АКТИВНІСТЬ І ФУНКЦІОНАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИТОХРОМУ Р450 У ПУХЛИНАХ ТА МАМАРНІЙ ЖИРОВІЙ ТКАНИНІ ХВОРИХ НА РАК МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-4-2019-g.8345

Цитохроми Р450 (CYP) є класом гемвмісних ферментів, які синтезуються в печінці, нирках, легенях, мозку, шлунково-кишковому тракті, молочних залозах (МЗ). CYP індукуються при розвитку ряду патологічних станів, зокрема раку, ожиріння і діабету II типу, що свідчить про залучення цього ферменту до низки біологічних процесів. У МЗ цитохром Р450, крім цього, відіграє важливу роль, надаючи клітинам здатність метаболізувати гормони та екологічні канцерогени [1–3]. Ризик розвитку раку молочної залози (РМЗ) може визначатися генетичними, метаболічними факторами та особливостями способу життя, які можуть впливати на метаболізм статевих гормонів. Цитохром Р450 становить оксигеназу, залучену в біо­синтез і метаболізм естрогенів у відповідь на анти­естрогенну терапію, тому визначення його ролі в етіо­патогенезі РМЗ може забезпечити важливу інформацію для розуміння механізму чутливості пухлини до лікування. Все викладене зумовлює актуальність дослідження активності цито­хрому Р450 у клітинах тканин (зокрема тканині МЗ) та його вплив на рівні супероксидних радикалів (СР), які генеруються ферментом і статевими гормонами.

Цитохроми P450 каталізують монооксигенацію широкого кола органічних молекул, включаючи стероїдний біогенез, метаболізм лікарських засобів, активацію проканцерогенів, детоксикацію ксенобіотиків і обмін жирних кислот. Перенесення електрона від окисно-­відновного партнера цитохромом P450 на субстрат є ключовим етапом у каталітичному циклі цих білків. Мітохондріальний цитохром Р450 отримує електрони від FeS-білка феродоксину, тоді як окисно-відновним партнером для мікросомального цитохрому Р450 є ФАД/ФМН-вмісна НАДФ•H-цитохром P450 оксидоредуктаза. Проблема механізму переносу електронів є одним із важливих аспектів досліджень. Суперсімейство цитохрому CYP ділиться на родини та підродини на основі амінокислотного складу. У ссавців описано 14 родин, які можуть бути функціонально поділені на ті, що беруть участь у синтезі стероїдів, жовчних кислот і ω-гідроксилювання жирних кислот, і ті, які полегшують виведення ксенобіотиків і стероїдів з організму [4–7]. Основні ізоформи цито­хрому P450 та їх характеристики у клітинах людини наведено у табл. 1.

Тому метою дослідження стало вивчення рівнів цитохрому Р450 (у окисненому, низькоспіновому станах) та його ізоформ CYP 1A2, CYP 19А1 у тканині пухлин МЗ та мамарній жировій тканині (МЖТ) хворих на РМЗ.

ОБ’ЄКТ і МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідження було залучено 58 хворих (середній вік — 48,2 ± 10,2 року) на РМЗ ІІ, ІІІ стадії (37 і 21 відповідно), які перебували на лікуванні в Національному інституті раку. У всіх випадках діагноз верифікований гістологічно. За молекулярними варіантами РМЗ у 35 хворих визначено люмінальний (А, Б), у 7 — Her2/new⁺, у 16 — тричінегативний підтипи. Усі пацієнтки дали інформовану згоду на використання їх біологічних матеріалів для проведення дослідження.

