ПРОФІЛЬ ЕКСПРЕСІЇ мікроРНК, АСОЦІЙОВАНИЙ З АГРЕСИВНІСТЮ ПЕРЕБІГУ РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ РІЗНИХ МОЛЕКУЛЯРНИХ ПІДТИПІВ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-24-2-2022-g.10453

Рак молочної залози (РМЗ) в Україні, так само, як і в більшості країн світу, посідає перше місце в структурі захворюваності і смертності від зло­якісних новоутворень серед жінок. Статистичні дані свідчать про неухильне зростання показників захворюваності на РМЗ за останні 20 років без тенденції до їх стабілізації. В останні роки прогноз клінічного перебігу та визначення тактики лікування базується на підставі визначення не лише гістологічної форми РМЗ, але і його молекулярного підтипу. Водночас на сьогодні остаточно доведено, що РМЗ в рамках навіть одного підтипу є достатньо гетерогенним захворюванням як за перебігом пухлинного процесу і чутливістю до медикаментозної терапії, так і за молекулярним фенотипом.

Одним з актуальних напрямків фундаментальної онкології останніх років є вивчення епігенетичних порушень під час розвитку та прогресування зло­якісних новоутворень, у тому числі при РМЗ. Особ­лива увага приділяється дослідженню мікроРНК, оскільки вони є основними регуляторами генів, задіяних у канцерогенезі [1]. МікроРНК — це малі некодувальні РНК довжиною приблизно 22 нуклеотиди, які регулюють рівень експресії матричних РНК шляхом взаємодії (інтерференції) з їх специфічними регіонами. МікроРНК забезпечують деградацію мРНК і таким чином знижують рівень експресії таргетних білків завдяки зв’язуванню з 3´-некодувальним регіоном мРНК [2].

МікроРНК регулюють понад 30% генів людини, що беруть участь у багатьох життєво важливих процесах, таких як проліферація, диференціювання, апоптоз, регуляція імунної відповіді тощо. Саме тому порушення регуляції мікроРНК може впливати на всі стадії канцерогенезу — від виникнення злоякісного новоутворення до його прогресії. Загальний рівень мікроРНК у більшості пухлин є суттєво зниженим порівняно з відповідними нормальними тканинами [3–5]. Згідно з даними літератури, при різних типах раку експресується набір певних мікроРНК, таких як мікроРНК-373, -155, 182 та ін., зміна співвідношення яких корелює з прогресією пухлинного процесу [6–8]. Саме тому визначення рівня експресії тканино-специфічних мікроРНК є потенційно важливим для ранньої диференційної діа­гностики онкологічних захворювань, у тому числі РМЗ, а також для прогнозування перебігу пухлинного процесу [9]. Незважаючи на інтенсивність досліджень мікроРНК при злоякісному рості, зв’язок їх експресії з особливостями перебігу різних молекулярних підтипів РМЗ остаточно не встановлений і потребує подальших досліджень. З огляду на сказане вище метою роботи було ідентифікувати профіль експресії пухлино-асоційованих мікроРНК та оцінити їх клінічне значення для прогнозування перебігу РМЗ певного молекулярного підтипу.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

В основу роботи покладено ретроспективний аналіз результатів обстеження та лікування 151 хворої на РМЗ стадій І–ІІ, які перебували на лікуванні у Київському міському клінічному онкологічному центрі протягом 2013–2016 рр. і дали інформовану згоду на використання клінічних даних у наукових цілях. Стадію пухлинного процесу визначали, керуючись міжнародними класифікаціями пухлин (TNM, 6-те видання (2002 р.) та 7-ме видання (2009 р.)) [10–11].

Згідно з даними історій хвороб, усім пацієнткам проведено загальні клінічні, біохімічні, лабораторні обстеження, ультразвукову діагностику органів черевної порожнини, мамографію, рентгеноскопію органів грудної порожнини, пункційну біопсію пухлин молочної залози за стандартами діагностики і лікування онкологічних хворих, затвердженими наказами МОЗ України від 27.07.1998 р. № 140, від 17.09.2007 р. № 554, від 30.07.2010 р. № 645 та від 30.06.2015 р. № 396.

Для верифікації пухлинного процесу проведено гістологічне дослідження операційного матеріалу. Загальну структуру пухлин оцінювали під час перегляду гістологічних зрізів товщиною 4–5 мікрон, забарвлених гематоксиліном та еозином, верифікували клінічний діагноз за Міжнародною класифікацією пухлин молочної залози (2009) та оцінювали ступінь диференціювання РМЗ [12].

Вік пацієнток коливався в межах 24–74 років (середній вік — 55,2 ± 4,1 року) (табл. 1). Серед обстежених більшу кількість становили хворі на РМЗ стадії ІІ — 75,5%. У 66,9% пацієнток відмічали менопаузу, у 33,1% менструальна функція була збережена. Метастатичні ураження реґіонарних лімфатичних вузлів діагностовано у 22,5% хворих, віддалені метастази при комплексному обстеженні хворих до хірургічного лікування не було виявлено.

