ОСОБЛИВОСТІ ЕКСПРЕСІЇ EpCAM У КЛІТИНАХ ПУХЛИН МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ТА ЇХ ЗВ’ЯЗОК ІЗ КЛІНІКО-ПАТОЛОГІЧНИМИ ПОКАЗНИКАМИ І МОЛЕКУЛЯРНИМ ПІДТИПОМ РАКУ

Мета: визначення особливостей експресії протеїну EpCAM у клітинах раку молочної залози (РМЗ) залежно від стадії захворювання і молекулярного підтипу пухлини. Об’єкт і методи: зразки операційного матеріалу 35 хворих на РМЗ І–ІІ стадії. Експресію EpCAM, Кі67, Her2/neu, рецепторів естрогенів (RЕ) і прогестерону (RP) визначали імуногістохімічним методом. Експресію гена EpCAM у зразках РМЗ оцінено з використанням біоінформативного аналізу відкритого масиву даних Онкомайн (Oncomine). Аналіз функціональних зв’язків білка EpCAM проведено з використанням бази даних та алгоритму FunCoup. Cтатистичний аналіз проводили за допомогою програми GraphPadPrism7. Результати: найвищий (р = 0,0058) рівень експресії білка EpCAM виявлено у клітинах РМЗ люмінального А підтипу. Аналіз зразків, згрупованих за стадією, показав підвищення експресії EpCAM із прогресуванням захворювання (р = 0,0234). Рівень експресії EpCAM свідчить про обернену кореляцію з рівнем маркера проліферації Кі67: у зразках РМЗ люмінального А підтипу виявлена найнижча (р = 0,1088) експресія останнього. Висновок: визначення рівня експресії білка EpCAM у клітинах РМЗ може бути використано як додатковий критерій для характеристики молекулярного підтипу пухлини і прогнозу перебігу захворювання.


Білок людини EpCAM (NP_002345, Epithelial Cell Adhesion Molecule), також відомий як TACSTD1 (tumor-associated calcium signal transducer 1); CD326; GA733–2 (gastrointestinal tumor-associated antigen 2); МІС18 (antigen defined by monoclonal antibody auai); M4S1 (membrane component, chromosome 4, surface marker 1) становить трансмембранний глікопротеїн першого типу (м.м. 40 kDa), що кодується геном EpCAM (NM_002354), розміщеним на хромосомі 2р21. Цей білок складається із позаклітинного N-кінця, трансмембранного домена, що містить повтори, і короткого внутрішньоклітинного С-кінця. Слід відзначити, що позаклітинна ділянка EpCAM складається із EGF- і тиреоглобулінподібних мотивів [1], що містять потенційні сайти глікозилювання [2]. Протеїн EpCAM є маркером епітеліальних клітин, який поєднує адгезійні [3, 4] та активаційні властивості [5, 6]. Зазвичай сигнал цього білка виявляється на базолатеральній поверхні плазматичної мембрани простого, перехідного та псевдобагатошарового епітелію; за нормальних умов EpCAM опосередковує ріст і диференціювання клітин [7].

Гіперекспресія EpCAM часто спостерігається у злоякісно трансформованих клітинах аденокарцином та плоскоклітинних карцином [8, 9]. Відомо, що EpCAM за рахунок тиреоглобулінподібного домена інгібує дію цистеїнових протеаз, що продукуються пухлинними клітинами [10, 11]. Показано зв’язок експресії EpCAM з прогнозом перебігу злоякісного пухлинного процесу [12]. EpCAM надмірно експресується у більшості видів раку, включаючи рак молочної залози (РМЗ), шлунка, підшлункової та передміхурової залоз, аденокарцином товстої кишки [13–15]. Надекспресія EpCAM пов’язана з поганим прогнозом перебігу карциноми жовчного міхура [16], раку яєчника [17] і підшлункової залози [18]. Попередні дослідження in vitro показали, що нокдаун EpCAM інгібує ріст клітин РМЗ і метастазування шляхом гальмування сигнального шляху RAS/RAF/ERK та матричної металопротеїнази-9 (MMP-9) [19].