Рівні цитохрому Р450 та його ізоформ визначали у 58 зразках тканини РМЗ та МЖТ (5 см від пухлинного вузла). Тканини пухлин і МЖТ гомогенізували у скляному гомогенізаторі. Рівні окисненого та низькоспінового цитохрому Р450 та його ізоформи CYP 19А1 визначали методом електронно-­парамагнітного резонансу (ЕПР) та спектрофотометрично. UV-Vis спектри в гомогенатах тканин реєстрували із розрахунку 0,50 нмoль білка у 1 мл 0,1 М фосфатного буферу (pH 7,0). Для визначення рівнів окисненої та низькоспінової форм цитохрому Р450 із тканин (1 г) готували зразки у спеціальній прес­формі і досліджували на комп’ютеризованому радіоспектрометрі ЕПР РЕ1307 з резонатором H011. Спектри ЕПР отримували за температури рідкого азоту (–196 °С). Потужність НВЧ-джерела становила 40 мВт, частота модуляції 100 кГц та амплітуда 10 Гаус, постійна часу приймача τ = 0,3 с. Як стандарт інтенсивності використовували спеціально орієнтований зразок монокристалу Al₂O₃ з визначеною концентрацією іонів Cr3⁺. Методом подвійного інтегрування оцінювали концентрацію молекул, зіставляючи інтенсивність сигналів у спектрах ЕПР з інтенсивністю стандарту. Помилка методу інтегрування спектрів та розкид відтворення спектрів одного зразка становить не більше 2%. Імуноблотинг проводили відповідно до стандартних протоколів з антитілами проти CYP 1А2 і CYP 19А1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Наявність ожиріння у хворих визначали шляхом підрахунку та інтерпретації індексу маси тіла (ІМТ). ІМТ ≤ 16 — дефіцит маси тіла; від 16,0 до 18,5 — недостатня маса тіла; від 18,5 до 24,9 — нормальна маса тіла; від 25,0 до 30,0 — надмірна маса тіла (перед­ожиріння); від 30,0 до 35,0 — ожиріння першого ступеня; від 35 до 40 — ожиріння другого ступеня; ≥40 — ожиріння третього ступеня.

Дані представлені у вигляді середніх значень зі стандартним відхиленням (М ± SE). Статистичний аналіз проводили із застосуванням пакета R. Різницю між показниками вважали достовірною при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На рис. 1 наведені спектри поглинання високоочищеного (комерційний препарат, «Sigma») CYP 19А1 людини (50 ммоль ферменту в 1 мл фосфатного буферу з pH 7,2) та препарату з тканини РМЗ (ІІ стадія, люмінальний А підтип).

Індивідуальні коливання рівнів CYP 19А1 у тканині РМЗ були незначними: середній вміст цієї ізоформи в пухлинах ІІ стадії становив 0,36 ± 0,15 нМоль/г тканини, у пухлинах ІІІ стадії — 0,41 ± 0,05 (р > 0,05) нМоль/г тканини. Вміст CYP 19А1 у МЖТ, що контактує з пухлинною тканиною, був дещо нижчим і також характеризувався лише незначними індивідуальними коливаннями: 0,14 ± 0,04 нМоль/г тканини при РМЗ ІІ стадії проти 0,17 ± 0,06 нМоль/г тканини (р > 0,05) при РМЗ стадії ІІІ. При аналізі рівнів CYP 19А1 у тканинах РМЗ та МЖТ залежно від молекулярного підтипу пухлини також не встановлено суттєвих відмінностей, що, можливо, пов’язано з обмеженою кількістю спостережень. Цей аспект потребує подальшого дослідження.