Морфологічне дослідження операційного матеріалу показало, що частіше діагностували інфільтративний протоковий РМЗ (72,8%), ніж інфільтративний дольковий (27,2%), при цьому у більшості хворих (51,0%) визначено помірний ступінь диференціювання пухлин.

Ґрунтуючись на результатах імуногістохімічного дослідження експресії рецепторів естрогенів (РЕ), прогестерону (РП) та епідермального фактора росту (HER2/neu), усі досліджувані зразки пухлинної тканини нами було розділено на 4 молекулярні підтипи: люмінальний А (44,4%), люмінальний Б (27,1%), базальний (або тричі негативний) (17,9%) та HER2/neu-позитивний (10,6%).

Неоад’ювантну поліхіміотерапію (ПХТ) хворим не призначали. Усім пацієнткам проведено хірургічне лікування (квадрант- або лампектомія з регіональною лімфодисекцією, радикальна мастектомія за Маденом). В ад’ювантному режимі проводили ПХТ за схемами, які застосовують у хворих на РМЗ: СМF (циклофосфамід, метотрексат, флуо­роурацил), CАF (циклофосфамід, доксорубіцин, флуороурацил), 4–6 курсів. Після операції проводили променеву терапію на післяопераційний рубець, пахвову, парастернальну та надключичну ділянки (апарат «TERAGAM», разова вогнищева доза — 2 Гр, сумарна вогнищева доза — 42–44 Гр). Хворим з позитивною експресією гормональних рецепторів у видаленій пухлині на тривалий час призначали гормональну терапію за прийнятими схемами (тамоксифен, інгібітори ароматази) залежно від індивідуальних клінічних даних.

Імуногістохімічний метод. Імуногістохімічне дослідження РЕ, РП, HER2/neu і Ki-67 у клітинах РМЗ проводили на парафінових зрізах операційного матеріалу. У якості первинних антитіл використовували моноклональні антитіла, які є специфічними до РЕ (клон 1D5), РП (клон PgR636), HER2/neu (клон c-erbB-2) та Кі-67 (клон МІВ-1). Для детекції реакції використовували систему візуалізації Lab Vision™ UltraVision™ Quanto Detection System (Thermo Scientific, USA). Для кількісної оцінки експресії досліджених маркерів використовували метод H-Score за формулою:

де S — показник «H-Score», N0 — кількість клітин з відсутньою експресією, N1, N2 та N3 — з низькою, середньою та високою експресією відповідно. Кінцевий результат підрахунку виражали у балах: від 1 до 100 балів — низький, від 101 до 200 балів — середній, від 201 до 300 — високий рівень експресії [13].

Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в реальному часі. Для дослідження експресії пухлинно-асоційованих мікроРНК-10b, -21, -29b, -34а, -126, -155, -181а, -199a, -200b, -205, -221 та -320a було застосовано метод зворотно-транскрипційної ПЛР (ЗТ-ПЛР) у реальному часі. З гомогенату 100 мг пухлинної тканини РМЗ виділяли тотальну РНК за допомогою комерційного набору «miRNeasy 96 Kit» (QIAGEN, USA). Кількість виділеної РНК визначали на спектрофотометрі «NanoDrop 2000c Spectrophotometer» (ThermoScientific, США).

Чистоту виділеної РНК контролювали, використовуючи співвідношення величин оптичного поглинання за довжини хвиль 260 та 280 нм. РНК розчиняли у tris-EDTA-буфері та до проведення ПЛР зберігали за температури –20 °С.

ЗТ-ПЛР проводили на апаратній системі виявлення Quant Studio DX5 Real-Time PCR System з використанням комерційного набору для ЗТ-ПЛР TaqMan MicroRNA Assay (ThermoScientific, USA) за протоколом виробника. У якості ендогенного контролю для об’єктивізації показників експресії використовували мікроРНК RNU48. Відносну експресію досліджуваних мікроРНК було визначено порівняльним dCT-методом (ум. од.). Дослідження проведено у трьох повторах для кожного зразка.

Для кожної мікроРНК визначали медіанне значення у досліджуваній вибірці, відносно якого робили висновок про високу або низьку її експресію в кожному окремому зразку.

