жінки (ранній початок менструації, пізня менопауза, застосування оральних контрацептивів, пізня перша вагітність, використання замісної гормональної терапії) пов’язані зі зростанням ризику РМЗ [2]. Зв’язування Е з відповідними рецепторами (ER) слугує фактором транскрипції та призводить до зміни експресії генів-мішеней, які беруть участь у процесах проліферації клітин молочної залози [3]. Сигнальний шлях, опосередкований ER, може мати важливу роль у розвитку патологічного процесу, однак не має вирішальної ролі в ініціації раку [4]. Останні дані свідчать, що порівняно з ER-опосередкованими процесами, значну роль в ініціації РМЗ відіграє окисний метаболізм Е [5, 6]. Специфічні метаболіти Е, переважно катехол-естрогени-3,4-хінони (CE-3,4-Q), набувають здатності ініціювати пухлинний процес шляхом зв’язування з ДНК та утворення апуринових ділянок, які можуть генерувати відповідні мутації [7]. Крім того, циклічний окисно-відновний метаболізм хінонів та семихінонів призводить до утворення реактивних форм кисню (РФК). Нерегульовані рівні РФК не лише проявляють генотоксичність, збільшуючи нестабільність функціонування геному, але також стимулюють прогресування пухлин молочної залози за рахунок трансдукції окисно-відновних сигнальних шляхів [8].
Метаболізм Е та елімінація їх метаболітів відбуваються двома шляхами. Перший полягає у перетворенні Е у проміжні продукти CE-3,4-Q за допомогою ферментів надродини монооксигеназ — цитохром P450 (CYP). До основних ферментів Р450, які беруть участь у цьому перетворенні, належать ізоформи CYP 1A1 та CYP 1B1. Другий шлях — це інактивація та детоксикація хінону, O-метилювання за участю ферменту катехол-О-метилтрансферази (СОМТ).
Мета роботи — дослідити вміст цитохрому Р450 та його ізоформ CYP 1A2, CYP 1В1 у пухлинній тканині та мамарній жировій тканині (МЖТ) у хворих на РМЗ.
ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
У дослідження залучено 28 хворих на РМЗ ІІ стадії (T3N0M0), які проходили лікування в Національному інституті раку. За гормонорецепторним статусом усі пацієнтки мали тричі негативний молекулярний підтип РМЗ (ТНРМЗ). За ступенем диференціювання пухлинної тканини (ПТ) вони розподілялися наступним чином: ступінь І — 8, ІІ — 12, ІІ — 8 пацієнток. Середній вік хворих становив 58,2 ± 7,4 року. За розрахованим показником індексу маси тіла (ІМТ) 15 хворих мали нормальну (ІМТ < 25 кг/м2), 13 — надмірну масу тіла (ІМТ ≥ 25 кг/м2). Усі пацієнтки надали письмову інформовану згоду на участь у дослідженні.
Рівні цитохрому та його ізоформ CYP 1A2, CYP 1В1 визначали у 28 зразках ПТ; 27 зразках МЖТ, яка контактує з пухлиною, та 25 зразках МЖТ, відібраної на відстані 3 см від пухлинного вузла. Рівні окисненого, низькоспінового та високоспінового цитохрому Р450 та ізоформ CYP 1А2, CYP 1В1 визначали методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) та спектрофотометрично. Зразки ПТ та МЖТ гомогенізували у скляному гомогенізаторі, отримували цільні клітинні екстракти. UV-Vis-спектри поглинання CYP 1A2, CYP 1В1 в гомогенатах тканин реєстрували із розрахунку 50 мг/мл білка у 0,1 М фосфатного буферу (pH 7,0) на спектрофотометрі СФ-46. Для визначення рівнів окисненої та низькоспінової форм цитохрому Р450 із тканин (1 г) готували зразки у спеціальній пресформі. Спектри ЕПР отримували за температури рідкого азоту (–196 °С) на комп’ютеризованому радіоспектрометрі ЕПР РЕ-1307 з резонатором H011. Потужність НВЧ-джерела становила 40 мВт, частота модуляції — 100 кГц, амплітуд — 10 Гаус, постійна часу приймача τ = 0,3 с. Як стандарт інтенсивності використовували спеціально орієнтований зразок монокристалу Al2O3 з визначеною концентрацією іонів Cr3+. Методом подвійного інтегрування оцінювали концентрацію молекул, зіставляючи інтенсивність сигналів у спектрах ЕПР з інтенсивністю стандарту. Помилка методу інтегрування спектрів та розкид відтворення спектрів одного зразка становить не більше 2%. Електрофорез та ідентифікацію білків проводили відповідно до стандартних протоколів з антитілами проти CYP 1А2 і CYP 1B1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA). Рівні 8-oxoGu у сечі хворих визначали за методикою, описаною раніше [9].