У модельних експериментах [8] досліджені зміни у спектрах ЕПР цитохрому Р450 (CYP 19А1) при його взаємодії з андростендіоном та продемонстровано появу інтенсивних сигналів ЕПР, які можуть бути маркерами метаболічної активності ферменту. Нами досліджено вплив андростендіону на спектр ЕПР CYP 19А1 МЖТ (рис. 2). Встановлено, що при утворенні комплексу андростендіону з цито­хромом Р450 (CYP 19А1) МЖТ виявляються інтенсивні сигнали ЕПР з g-факторами 8,10 і 3,28, які можуть бути маркерами перетворення у МЖТ андрогену (андростендіону) в естроген під впливом дослідженої ізоформи Р450. Відомо, що існує три основні форми естрогену: естрон (Е1), естрадіол (Е2 або 17β-естрадіол) і естріол (Е3) [2]. Е1 утворюється у шкірі та жировій тканині (ЖТ) із андростендіону (який синтезується у надниркових залозах) і є основною формою естрогену, який функціонує у жінок у постменопаузальний період [3]. Е2 є основ­ним гормоном, який синтезується у пременопаузальний період у яєчниках, але у постменопаузальний період він залишається біологічно активним і діє шляхом зв’язування з рецептором естрогену-α і -β. Таким чином, визначені нами зміни сигналу ЕПР можуть свідчити про активну участь МЖТ у метаболізмі естрогенів і, відповідно, розвитку РМЗ, особливо у жінок у постменопаузальний період.

Дослідження активності цитохрому Р450 (CYP 19А1) (особливо його низькоспінової форми) у тканині РМЗ залежно від накопичення ЖТ у МЗ (відсутність/наявність у пацієнток передожиріння чи ожиріння) дозволило виявити високі рівні окисненої (g = 2,42) і низькоспінової (g = 2,25) форм CYP 19А1, вміст яких корелює з ІМТ — ≤ 25 та ≥ 25 кг/м² (відповідно 0,10 ± 0,02 відн. од. проти 0,18 ± 0,05 відн. од., 0,05 < p < 0,1) (рис. 3).

Також одержано попередні дані щодо зростання у тканині РМЗ і МЖТ ізоформи CYP 1А2, що корелює з підвищенням рівня СР у мітохондріях та стадією захворювання. Це може свідчити, що CYР 1А2 регулює енергетичний метаболізм клітин РМЗ та здатний посилювати клітинну гіпоксію.

Проведено аналіз активності цитохрому P450 (ізоформи СYР 19А1 і CYP 1A2) у МЖТ жінок пре- та постменопаузального віку з різною масою тіла (табл. 2). Встановлено вищі рівні обох ізоформ ферменту та підвищений ризик прогресування захворювання у пацієнток з ІМТ ≥ 25 кг/м² при більшій тривалості впливу естрогенів (≥ 27 років). Зазначимо, що наявність ожиріння та вплив естрогенів відносять до чинників ризику виникнення та перебігу РМЗ. Це дозволяє припустити, що активність цитохрому P450 (ізоформи CYP 1A2 і СYР 19А1) також може бути потенційним пре­дикторним чинником.

На рис. 4 продемонстровано каталітичний цикл цитохрому Р450, у якому реалізується спроможність клітин метаболізувати гормони та канцерогени. Ізоформа цитохрому Р450 (CYP 1A2) каталізує гідроксилювання естрогену, перетворюючи естрон (Е1) і естрадіол (Е2) у 2-гідроксиестрадіол (2-OHE1), та окиснює у 16α-положенні естрадіол і естрон.

У синтезі естрогенів бере участь ароматаза (CYP 19А1), субстратом для якої служать андрогени, а саме андростендіон, тестостерон і 16-гідрок­ситестостерон. З високою специфічністю ця ізоформа Р450 перетворює їх у відповідні естрогени: естрон, естрадіол і естріол [5, 9]. Оскільки і субстрати, і продукти цього ферменту є потужними гормонами, зміни в його діяльності мають значний вплив на естрогенний і андрогенний обмін. Більшість естрогенів у пременопаузальний період синтезується яєчниками. Переважним тканинним джерелом естрогену після менопаузи є екстраоваріальна підшкірна ЖТ. Тривалий вплив надлишку естрогену підвищує ризик розвитку РМЗ. Естроген і його метаболіти можуть викликати гіперпроліферацію і неопластичну трансформацію клітин МЗ і ендометрія за рахунок посилення проліферації та пошкодження ДНК.