Статистичні методи. Статистичну обробку отриманих результатів виконували за допомогою програми GraphPad Prism, v.6.05 (GraphPad Software, Inc., San Diego, USA) з урахуванням характеру розподілу отриманих даних. Для оцінки достовірності відмінностей показників експресії досліджених маркерів та інших клініко-патологічних параметрів використовували t-критерій Стьюдента. Кореляційний аналіз проводили за допомогою розрахунку коефіцієнта кореляції Пірсона. Виживаність хворих аналізували за методом Каплана — Мейєра, достовірність між кривими — за logrank test. Достовірними вважали розбіжності за р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

МікроРНК — це малі некодувальні РНК, які негативно регулюють експресію генів-мішеней через комплементарність до їх мРНК. Зв’язуючись з таргетною мРНК, мікроРНК спричиняють її деградацію, деаденілювання або зупиняють трансляцію білка, заважаючи проходженню рибосом. Крім того, мікроРНК виконують множинну роль не тільки як посттрансляційні негативні регулятори, а, можливо, і як активатори транскрипції і трансляції [2]. Одна мікроРНК може регулювати експресію від 10 до 200 генів, тоді як один ген може бути під контролем десятка різних мікроРНК. Відповідно, мікроРНК є «глобальними перемикачами» геному, координовано регулюючи множинні метаболічні шляхи і утворення білкових продуктів.

Вибір мікроРНК для досліджень ґрунтувався на інформації щодо їх задіяності в регуляції генів, асоційованих з виникненням та прогресією пухлинного процесу.

Для цього за допомогою інструментів ресурсу ncbi.nlm.nih.gov (ProSplign, BLAST, GemBank та ін.) та http://www.mir2disease.org/ підібрано панелі мікроРНК. На першому етапі з використанням ресурсу http://www.mir2disease.org відібрано 263 мікроРНК для яких експериментально доведено зв’язок з канцерогенезом у молочній залозі. На другому етапі, ґрунтуючись на даних літератури, патентів та клінічних випробувань, серед відібраного переліку мікроРНК нами сформовано список із 40 мікроРНК, що беруть участь у регуляції проліферації, апоптозу та асоційовані з інвазивністю і метастазуванням РМЗ.

На наступному етапі з використанням ресурсу ncbi.nlm.nih.gov (BLAST TOOL) проаналізовано послідовності обраних мікроРНК та визначено їх можливі сайти зв’язування не лише в геномі людини, а й у доступних послідовностях ряду збудників інфекційних захворювань (гепатити, вірус папіломи людини, Helicobacter pilori, SARS-CoV-2 та ін.) з метою виявлення можливих перекривань даних послідовностей, які знижують прогностичну цінність мікроРНК як маркерів РМЗ. Під час відбору мікроРНК безпосередньо для досліджень нами також було враховано інформацію щодо частоти SNP-поліморфізмів їх послідовностей. Зазначений аналіз дозволив сформувати панель з 12 мікроРНК, для яких встановлено зв’язок з канцерогенезом у молочній залозі, а саме: мікроРНК-10b, -21, -29b, -34а, -126, -155, -181а, -199a, -200b, -205, -221 та -320a.

Зв’язок експресії мікроРНК з молекулярним підтипом РМЗ. Аналіз отриманих даних дозволив встановити, що молекулярні підтипи РМЗ суттєво відрізняються за профілем експресії мікроРНК. Як видно з рис. 1, найбільші зміни співвідношення досліджених мікроРНК визначаються у новоутвореннях базального та HER2/neu-позитивного підтипів порівняно з пухлинами люмінального А та Б підтипів.

Зокрема, у тричі негативних пухлинах порівняно з новоутвореннями люмінального А підтипу експресія мікроРНК-10b, -126 та -221 була вищою (у 1,66; 2,67 та 2,29 раза відповідно), а рівні мікроРНК-34а, -181а, -200b, -205 та -320а — нижчими (у 4,17; 1,71, 4,97; 4,67 та 3,02 раза відповідно). На противагу цьому у пухлинних клітинах люмінального Б підтипу РМЗ показники мікроРНК-10b, -126 та -221 були у 1,41; 2,00 та 3,12 раза нижчими, а мікроРНК-34а, -155, -200b, -205 та -320а у 4,5; 1,54; 5,31; 5,3 та 6,83 раза вищими, ніж у новоутвореннях базального молекулярного підтипу.

Аналогічну тенденцію зафіксовано під час порівняльного дослідження профілю експресії мікроРНК серед люмінального А та Б підтипів і HER2/neu-позитивного РМЗ (див. рис. 1). Зокрема, показники мікроРНК-126 та -221 у пухлинах HER2/neu-позитивного підтипу були у 2,5 та 2,4 раза вищими, ніж у пухлинах люмінального А підтипу, та у 1,9 та 3,2 раза вищими, ніж у пухлинах люмінального Б підтипу. У клітинах HER2/neu-позитивного РМЗ також відзначено зниження рівня мікроРНК-10b, -34а, -200b, -205 та -320а порівняно з люмінальними пухлинами (у 1,8; 8,3; 4,6; 3,5 та 3,4 раза для люмінального А та у 2,2; 9,0; 4,9; 4,0 та 7,8 раза для люмінального Б підтипу відповідно).