Наявність ожиріння визначали шляхом підрахунку та інтерпретації ІМТ у кг/м2: ІМТ < 25 — нормальна маса тіла; ІМТ ≥ 25,0 — надмірна маса тіла (передожиріння та ожиріння).
Дані представлено у вигляді середніх значень зі стандартним відхиленням (М ± SE). Статистичний аналіз проводили із застосуванням статистичного пакета R. Різницю між показниками вважали достовірною при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Нами отримано спектри поглинання цитохрому Р450 у вільному стані та при взаємодії з андростендіоном при метаболічній активації. Показано, що при зв’язуванні цитохрому з гормоном андростендіоном реєструвався зсув максимуму поглинання з 418 нм на 391 нм та змінювалася форма спектра поглинання. На рис. 1В наведено спектральні характеристики ізоформ цитохрому Р450 CYP 1А2 і CYP 1B1 у вільному стані та при зв’язуванні його активного центру з андростендіоном у концентрації 3,0 нг/мл. На рис 1Г наведено спектр поглинання цитохрому Р450 (CYP1B1) у гомогенаті ПТ РМЗ. Як видно, у ПТ каталітичний центр цієї ізоформи Р450 є зв’язаним.
Результати досліджень рівнів CYP 1А2 і CYP 1B1 у тканинах хворих на ТНРМЗ наведені на рис. 2. У ПТ хворих із нормальною масою тіла виявлено низькі рівні (0,12 ± 0,03 відн. од.) CYP 1А2; у пацієнток із ≥25 кг/м2 вміст CYP 1А2 був ще нижчим порівняно з аналогічним показником хворих без ожиріння.
Вміст CYP 1А2 у МЖТ залежав від локалізації останньої щодо ПТ: у тканині, яка контактує з пухлиною, рівень цієї ізоформи становив 0,09 ± 0,02 відн. од., на відстані 3 см від пухлини — був статистично достовірно більшим (0,35 ± 0,05 відн. од, р < 0,05). Відзначено, що незалежно від маси тіла пацієнток ПТ та МЖТ, що контактує з пухлиною, характеризуються нижчими рівнями CYP 1А2 порівняно із СYP 1В1. У ПТ хворих без ожиріння рівень СYP 1В1 становив 0,23 ± 0,03 відн. од., у хворих з надмірною масою тіла був дещо вищим 0,29 ± 0,02 відн. од. (р < 0,05 порівняно з рівнем CYP 1А2 в аналогічних підгрупах пацієнток). Як видно, наявність надмірної маси тіла спричиняє додаткове зростання показника СYP 1В1. Відзначали тенденцію до підвищення рівня СYP 1В1 у зразках МЖТ, яка контактує з пухлиною, порівняно з аналогічними показниками у МЖТ, вилученій на відстані 3 см від пухлини (0,33 ± 0,04 відн. одн. проти 0,21 ± 0,06 відн. од.). Зазначимо, що естрон (Е1) та 17β-естрадіол (Е2) метаболізуються двома шляхами: E1 перетворюється у 2-гідроксиестрол (2-OH-E1) за допомогою CYP1A1/2, а окиснення E2 до гідроксиметаболітів каталізується головним чином CYP 1B1. При цьому CYP 1B1 у здоровій тканині молочної залози експресується у дуже низьких рівнях, а наявність надмірної маси вісцеральної жирової тканини у хворих на РМЗ викликає зростання його активності [9, 10]. Зростання рівня білка CYP 1B1 у матеріалах пухлин хворих з надмірною масою тіла було підтверджено і при аналізі показників, отриманих з використанням методу Вестерн-блот.
Дослідження вмісту вільнорадикальних метаболітів естрогенів (семихінонів) у ПТ та МЖТ показало, що найнижчі рівні цих метаболітів характерні для МЖТ, вилученої на відстані 3 см від пухлинного вузла, — 0,48 ± 0,02 відн. од (рис. 3).
