ПОКАЗНИКИ РЕДОКС-СТАНУ МАМАРНОЇ ЖИРОВОЇ ТКАНИНИ — ВАЖЛИВИЙ ФАКТОР ПУХЛИННОГО МІКРООТОЧЕННЯ У ХВОРИХ НА РАК МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-2-2019-g.7181

Мамарна жирова тканина (МЖТ) — це неоднорідна популяція клітин, яка представлена адипоцитами, ендотеліальними клітинами, макрофагами, перицитами і попередниками адипоцитів [1]. МЖТ розглядають не тільки як енергетичне депо і «матеріальний субстрат» при ожирінні, але і як самостійний орган, в якому за певних умов виникають та накопичуються вільнорадикальні продукти окисної природи, що створює умови для окисного пошкодження макромолекул. Така «активна» функція жирової тканини (ЖТ) може впливати на перебіг патологічного процесу в онкологічних хворих, зокрема у хворих на рак молочної залози (РМЗ) [2, 3]. Рівні супероксидних радикалів (СР), оксиду азоту (NO), активність цито­хрому Р450 — фактори, які відіграють важливу роль в формуванні пухлинного мікрооточення. Зокрема, цитохром Р450 — фермент, що потенціює метаболізм хімічних канцерогенів, каталізує утворення канцерогенних та генотоксичних дериватів естрогенів (4-гідроксіестрадіолу, 4-гідроксіестролу), хінонів та убісеміхінонів, які також можуть пошкоджувати ДНК і брати участь у забезпеченні важливих для росту пухлини стромально-епітеліальних зв’язків [4, 5]. Але на сьогодні отримано ще недостатньо даних щодо властивостей МЖТ, яка є важливим компонентом молочної залози (МЗ), у пацієнток з РМЗ.

Мета: дослідження рівнів показників редокс-стану в МЖТ хворих на тричі негативний (ТН) РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідженні використано зразки пухлинної тканини та прилеглої до пухлини МЖТ (1 см), отримані під час операції у 39 хворих на ТН РМЗ ІІ–ІІІ стадії з нормоглікемією (n = 23) та з цукровим діабетом 2-го типу (n = 16). Усі пацієнтки проходили лікування на базі Національного інституту раку в 2016–2018 рр. та дали інформовану згоду на включення у дослідження і використання їх біологічних матеріалів у дослідницьких цілях.

Індекс маси тіла (ІМТ) розраховували за формулою [6]:

I = m/h² (кг/м²), де:

m — маса тіла в кілограмах;

h — зріст у метрах.

Інтерпретацію показників ІМТ хворих на РМЗ щодо наявності ожиріння проводили відповідно до стандартних рекомендацій ВООЗ (таблиця).

Усі пацієнтки мали зайву масу тіла (передожиріння), ІМТ становив 25,0–30,0 кг/м². Об’єм ЖТ у МЗ визначали методом комп’ютерної та магнітно-резонансної томографії. Частка ЖТ від загального об’єму МЗ коливалася від 7 до 56%, медіана показника становила 21%. Стосовно медіани хворих було розподілено на 2 групи: об’єм МЖТ < 21% і > 21%.

Зразки пухлинної тканини та прилеглої до неї (1 см) МЖТ масою 2 г відбирали під час операції. Для визначення сумарної активності форм цитохрому Р450 із ЖТ (0,5 г) готували зразки за допомогою спеціальної прес-форми за умов низькотемпературної стабілізації. Спектри електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) реєстрували при температурі рідкого азоту (–196 °С) у парамагнітно чистому кварцовому д’юарі на комп’ютеризованому спектрометрі РЕ-1307 з резонатором H₀₁₁. Потужність надвисокочастотного джерела становила 40 мВт, частота модуляції 100 кГц, амплітуда 10 Гаус, постійна часу приймача τ = 0,3 с. В якості стандарту інтенсивності використовували спеціально орієнтований зразок монокристалу Al₂O₃ із визначеною концентрацією іонів Cr³⁺. Методом подвійного інтегрування оцінювали концентрацію молекул, зіставляючи інтенсивність сигналів у спектрах ЕПР з інтенсивністю стандарту. Помилка методу інтегрування спектрів та розкид відтворення спектрів одного зразка становила не більше 3%. Рівень інтенсивності сигналу ЕПР при g = 2,25 відповідав рівню активності цитохрому Р450 у відносних одиницях (CYP 1А2) [7]. Рівень швидкості генерування СР досліджували методом ЕПР з використанням спінового уловлювача ТЕМРОNE-H (2,2,6,6,-tetrametyl-4-oxypiperidine) за кімнатної температури, рівень NO визначали методом ЕПР у низькотемпературному режимі стабілізації зразків (–196 °С) з використанням діетилдитіокарбамату (ДЕТК) (Sigma, USA) [8]. Рівень 8-гідрокси-дезоксигуанозину (8-охоdGu) в МЖТ досліджували спектрофотометричним методом [9].