Порівняльне дослідження особливостей експресії мікроРНК у новоутвореннях люмінальних підтипів РМЗ показало, що рівні мікроРНК-29b були у 1,6 разів вищими, а мікроРНК-181а у 1,5 раза нижчими у клітинах люмінального А підтипу порівняно з люмінальним Б (p <0,05).
Певні відмінності нами також встановлено під час аналізу показників експресії дослідженої панелі мікроРНК у тканині базального та HER2/neu-позитивного РМЗ (див. рис. 1). Достовірно вищі рівні експресії мікроРНК-10b, -21 та -34а (у 3,0; 1,5 та 2,0 раза відповідно) зафіксовано у зразках тричі негативного РМЗ порівняно з аналогічними показниками у HER2/neu-позитивних пухлинах.

На наступному етапі нами проаналізовано залежність показників дослідженої панелі мікроРНК від основних клініко-морфологічних характеристик РМЗ всередині кожного молекулярного підтипу.

Як видно з таблиці 2, у хворих на РМЗ люмінального А підтипу показники експресії мікроРНК-10b корелювали зі стадією пухлинного процесу (r = 0,53), а рівень експресії мікроРНК-10b, -126 та -34а залежав від ступеня метастатичного ураження реґіо­нарних лімфатичних вузлів (РЛВ) (r = 0,65, 0,58 та -0,67 відповідно). Рівень експресії мікроРНК-10b та -126 був вищим, а рівень мікроРНК-34а, навпаки, нижчим у хворих з РМЗ ІІ стадії порівняно з пацієнтами з І стадією пухлинного процесу, проте достовірні відмінності нами виявлено лише для мікроРНК-10b (p <0,05).

*p <0,05 у порівнянні з показниками відповідної категорії.

За результатами аналізу показників мікроРНК у пухлинах хворих на РМЗ люмінального Б молекулярного підтипу встановлено, що у цієї когорти пацієнток рівні мікроРНК-34а та -320а при РМЗ ІІ стадії були у 1,3 та 1,4 раза нижчими, ніж у хворих на РМЗ І стадії. Також нами виявлено, що експресія мікроРНК-10b, -34а та -126 корелює з наявністю метастазів у РЛВ — у пацієнток без метастазів ці показники становили 3,9 ± 0,2; 2,9 ± 0,4 та 0,8 ± 0,1 у.о. відповідно, у той час як при N1–3 — 4,6 ± 0,4; 1,9 ± 0,4 та 1,2 ± 0,1 у.о. відповідно; коефіцієнти кореляції становили 0,64; -0,57 та 0,63 відповідно (табл. 3).

*p<0,05 у порівнянні з показниками відповідної категорії.

За результатами аналізу рівнів експресії мікроРНК залежно від основних клініко-морфологічних характеристик РМЗ базального молекулярного підтипу виявлено кореляційний зв’язок між рівнем експресії мікроРНК-126 та -205 та мета­статичним ураженням РЛВ (r = 0,62 та -0,67 відповідно). Рівні мікроРНК-126 були достовірно вищими за наявності метастазів у РЛВ (у 1,5 раза), а мікроРНК-205 — нижчими (у 4,1 раза) (табл. 4). Для мікроРНК-126 також встановлено зв’язок зі стадією РМЗ базального молекулярного підтипу (r = 0,53). Як видно з наведених даних, у пацієнток з тричі негативним РМЗ ІІ стадії рівень експресії мікроРНК-126 був у 1,3 раза вищим порівняно з хворими на РМЗ І стадії.

*p<0,05 у порівнянні з показниками відповідної категорії.

У хворих з HER2/neu-позитивним молекулярним підтипом РМЗ виявлено зв’язок між рівнем експресії мікроРНК-10b, -181а, -320а та стадією пухлинного процесу (r = 0,55; -0,61 та -0,64 відповідно). Зокрема, у пацієнток з HER2/neu-позитивним РМЗ ІІ стадії рівень експресії мікроРНК-10b був у 1,6 раза вищим, а показники рівня експресії мікроРНК-181а та -320а — у 2,7 та 3,0 раза нижчими відповідно, порівняно з новоутвореннями РМЗ І стадії. Поряд із цим рівень експресії мікроРНК-181а, -205 та -320а в пухлинній тканині пацієнток з HER2/neu-позитивним РМЗ обернено корелював з наявністю метастатичного ураження РЛВ (r = -0,63; -0,55; -0,57). Так, за наявності метастазів у РЛВ експресія зазначених мікроРНК була у 3,0; 2,7 та 2,6 раза нижчою, ніж у зразках пухлинної тканини хворих без метастазів (табл. 5).

*p<0,05 у порівнянні з показниками відповідної категорії.

Враховуючи отримані дані щодо зв’язку показників експресії дослідженої панелі мікроРНК з клініко-патологічними особливостями певних молекулярних підтипів РМЗ, на наступному етапі нами проаналізовано показники виживаності хворих залежно від рівня експресії мікроРНК-10b, -34а та -126 у хворих на РМЗ люмінального А підтипу, мікроРНК-10b, -126 та -34а — у пацієнтів з РМЗ люмінального Б підтипу, мікроРНК-126 та -205 — у хворих на РМЗ базального підтипу та мікроРНК-181a, -205 та -320а — у пацієнтів з HER2/neu-позитивним молекулярним підтипом РМЗ.