У МЖТ, яка контактує з пухлинним вузлом, цей показник був значно більшим (р < 0,05) і становив 0,89 ± 0,05 відн. од. ПТ характеризувалася найвищим вмістом вільнорадикальних метаболітів Е (2,23 ± 0,09 відн. од., р < 0,05 порівняно з показниками МЖТ). Хінони та їх аніон-радикали семихінони представляють клас токсичних інтермедіатів Е, що можуть індукувати ряд негативних проявів. Механізми, за допомогою яких хінони проявляють токсичний ефект, є доволі складними, але два основні процеси, які, очевидно, є центральними, — це пряме окиснення SH-груп у FeS-білках мітохондрій та продукування супероксидних радикалів (СР). Наявність надмірної маси вісцеральної жирової тканини спричиняє посилення утворення генотоксичних метаболітів. Отримані нами результати свідчать про те, що рівень семихінонів у жінок із пухлинами молочної залози вищий, ніж у здорових жінок, що може бути хорошим прогностичним показником контролю перебігу захворювання.
Враховуючи, що накопичення у тканині молочної залози значних рівнів метаболітів Е, які здатні пошкоджувати ДНК самостійно й опосередковано через індукцію генерування СР, та активності CYP 1B1, який теж продукує СР, ми дослідили інтегральний рівень пошкодження ДНК на основі аналізу вмісту в сечі 8-oxoGu. Результати цих досліджень представлені на рис. 4.
Виявлено, що у сечі хворих з нормальною масою тіла рівень молекулярного маркера окисного пошкодження ДНК у 3,3 раза перевищував показники здорових жінок. Наявність ожиріння супроводжувалася зростанням рівня точкових мутацій у геномі хворих: вміст 8-oxoGu становив 1,24 ± 0,21 нМоль/кг маси тіла на добу порівняно із показниками пацієнток без надмірної маси тіла (0,83±0,12 нМоль/кг/добу). Тобто ожиріння спричиняє зростання нестабільності функціонування геному.
Дані щодо стану електронтранспортного ланцюга (ЕТЛ) мітохондрій у клітинах пухлин молочної залози та в МЖТ представлені на рис. 5. В умовах активації редокс-циклу відновлення CE-Q до семихінону та хінону (яке каталізується CYP 1В1) супроводжується утворенням СР шляхом зростання рівня NOFeS-білків у дихальному ланцюгу, ці процеси посилюють проліферацію клітин та прогресування пухлини. Таким чином, метаболіти естрогену викликають метаболічне перепрограмування мітохондрій клітин МЖТ, генерування СР, клітинну гіпоксію та нестабільність геному шляхом зростання рівнів 8-оксогуанозину, фосфорилювання кіназ для активації редокс-чутливих факторів транскрипції [12–14].
У таблиці представлені дані залежності активності цитохрому Р450 CYP 1B1 від ступеня диференціювання пухлин. За активністю цитохрому Р450 CYP 1B1 хворих розподілили на дві групи — з низьким (0,12 ± 0,05 відн. од.) та високим (0,36 ± 0,02 відн. од.) вмістом. Відзначено, що незалежно від ступеня диференціювання клітин РМЗ у більшості хворих реєстрували підвищені рівні цього білка.
Рівень Р450 CYP 1B1 | Ступінь диференціювання пухлини | ||
---|---|---|---|
І (n=8) | II (n=12) | ІІІ (n=8) | |
Низький | 2 | 2 | 1 |
Високий | 6 | 10 | 7 |
Як підсумок аналізу результатів проведеного дослідження наводимо схему (рис. 6) переключення метаболізму Е через ізоформи цитохрому Р450 CYP 1A1/2 на CYP 1B1 з відповідними наслідками виявлених метаболічних змін.
Спостереження жінок із високим рівнем метаболітів Е (E1(E2)‑2,3‑Q і E1(E2)‑3,4‑Q), що є ризиком розвитку РМЗ, свідчить, що описані особливості метаболізму є, вірогідно, етіологічним чинником захворювання, а не його наслідком. Оскільки CYP 1B1 є ключовим ферментом зростання рівня 4‑OHE1(E2), його активація та генетичні зміни CYP 1B1 можуть впливати на прогресування РМЗ за рахунок підвищення концентрації 4‑OHE1(E2). Відомо понад 300 змін в амінокислотному складі CYP 1B1 [15], серед найпоширеніших — Arg48Gly, Ala119Ser, Val432Leu та Asn453Ser, які призводять до змін у метаболізмі естрогенів та у ступені ризику розвитку РМЗ [16]. Дослідження in vitro показали, що варіант Val432Leu підвищує каталітичну здатність CYP 1B1 та спричиняє зростання рівня 4-OHE1 (E2) [17]. Asn453Ser викликає зниження рівня клітинного білка CYP 1B1, що пов’язують зі зниженим ризиком РМЗ у жінок у постменопаузальний період [18]. Однак вплив поліморфізму CYP 1B1 на етіологію РМЗ залишається суперечливим.