Адипонектинпозитивні клітини (АПН+) виявляли за допомогою імуногістохімічного методу на парафінових зрізах МЖТ з використанням специфічних поліклональних антитіл кроля (Invitrogen™ Adiponectin Antibody, TermoScientific, США) у розведенні 1:500. Зрізи депарафінували ксилолом (20 хв) та спиртом (20 хв), витримували в цитратному буфері (рН = 6,0) протягом 15 хв, після чого 5–7 хв охолоджували. Кожен зріз обробляли пероксидом водню, витримували 3 хв, відмивали дистильованою водою та тричі занурювали скельця у фосфатний буфер (PBS, 2–3 хв). На зрізи наносили 1% розчин сироваткового альбуміну бика (BSA), через 20 хв проводили інкубацію препаратів з відповідними поліклональними антитілами в оптимальному розведенні (1:500) протягом 1 год та тричі відмивали у фосфатному буфері. Вміст адипонектину визначали за допомогою тест-системи PolyVue HRP/DAB Detection System (Diagnostic BioSystems, Каліфорнія, США). Для візуалізації активності пероксидази використовували діамінобензидин тетрагідрохлорид (DAB) (DakoCytomation, Данія) та забарвлювали зрізи гематоксиліном Майера. За допомогою світлового мікроскопа обчислювали кількість АПН+-клітин (на 1000 клітин на кожному зрізі при збільшенні × 400) і виражали їх кількість у відсотках.

Статистичний аналіз проводили із застосуванням прикладних ліцензійних програм GraphPadPrism 6 та Origin 7. Дані представлено у вигляді середніх значень зі стандартним відхиленням (М ± SE). Різницю між показниками вважали достовірною при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ЖТ хворих онкологічного профілю з надмірною масою тіла зазнає значних морфологічних та метаболічних змін, зокрема, адипоцити набувають фібробластоподібного фенотипу, в них зростає кількість мітохондрій [3]. Рівень експресії адипонектину в групах хворих на ТН РМЗ, у яких об’єм МЖТ в МЗ не перевищував 21%, становив 11,7 ± 2,5% (пацієнтки з нормоглікемією), токсичність гіперглікемії виражалася зниженням рівня адипонектину до значень 5,8 ± 2,3% (рис. 1). У групі хворих з об’ємом МЖТ > 21% рівень експресії адипонектину знижувався і сягав 6,8 ± 1,4% (пацієнтки з нормогліке­мією) та 2,45 ± 0,9% (пацієнтки з цукровим діабетом 2-го типу).

Рис. 1. Рівні експресії адипонектину в прилеглій до пухлини МЖТ залежно від її об’єму в МЗ: 1 — хворі на РМЗ з нормоглікемією; 2 — хворі на РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу

Крім зазначених вище змін, у хворих на ТН РМЗ з об’ємом МЖТ < 21% рівень швидкості генерування СР становив 0,75 ± 0,07нМ/г тканини·хв, при об’ємі МЖТ > 21% цей показник зростав до значень 1,03 ± 0,15 нМ/г тканини·хв (рис. 2). У хворих з порушенням вуглеводного обміну відмічали незначне підвищення рівня швидкості генерування СР: показники становили 0,77 ± 0,06 та 1,13 ± 0,16 нМ/г тканини·хв (об’єм МЖТ < 21% та > 21% відповідно). У цьому аспекті є дані, що нерегульований надлишок глюкози та її метаболітів в організмі пошкоджує комплекс І мітохондрій у клітинах органів, що призводить до зростання рівнів СР в них, посилюючи окисні пошкодження [10].