Як видно з даних, наведених на рис. 2, достовірне зниження показників 5-річної загальної виживаності на 30,0% встановлено у хворих на РМЗ люмінального А підтипу з профілем експресії мікроРНК-10b >3,8 у.о., мікроРНК-126 >0,6 у.о., мікроРНК-34a <2,0 у.о. у пухлинних клітинах. Певні відмінності зафіксовано і при дослідженні показників безрецидивної виживаності хворих на РМЗ люмінального А підтипу залежно від показників експресії пухлино-асоційованих мікроРНК. 3-річна безрецидивна виживаність за наявності експресії мікроРНК-10b >3,8 у.о., мікроРНК-126 >0,6 у.о., мікроРНК-34а <1,6 у.о. у пухлинних клітинах була нижчою, ніж при експресії зазначених мікроРНК на рівні <2,1 у.о., <0,30 у.о., >2,1 у.о. відповідно (див. рис. 2).
аб

Аналіз профілю експресії мікроРНК-126, -34а та -320а залежно від показників виживаності хворих на РМЗ люмінального Б молекулярного підтипу показав, що у пацієнток з рівнем експресії мікроРНК-34а >2,5 у.о., мікроРНК-126 <0,7 у.о., мікроРНК-320а >2,5 у.о., 5-річна виживаність була на 75,0% вищою, ніж у хворих із рівнем експресії мікроРНК-34a <1,4 у.о., мікроРНК-126 >1,2 у.о., мікроРНК-320a <2,0 у.о. При цьому рецидиви у 3-річний термін спостерігаються у 1,8 раза рідше у пацієнток з рівнем експресії мікроРНК-34а >2,6 у.о., мікроРНК-126 <0,8 у.о, мікроРНК-320а >2,5 у.о. порівняно з хворими з рівнем експресії мікроРНК-34a <1,2 у.о., мікроРНК-126 >1,1 у.о. та мікроРНК-320a < 2,1 у.о. (рис. 3).
аб

У хворих на РМЗ базального молекулярного підтипу високий рівень експресії мікроРНК-126 (>1,8 у.о) та низький рівень експресії мікроРНК-205 (<0,1 у.о.) асоціювалися з гіршими показниками 3- та 5-річної виживаності. Рецидиви у 3-річний термін спостерігалися в 1,5 раза рідше за показників мікроРНК-126 <1,1 у.о. та мікроРНК-205 >0,5 у.о., ніж у пацієнток з рівнями мікроРНК-126 >1,7 у.о., мікроРНК-205 <0,1 у.о. (рис. 4).
аб

Підвищення показників виживаності хворих на HER2/neu-позитивний РМЗ асоціювалося з високими рівнями експресії мікроРНК-181а, -205 та -320а (вище 0,8; 0,7 та 0,6 у.о. відповідно), у той час як при експресії зазначених мікроРНК нижче 0,2, 0,2 та 0,4 у.о. відповідно загальна виживаність була нижчою на 25,0% (рис. 5). У хворих з рівнями експресії мікроРНК-181а >0,8 у.о. мікроРНК-205 >0,9 та мікроРНК-320а >0,7 у.о. рецидиви в 3-річний термін виявляли у 2,1 раза рідше, порівняно із хворими, у яких ці показники були <0,2; <0,1 та <0,4 у.о. відповідно.
аб

Отримані нами результати узгоджуються з даними літератури щодо важливої ролі мікроРНК-10b у метастазуванні пухлин молочної залози. Зокрема, Zhang та співат. (2018) продемонстрували асоціацію між експресією мікроРНК-10b та такими клініко-патологічними параметрами РМЗ, як вік хворих, стадія, метастатичне ураження РЛВ, а також показниками виживаності [14]. У експериментах in vivo встановлено, що підвищена експресія мікроРНК-10b корелює з інвазивною та метастатичною активністю злоякісно трансформованих клітин. Клітини карциноми молочної залози людини з гіперекспресією мікроРНК-10b, що були імплантовані мишам, демонстрували значну інвазію в строму та спричиняли розвиток метастазів у легені [15].

МікроРНК-34a є однією з онкосупресорних мікроРНК, оскільки її основною функцією є запуск p53-опосередкованого апоптозу. Також було продемонстровано, що мікроРНК-34a регулює клітинний цикл і пригнічує проліферацію клітин [16]. Крім того, попередні дослідження продемонстрували, що мікроРНК-34a інгібує епітеліально-мезенхімальний (ЕМТ) перехід та спричиняє розвиток віддалених метастазів шляхом пригнічення транс­крипційних факторів, пов’язаних із ЕМТ, таких як TWIST1 і ZEB 1 [17].