ВИСНОВКИ
1. У хворих на РМЗ виявлено посилення окисного метаболізму Е за рахунок зростання рівнів CYP 1B1 та зниження активності CYP 1А2 у клітинах пухлин та МЖТ, яка контактує пухлиною.
2. Нерегульоване зростання рівнів метаболітів Е викликає перепрограмування метаболізму мітохондрій клітин МЖТ, посилення генерування СР, клітинну гіпоксію та нестабільність функціонування геному.
3. Регулювання активності цитохрому Р450 є критично важливим механізмом у гомеостазі Е для профілактики РМЗ та моніторингу пухлинного процесу.
Робота виконана за підтримки цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України 2017–2021 рр. «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» (№ держреєстрації 0117U002034).
CПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
- DeSantis CE, Ma J, Gaudet MM, et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer J Clin 2019; 69 (6): 438–51.
- Horn J, Vatten L. Reproductive and hormonal risk factors of breast cancer: a historical perspective. Int J Women’s Health 2017; 2017 (9): 265–72.
- Kirsh V, Kreiger N. Estrogen and estrogen-progestin replacement therapy and risk of postmenopausal breast cancer in Canada. Cancer Causes and Control 2002; 13 (6): 583–90.
- Yue W, Wang JP, Li Y, et al. Effects of estrogen on breast cancer development: Role of estrogen receptor independent mechanisms. Int J Cancer 2010; 127 (8): 1748–57.
- Wang C, Bai F, Zhang L, et al. Estrogen promotes estrogen receptor negative BRCA1-deficient tumor initiation and progression. Breast Cancer Res 2018; 20 (1): 70–4.
- Park SA. Catechol estrogen 4-hydroxyestradiol is an ultimate carcinogen in breast cancer. Biomed Sci Lett 2018; 24 (3): 143–9.
- Cavalieri EL, Rogan EG. Depurinating estrogen-DNA adducts, generators of cancer initiation: their minimization leads to cancer prevention. Clin Transl Med 2016; 5 (1): 5–12.
- Sung NJ, Park SA. Effect of natural compounds on catechol estrogen-induced carcinogenesis. Biomed Sci Lett 2019; 25 (1): 1–6.
- Burlaka A, Rudiuk T, Burlaka A, Kolesnik O. 8-hydroxy-deoxyguanosine as an independent prognostic factor in patients with metastatic colorectal cancer. Arch Balk Med Union 2019; 54 (3): 445–54.
- Lee AJ, Cai MX, Thomas PE, et al. Characterization of the oxidative metabolites of 17β-estradiol and estrone formed by 15 selectively expressed human cytochrome P450 isoforms. Endocrinology 2003; 144 (8): 3382–98.
- Burlaka AP, Motuzyuk IM, Sydorchuk OI, Virko SV. Activity and functional characteristics of cytochrome P450 in tumors and breast adipose tissue of patients with breast cancer. Oncology 2019; 21 (4): 299–303.
- Burlaka AP, Ganusevich II, Vovk AV, et al. Redox state of adipose tissue for patients with gastric cancer and its connection with the body mass index and distance from the tumor. Obesity Research & Clinical Practice 2020; 14 (1): 34–8.
- Koundouros N, Poulogiannis G. Phosphoinositide 3-kinase/akt signaling and redox metabolism in cancer. Front Oncol 2018; 8: 160.
- Jeong SY, Im SY. Estrogen induces CK2α activation via generation of reactive oxygen species, Biomed Sci Lett 2019; 25 (1): 23–31.
- Zimarina TS, Kristensen VN, Imyanitov EN, Berstein LM. Polymorphisms of CYP1B1 and COMT in breast and endometrial cancer. Molecular Biology 2004; 38 (3): 322–8.
- Hanna IH, Dawling S, Roodi N, et al. Cytochrome P450 1B1 (CYP1B1) pharmacogenetics: association of polymorphisms with functional differences in estrogen hydroxylation activity. Cancer Res 2000; 60 (13): 3440–4.
- Hussain T, Alrokayan S, Upasna U, et al. Meta-analysis of genetic polymorphisms in xenobiotic metabolizing enzymes and their association with breast cancer risk. J Genetics 2018; 97 (2):, 523–37.
- Androutsopoulos VP, Spyrou I, Ploumidis A, et al. Expression profile of CYP1A1 and CYP1B1 enzymes in colon and bladder tumors. PLoS ONE 2013; 8 (12): e82487.
Адреса для листування:
Бурлака А.П.
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології iм. Р.Є. Кавецького НАН України
вул. Васильківська, 45
Київ, 03022
E-mail: apburlaka@gmail.com
Одержано: 12.03.2020
Без коментарів » Додати коментар