Рис. 2. Рівні швидкості генерування СР у прилеглій до пухлини МЖТ залежно від її об’єму в МЗ: 1 — хворі на РМЗ з нормоглікемією; 2 — хворі на РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу

Як видно з рис. 3, у хворих з нормогліке­мією при об’ємі МЖТ < 21% вміст NO визначається на рівні 0,63 ± 0,08 нМ/г тканини, а при об’ємі > 21% — 0,45 ± 0,06 нМ/г тканини. У хворих на РМЗ з гіперглікемією рівні NO становили 0,59 ± 0,13 та 0,44 ± 0,10 нМ/г тканини відповідно.

Рис. 3. Вміст NO в прилеглій до пухлини МЖТ залежно від її об’єму в МЗ: 1 — хворі на РМЗ з нормоглікемією; 2 — хворі на РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу

Зростання швидкості генерування СР в ЖТ та порушення біодоступності NO можуть бути пояснені даними про те, що редуктивний стрес в ЖТ, імовірно, викликаний нерегульованою «прокачкою» NADH через комплекс I електронтранспортного ланцюга мітохондрій. Ці зміни спричинюють виток електронів та зростання рівнів СР і радикальних форм кисню (РФК), які можуть пошкоджувати NO-синтази, що є загальним шляхом складної дисрегуляції клітинного метаболізму та гомеостазу клітин ЖТ [11]. Також потрібно враховувати, що в організмі існують складні зв’язки між NO, РФК та білками-регуляторами їх рівнів у клітинах, що також може порушувати біодоступність NO.

У прилеглій до пухлини МЖТ об’ємом > 21% активність цитохрому Р450 CYP 1А2 зростала майже вдвічі (0,28 ± 0,05 відн. од.) порівняно з показником у хворих, у яких об’єм МЖТ становив < 21% (0,15 ± 0,03 відн. од.) (рис. 4). Є дані, які свідчать, що зростання активності цитохрому Р450 CYP 1А2 може залежати від стероїдної функції МЖТ. У хворих на РМЗ з порушенням метаболізму глюкози цей показник зростав до значень 0,39 ± 0,07 відн. од. (об’єм МЖТ > 21%) та до 0,18 ± 0,06 відн. од. при меншому об’ємі МЖТ. Цитохром P450 каталізує окиснювальний метаболізм естрону та естрадіолу в редокс-циклі ферменту переважно до 2-гідроксикатехолу (цито­хром P450 1A2) або до 4-гідроксикатехолу (цитохром Р450 1В1). Цитохром P450 1B1 конститутивно присутній у МЗ, яєчниках, наднирковій залозі та матці. 3,4-хінон може спричинювати мутації шляхом утворення нестабільних аддуктів з аденіном у ДНК та запускати редокс-цикл утворення СР [4].

Рис. 4. Активність цитохрому Р450 1В1 у прилеглій до пухлини МЖТ залежно від її об’єму в МЗ: 1 — хворі на РМЗ з нормоглікемією; 2 — хворі на РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу

Враховуючи дані про те, що окисні пошкодження ДНК підвищують ризик виникнення РМЗ [12], ми дослідили рівні маркера окисних пошкоджень гуаніну ДНК — 8-oxodGu, а також вплив на цей показник об’єму МЖТ та порушення метаболізму вуглеводів (рис. 5). У МЖТ хворих на ТН РМЗ з нормоглікемією вміст 8-oxodGu визначався на рівні 1,51 ± 0,19 та 2,09 ± 0,23 нМ/г тканини (об’єм МЖТ < 21% та > 21% відповідно). У хворих на РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу спостерігали зростання рівнів маркера окисного пошкодження ДНК відповідно до 1,63 ± 0,22 та 2,29 ± 0,31 нМ/г тканини.