Tokumaru та співавт. (2020) оцінили клінічну значущість експресії мікроРНК-34a як прогностичного маркера виживаності пацієнтів з РМЗ. У їх дослідженні виявлено зв’язок рівня експресії цієї мікроРНК з показниками загальної і безрецидивної виживаності хворих на рецептор-позитивні молекулярні підтипи РМЗ [18]. Ці ж автори дослідили прогностичну значущість панелі мікроРНК-9, -30a, -200c, -18a, -205 і -744 при РМЗ. Так, було встановлено вплив поліморфізмів досліджуваних мікроРНК на їх онкогенні/онкосупресорні функції при РМЗ [19].

МікроРНК-126 задіяна в регуляції ангіогенезу та проліферації клітин РМЗ. Хоча в ряді досліджень in vitro та in vivo її функції визначають як онкосупресорні (трансфекція клітин лінії MCF-7 агоністом мікроРНК-126 знижує проліферацію клітин та інгібує ангіогенез ксенотрансплантанта пухлини); дані, отримані на клінічному матеріалі, варіюють у широких межах [20–21].

Деякі автори повідомляють про обернений кореляційний зв’язок рівнів пухлинної мікроРНК-126 та кількості метастазів у РЛВ у хворих на РМЗ базального молекулярного підтипу [22]. Проте у дослідженні [23] виявлено, що висока експресія miR-126 пов’язана з низькими показниками загальної виживаності хворих на РМЗ незалежно від молекулярного підтипу новоутворень. Така варіабельність результатів може бути зумовлена значною гетерогенністю цього захворювання, а також популяційними особливостями (імовірно, різною частотою поліморфізмів цієї мікроРНК).

МікроРНК-320а є маловивченою в якості прогностичного маркера РМЗ. У дослідженнях на невеликій вибірці пацієнтів було продемонстровано зв’язок її експресії з розміром пухлини, клінічною стадією РМЗ, реґіонарним та віддаленим метастазуванням [24]. Крім того, як і у нашому дослідженні, пацієнти з низьким рівнем експресії мікроРНК-320a мали нижчі показники виживаності. В іншій роботі продемонстровано, що ця мікроРНК пригнічує мета­стазування РМЗ шляхом безпосереднього інгібування експресії MTDH [25].

Літературні дані вказують на те, що експресія мікроРНК-181a порушується під час розвитку РМЗ, однак є кілька суперечливих висновків, які ставлять під сумнів її біологічне значення у розвитку та прогресії пухлин цього гістогенезу.

Berber та співат. (2014) встановили зниження експресії цієї мікроРНК у хворих на РМЗ базального молекулярного підтипу за наявності метастатичного ураження РЛВ, а також продемонстрували її зв’язок з виживаністю пацієнтів [26]. В іншому дослідженні виявлено, що рівень мікроРНК-181a був нижчим у клітинах РМЗ з низькою інвазивною активністю [27].

Водночас трьома незалежними дослідницькими групами встановлено, що підвищена експресія мікроРНК-181a корелює з агресивністю перебігу РМЗ. У кількох дослідженнях показано, що пухлини базального та HER2/neu-позитивного молекулярних підтипів з високими рівнями зазначеної мікроРНК відрізняються агресивним перебігом та характеризуються наявністю метастазів у кістки і низькими показниками виживаності хворих [28].

Незважаючи на суперечливу роль в розвитку ново­утворень різного гістогенезу, щодо пухлин молочної залози функції мікроРНК-205 в основному описують як онкосупресорні. На сьогодні відомо, що експресія мікроРНК-205 значно знижена у пухлинній тканині порівняно з нормальною, а також є значно нижчою у тканині метастазів порівняно з первинною пухлиною. Продемонстровано, що низькі рівні мікроРНК-205 асоційовані з наявністю метастазів у РЛВ у пацієнтів з базальним молекулярним підтипом РМЗ [26]. Також існують дані щодо зв’язку між показниками експресії цієї мікроРНК та виживаністю хворих на РМЗ базального та HER2/neu-позитивного підтипів [29].

Підсумовуючи отримані дані, можна стверджувати про значущість мікроРНК-10b, -34а, -126, -181а, -205 та -320а як прогностичних маркерів перебігу РМЗ різних молекулярних підтипів (рис. 6).

ВИСНОВКИ

Ідентифіковано профіль експресії мікроРНК у тканині РМЗ різних молекулярних підтипів. Встановлено, що характерною ознакою люмінального А підтипу є високі рівні експресії мікроРНК-10b, -126 та -221 та низькі мікроРНК-34а, -181а, -200b, -205 та -320а; люмінального Б — високі рівні експресії мікроРНК-34а, -155, -200b, -205 та -320а та низькі мікроРНК-10b, -126 та -221; Her/neu-позитивного — високі рівні експресії мікроРНК-126 та -221 та низькі — мікроРНК-10b, -34а, -200b, -205 та -320а; базального (тричі негативного) — високі рівні експресії мікроРНК-10b, -21 та -34а.