Цитохром P450 — це універсальна монооксигеназа; значна частка його ізоформ CYP 1A2, CYP 2E1, CYP 19А1 у клітинах пухлин може перебувати у неактивному стані (g = 2,42), а при коекспресії донорів електронів вони переходять у низькоспіновий стан (g = 2,25). Зв’язування гормонів із цитохромом Р450 викликає зниження окисно-відновного потенціалу білка на 100 мВ, що робить сприятливими умови перенесення електрона з NADH або NADPH на гормон. Це супроводжується зміною спінового стану гемового заліза в активному центрі ферменту і конформації білка. Відомо, що естрогени виводяться з організму через етап метаболічної конверсії у неактивні метаболіти. Першим кроком у їх метаболізмі є гідроксилювання, яке каталізується цито­хромом Р450. У МЗ, яєчнику, матці при метаболізмі 2-гідроксиестрадіолу і 4-гідроксиестрадіолу у каталітичному циклі CYP 1A2 і CYP 19А1 можуть утворюватися вільно радикальні стани гормонів (убісеміхінони і хінони), здатні пошкоджувати клітини тканин та ініціювати процес канцерогенезу в МЗ. Зміни активності цитохрому Р450 можуть не лише впливати на інтенсивність дії гормонів, але також змінювати профіль їх фізіологічного ефекту в тканинах-мішенях.

ВИСНОВКИ

1. Виявлені високі рівні цитохрому Р450 у пухлинах та МЖТ хворих на РМЗ, що обґрунтовує його потенційне застосування як біомаркера при прийнятті рішень щодо персоніфікованих схем гормональної терапії.

2. Підвищення активності ізоформ Р450 (CYP 1A2 і СУР 19А1) у МЖТ може бути фактором ризику прогресування РМЗ, особливо за наявності ожиріння та із підвищенням тривалості впливу естрогенів.

Робота виконана за підтримки цільової комплекс­ної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України 2017–2021 рр. «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» (№ держреєстрації 0117U002034).

CПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Kaluka D. Spectral characterization of cytochromes P450 active site and catalytic intermediates. 2012 (http://epublications.marquette.edu/dissertations_mu/231).
• 2. Gui G, Jun SB, Jin X, et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature 2013; 494: 238–42.
• 3. Burlaka AP, Vovk AV, Motuzyuk IM, et al. The redox-state indices of breast adipose tissue is important factor of tumor microenvironment in patients with breast cancer. Oncology 2019; 21: 130–4 (in Ukrainian).
• 4. Androutsopoulos VP, Tsatsakis AM, Spandidos DA. Cytochrome 450 CYP 1A1: wider roles in cancer progression and prevention BMC Cancer 2009; 9 (1): 187–94.
• 5. Bulun SE, Simpson ER. Breast cancer and expression of aromatase in breast adipose tissue. Trends Endocrin Metab 1994; 5 (3): 113–20.
• 6. Murray GI, Patimalla S, Stewart KN, et al. Profiling the expression of cytochrome P450 in breast cancer. Histopathology 2010; 57: 202–11.
• 7. Hong ChCh, Tang BK, Hammond GL, et al. Cytochrome P450 1A2 (CYP 1A2) activity and risk factors for breast cancer: a cross-sectional study. Breast Cancer Res 2004; 6 (4): R352–R365.
• 8. Pochapsky TC, Wong N, Zhuang Y, et al. NADH reduction of nitroaromatics as a probe for residual ferric form high-spin in a cytochrome P450. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom 2018; 1866 (1): 126–133.
• 9. Zhao H, Zhou L, Shangguan AJ, Bulun SE. Aromatase expression and regulation in breast and endometrial cancer. J Mol Endocrinol 2016; 57 (1): R19–R33.

Адреса для листування:
Бурлака А.П.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології
iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: apburlaka@gmail.com

Одержано: 22.08.2019