Рис. 5. Рівні 8-охоdGu у прилеглій до пухлини МЖТ залежно від її об’єму в МЗ: 1 — хворі на РМЗ із нормоглікемією; 2 — хворі на РМЗ з цукровим діабетом 2-го типу

Зростаюча поширеність цукрового діабету 2-го типу у хворих онкологічного профілю вимагає нових додаткових профілактичних та терапевтичних стратегій з урахуванням того, що окисний стрес відіграє важливу роль у розвитку та прогресуванні цього захворювання.

Крім функції зберігання та регулювання енергії, в ЖТ є метаболічна функція комунікацій з віддаленими органами, включаючи центральну нервову систему. Адипоцити синтезують і виділяють гормони, такі як лептин та адипонектин. Адипокіни, включно із лептином, фактором некрозу пухлини-α (TNF-α), інтерлейкіном-6 (IL-6), фактором росту гепатоцитів (HGFs), циркулюють у плазмі крові в концентраціях, які позитивно співвідносяться з ІМТ, за винятком адипонектину, який обернено корелює з ІМТ [13–16].

Дослідження взаємодії пухлини та ЖТ показали, що адипоцити можуть безпосередньо впливати на ріст та прогресію злоякісних новоутворень. Метаболічні та запальні зміни в МЖТ, зазвичай пов’язані із збільшенням генерування СР, можуть спричиняти пошкодження ліпідів, білків, нуклеїнових кислот, генетичну нестабільність, прогресування пухлини та метастазування при активації шляху P13K/Akt [17–20].

Підвищені рівні СР у МЖТ при ожирінні визнаються як важливий патогенетичний механізм інсулінорезистентності та метаболічного синдрому, а зміни енергетичного балансу зумовлюють зростання рівнів РФК. Є дані, які свідчать про те, що підвищення рівнів СР у МЖТ спричиняє зростання частки окисно-індукованих мутацій (8-oxodGu) у генах, активація яких посилює ризик розвитку РМЗ у пост­менопаузі [12]. Виявлено, що при РМЗ зростання рівнів мутацій гена P53 має окисну природу, а підвищення рівнів 8-oxodGu між кодонами 163 та 175 корелює зі стадією та гістологічною будовою пухлин. Слід зауважити, що окисний стрес, з одного боку, відіграє вирішальну роль при лікуванні раку, оскільки хіміо- і променева терапія сприяють посиленню генерування СР та РФК, що є основним інструментом загибелі пухлинних клітин. З іншого боку, СР, генеровані ендогенними (метаболічні зрушення — дисфункція мітохондрій, нерегульована активація цитохрому Р450 та імунна відповідь) і екзогенними (хіміопроменева терапія) джерелами, спричинюють зміни в метаболічних шляхах клітин пухлин та МЖТ, судинній мережі та посилюють інфільтрацію макрофагами пухлинного мікрооточення [2, 5, 14]. Ці зміни можуть впливати як на прогресування пухлини, так і на адаптацію пухлинних клітин до окиснення, що потенційно призводить до підвищення стійкості до терапії, неоангіо­генезу, збільшення ризиків метастазування та формування агресивного фенотипу пухлини.

ВИСНОВКИ

Результати наших досліджень свідчать про те, що зміни складу ключових посередників сигналізації, які визначають окисний фенотип МЖТ у хворих на ТН РМЗ з передожирінням, є визначальним фактором формування пропухлинного мікрооточення та умов для росту і пухлинної прогресії. Виявлено зміни в складі сигнальних молекул, які можуть бути перспективними маркерами прогнозу перебігу ТН РМЗ у пацієнток з надмірною масою тіла. У хворих на РМЗ з цукровим діабетом відмічали зниження рівня експресії адипонектину в МЖТ, зростання швидкості генерування СР, активності цитохрому Р450 та рівня окисних пошкоджень ДНК, що є несприятливими факторами перебігу РМЗ.