Встановлено наявність кореляційних зв’язків між рівнем експресії пухлино-асоційованих мікроРНК з основними клініко-патологічними характеристиками хворих на РМЗ різних молекулярних підтипів. У пацієнток з РМЗ люмінального А підтипу показники експресії мікроРНК-10b корелювали зі стадією пухлинного процесу (r = 0,53), а мікроРНК-10b, -126 та -34а з метастатичним ураженням РЛВ (r = 0,65, 0,58 та -0,67, відповідно). У хворих на РМЗ люмінального Б молекулярного підтипу рівень експресії мікроРНК-10b, -34а та -126 корелював з наявністю метастазів у РЛВ (r = 0,64, -0,57 та 0,63 відповідно). У пацієнток з HER2/neu-позитивним молекулярним підтипом РМЗ виявлено зв’язок між рівнем експресії мікроРНК-10b, -181а та -320а та стадією пухлинного процесу (r = 0,55, -0,61 та -0,64, відповідно); мікроРНК-181а, -205 та -320а — з наявністю метастатичного ураження РЛВ (r = -0,63; -0,55; -0,57). Продемонстровано кореляційний зв’язок між рівнем експресії мікроРНК-126 і -205 та метастатичним ураженням РЛВ (r = 0,62 та -0,67 відповідно) хворих на РМЗ базального молекулярного підтипу, а також між показниками експресії мікроРНК-126 та стадією захворювання (r = 0,53).

Визначено достовірно вищі показники 5-річної загальної виживаності у хворих на РМЗ: люмінального А підтипу — за умови низького рівня експресії пухлино-асоційованих мікроРНК-10b і мікроРНК-126 та високого рівня експресії мікроРНК-34a; люмінального Б підтипу — за високих показників експресії мікроРНК-34а, мікроРНК-126 та мікроРНК-320а; HER2/neu-позитивного підтипу — за високих рівнів експресії мікроРНК-181а, -205 та -320а; базального підтипу — за низького рівня експресії мікроРНК-126 та високого — мікроРНК-205.

Виявлено, що 3-річна безрецидивна виживаність була вищою у хворих на РМЗ: люмінального А підтипу — за низьких показників експресії мікроРНК-10b і мікроРНК-126, високого рівня експресії мікроРНК-34а; люмінального Б підтипу — за високих показників експресії мікроРНК-34а, мікроРНК-320а та низького рівня експресії мікроРНК-126; HER2/neu-позитивного підтипу — за високих рівнів експресії мікроРНК-181а, -205 та -320а; базального підтипу — за низького рівня експресії мікроРНК-126 та високого — мікроРНК-205.