Робота виконана у рамках наукової програми 01170U2034 «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» за підтримки відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології Національної академії наук України.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Gregoire FM, Smas CM, Sul HS. Understanding adipocyte differentiation. Physiol Rev 1998; 78 (3): 783–809.
• 2. Matafome P, Santos-Silva D, Sena CM, et al. Common mechanisms of dysfunctional adipose tissue and obesity-related cancers. Diabetes Metab Res Rev 2013; 29 (4): 285–95.
• 3. Sethi JK, Vidal-Piug AJ. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res 2007; 48 (6): 1253–62.
• 4. Elfaki I, Mir R, Almutairi FM, et al. Cytochrome P450: polymorphisms and roles in cancer, diabetes and atherosclerosis. Asian Pac J Cancer Prev 2018; 19 (8): 2057–70.
• 5. Hong Ch-Ch, Tang B-K, Hammond GL, et al. Cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) activity and risk factors for breast cancer: a cross-sectional study. Breast Cancer Res 2004; 6 (4): 352–65.
• 6. BMI Classification. Global Database on Body Mass Index. World Health Organization 2006; 27: 2012.
• 7. Burlaka AP, Sidorik EP. Redox-dependent signal molecules in mechanisms of tumor process. Kyiv: Naukova Dumka, 2014. 255 p. (in Ukrainian).
• 8. Burlaka АP, Ganusevich ІІ, Golotiuk VV et al. Superoxide- and NO-dependent mechanisms of antitumor and antimetastatic effect of L-arginine hydrochloride and coemzyme Q10. Exp Oncol 2016; 38 (1): 31–5.
• 9. Sydoryk EP, Burlaka AP, Kovalenko NG. The content of molecular markers of a modification of guanine, 8-oxodGu and 8-oxoG, induced by oxygen radical forms under chemical carcinogenesis in mammary glands and the tumor process in gastro-intestinal tract. Reports of the NAS of Ukraine 2005; 12: 117–81 (in Ukrainian).
• 10. Robertson RP, Harmon J, Tran PO, et al. Glucose toxicity in beta-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes 2003; 52 (3): 581–7.
• 11. Kang YM, Kim F, Lee WJ. Role of NO/VASP signaling pathway against obesity-related inflammation and insulin resistance. Diabetes Metab J 2017; 41 (2): 89–95.
• 12. Seibold P, Hein R, Schmezer P, et al. Polymorphisms in oxidative stress-related genes and postmenopausal breast cancer risk. Int J Cancer 2011; 129 (6): 1467–76.
• 13. Iyengar P, Combs TP, Shah SJ, et al. Adipocyte-secreted factors synergistically promote mammary tumorigenesis through induction of anti-apoptotic transcriptional programs and proto-oncogene stabilization. Oncogene 2003; 22 (41): 6408–23.
• 14. Dirat B, Bochet L, Dabek M, et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Res 2011; 71 (7): 2455–65.
• 15. Park EJ, Lee JH, Yu GY, et al. Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumor genesis by enhancing IL-6 and TNF expression. Cell 2010; 140 (2): 197–208.
• 16. Burlaka AP, Vovk AV, Burlaka AA, et al. Metabolism of adjacent adipose tissue and body mass of the patients with stage III–IV colorectal cancer. Oncology 2018; 20 (3): 206–11 (in Ukrainian).
• 17. Hursting SD, Berger NA. Energy balance, host-related factors, and cancer progression. J Clin Oncol 2010; 28 (26): 4058–65.
• 18. Nieman KM, Kenny HA, Penicka CV, et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat Med 2011; 17 (11): 1498–503.
• 19. Burlaka AP, Ganusevich II, Vovk AV, et al. Colorectal cancer and mitochondrial gysfunctions of the adjunct adipose tissues: a case study. Biomed Res Int 2018; 2018: 2169036.
• 20. Booth A, Magnuson A, Fouts J, et al. Adipose tissue, obesity and adipokines: role in cancer promotion. Horm Mol Biol Clin Investig 2015; 21 (1): 57–74.

Адреса для листування:
Бурлака А.П.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: apburlaka@gmail.com

Одержано: 11.02.2019