Обґрунтовано можливість використання показників експресії мікроРНК у пухлинних клітинах для прогнозування агресивності перебігу різних молекулярних підтипів РМЗ та оцінки ризику розвитку рецидиву захворювання.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Chekhun VF. MicroRNAs are a key factor in the globalization of tumor-host relationships. Exp Oncol 2019; 41 (3): 188–94. doi: 10.32471/exp-oncology.2312-8852.vol-41-no-3.13431.
2. Chekhun VF. MicroRNA in the tumor process. Oncology 2012; 15 (2): 136 (in Ukrainian)
3. Chekhun S, Bezdenezhnykh N, Shvets J, Lukianova N. Expression of biomarkers related to cell adhesion, metastasis and invasion of breast cancer cell lines of different molecular subtype. Expl oncol 2013; 35 (3): 174–9.
4. Lukianova NY, Borіkun TV, Zadvornyi TV, et al. Diagnostic and prognostic value of tumor-associated miRNA-21, -125b and -221 in patients with the most common hormone-dependent malignancies. Oncology 2021; 23 (3): 123–9 (in Ukrainian)
5. Chekhun VF, Lukianova NY, Borikun TV, et al. The clinical significance of tumor miR-122, -155, -182, and -200b expression in patients with breast cancer. Science and Innovation 2017; 13 (5): 63–9 (in Ukrainian). doi: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-3-2021-g.9840
6. Nair MG, Somashekaraiah VM, Ramamurthy, et al. miRNAs: critical mediators of breast cancer metastatic programming. Exp Cell Res 2021; 401 (1): 112518. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112518.
7. Adhami M, Haghdoost AA, Sadeghi B, Afshar RM. Candidate miRNAs in human breast cancer biomarkers: a systematic review. Breast Cancer 2018; 25 (2): 198–205. doi: 10.1007/s12282-017-0814-8
8. Healy N, Heneghan H, Muller N, et al. Systemic microRNA as potential biomarkers in cancer. Int J Cancer 2013; 131: 2265–71. doi:10.1002/ijc.27642
9. Tang Q, Ouyang H, He D, et al. MicroRNA-based potential diagnostic, prognostic and therapeutic applications in triple-negative breast cancer. Artif Cells Nanomed Biotechnol 2019; 47 (1): 2800–9. doi: 10.1080/21691401.2019.1638791
10. Sobin LH, Wittekind C. TNM. Classification of malignant tumors. Sixth Edition. UICC, Ed Willey-Liss 2003; 193.
11. Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind Ch, et al. International Union Against Cancer (UICC). TNM Classification of Malignant Tumours, 7th edn. New York: Wiley, 2009
12. Lakhani S, Ellis I, Schnitt S, et al. 4th. WHO Classification of Tumours of the Breast. Lyon: IARC Press; 2012
13. Budwit-Novotny DA, McCarty KS, Cox EB, et al. Immunohistochemical analyses of estrogen receptor in endometrial adenocarcinoma using a monoclonal antibody. Cancer Res 1986; 46 (10): 5419–25.
14. Zhang J, Yang J, Zhang X, et al. MicroRNA-10b expression in breast cancer and its clinical association. PLoS One 2018; 13 (2): e0192509. doi: 10.1371/journal.pone.0192509
15. Wang J, Yan Y, Zhang Z, Li Y. Role of miR-10b-5p in the prognosis of breast cancer. PeerJ, 2019; 7: e7728. doi: 10.7717/peerj.7728
16. Adams BD, Parsons C, Slack FJ. The tumor-suppressive and potential therapeutic functions of miR-34a in epithelial carcinomas. Expert Opin Ther Targets 2016; 20 (6): 737–53. doi: 10.1517/14728222.2016.1114102
17. Imani S, Wu RC, Fu J. MicroRNA-34 family in breast cancer: From research to therapeutic potential. J. Cancer 2018; 9 (20): 3765–75. doi: 10.7150/jca.25576
18. Tokumaru Y, Katsuta E, Oshi M, et al. High expression of miR-34a associated with less aggressive cancer biology but not with survival in breast cancer. Int J of Mol Sci 2020; 21 (9): 3045. doi: 10.3390/ijms21093045
19. Kim SY, Kawaguchi T, Yan L, et al. Clinical relevance of microRNA expressions in breast cancer validated using the cancer genome atlas (TCGA). Ann Surg Oncol 2017; 24 (10): 2943–49. doi: 10.1245/s10434-017-5984-2
20. Alhasan L. MiR-126 modulates angiogenesis in breast cancer by targeting VEGF-A-mRNA. Asian Pac J Cancer Prev 2019; 20 (1): 193. doi: 10.31557/APJCP.2019.20.1.193
21. Li F. Expression and correlation of miR‑124 and miR‑126 in breast cancer. Oncol Lett 2019; 17 (6): 5115–9. doi: 10.3892/ol.2019.10184
22. Rouigari M, Dehbashi M, Tabatabaeian H, et al. Evaluation of the expression level and hormone receptor association of miR-126 in breast cancer. Indian J Clin Biochem 2019; 34 (4): 451–7. doi: 10.1007/s12291-018-0766-6
23. Thomopoulou K, Papadaki C, Monastirioti A, et al. MicroRNAs regulating tumor immune response in the prediction of the outcome in patients with breast cancer. Front Mol Biosci 2021; 8: 668534. doi: 10.3389/fmolb.2021.668534
24. Yang H, Yu J, Wang L, et al. miR‑320a is an independent prognostic biomarker for invasive breast cancer. Oncol Lett 2014; 8 (3): 1043–50. doi: 10.3892/ol.2014.2298
25. Yu J, Wang JG, Zhang L, et al. MicroRNA-320a inhibits breast cancer metastasis by targeting metadherin. Oncotarget 2016; 7 (25): 38612. doi: 10.18632/oncotarget.9572
26. Berber U, Yilmaz I, Narli G, Haholu A, et al. miR-205 and miR-200c: predictive micro RNAs for lymph node metastasis in triple negative breast cancer. J Breast Cancer 2014; 17 (2): 143–8. doi: 10.4048/jbc.2014.17.2.143
27. Noh H, Hong S, Dong Z, et al. Impaired microRNA processing facilitates breast cancer cell invasion by upregulating urokinase-type plasminogen activator expression. Genes Cancer 2011; 2 (2): 140–50. doi: 10.1177/1947601911408888
28. Yang C, Tabatabaei SN, Ruan X, Hardy P. The dual regulatory role of MiR-181a in breast cancer. Cell Physiol Biochem 2017; 44 (3): 843–56. doi: 10.1159/000485351
29. Cataldo A, Piovan C, Plantamura I, et al. MiR-205 as predictive biomarker and adjuvant therapeutic tool in combination with trastuzumab. Oncotarget 2018; 9 (46): 27920. doi: 10.18632/oncotarget.24723

Адреса для листування:
Борікун Т.В.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: tborikun@gmail.com
Одержано: 08.06.2022