РМЗ є досить агресивним захворюванням, яке швидко «молодшає» і вражає все більше жінок активного працездатного віку. РМЗ є першим негематологічним злоякісним новоутворенням, при якому у клінічній практиці виділяють підтипи, що спираються на молекулярну характеристику пухлинних клітин. На сьогодні виділяють п’ять молекулярних підтипів РМЗ [20]: за наявності експресії рецепторів естрогенів і прогестерону (ER+РR+) і відсутності експресії онкопротеїну Her2/neu (Her2/neu) пухлини відносять до молекулярного підтипу «люмінальний А», при ER+РR+Her2/neu+ — «люмінальний В»; ERРRHer2/neu+ — «Her2/neu-позитивний»; ЕRРRHer2/neu — «тричі негативний» або «базальний». П’ятий, відносно рідкісний молекулярний підтип («claudin-low»), виділений нещодавно [21]. Встановлення молекулярних підтипів наразі широко використовують у клінічній практиці, особливо для призначення терапії [22]. Проте у багатьох випадках клітини РМЗ є резистентними до хіміотерапевтичних препаратів, можливо, за рахунок активації альтернативних шляхів або втрати експресії рецепторів [23].

Тому подальший пошук нових маркерів для уточнення молекулярних підтипів РМЗ та мішеней для терапії залишається актуальним. Одним із перспективних маркерів може бути молекула EpCAM, тому що, як зазначено вище, цей білок є маркером епітеліальних клітин, він бере участь у багатьох процесах клітинної життєдіяльності.

Мета проведеної роботи — визначення особливостей експресії протеїну EpCAM у клітинах РМЗ залежно від стадії захворювання і молекулярного підтипу пухлини.

ОБ’ЄКТ і МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджено зразки операційного матеріалу 35 хворих на РМЗ І–ІІ стадії (середній вік 60,9 ± 2,1 року, від 41 до 89 років), які перебували на стаціонарному лікуванні у Київському міському клінічному онкологічному центрі в 2013–2016 рр. та не отримували спеціального лікування до оперативного втручання. Кожна з пацієнток надала особисту усвідомлену письмову добровільну згоду на участь у дослідженні відповідно до Гельсінської декларації WMA «Етичні принципи медичних досліджень, що залучають людей».

Стадію РМЗ визначали за Міжнародною класифікацією пухлин (TNM, 7-ме видання, 2009 р.). Для верифікації пухлинного процесу проведено стандартне гістологічне дослідження операційного матеріалу; гістологічний тип пухлин оцінювали за Міжнародною гістологічною класифікацією пухлин ВООЗ (2008 р.). Оцінку молекулярного підтипу РМЗ проводили на основі результатів імуногістохімічного (ІГХ) дослідження рецепторів естрогенів (RЕ), прогестерону (RP), епідермального фактора росту типу 2 (Her2/neu), з використанням МкАТ antiRЕ (клон 1D5), antiRP (клон PgR636) та antiHER/2neu (клон c-erbB-2; DakoCytomation, Данія).

Антитіла проти ЕРСАМ отримували в ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України із застосуванням гібридомної технології [24]. Клітини гібридом культивували in vitro та in vivo, з подальшим очищенням методом афінної хроматографії, визначення концентрації та дослідженням специфічності мишачих анти-EpCAM (клон Vu1D9) з використанням проточної цитофлуориметрії. Встановлено, що антитіла Vu1D9 розпізнають EGF-подібний позаклітинний домен EpCAM.

Білки EpCAM та Кі67 визначали стандартним ІГХ методом із використанням відповідних МкАт: Vu1D9 (ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України) та Кі67 (клон SP6 Thermo Fisher Scientific, Ann-Arbor, MI, США). Парафінові зрізи на скельцях SuperFrostRPlus (Dako Cytomation, Данія) інкубували 40 хв при 56 °С, депарафінували з подальшою регідратацією у фосфатному буфері. Демаскування антигену проводили шляхом інкубації 20 хв при 96 °С в цитратному буфері. Неспецифічне зв’язування антитіл блокували розчином для блокування пероксидази. Процедура ІГХ була двоступеневою, використовували систему виявлення EnVision FLEX (Dako). Первинні антитіла наносили на 60 хв, вторинне антитіло (FLEX/HRP, DAKO) — на 20 хв. Візуалізацію проводили за допомогою 3,3’-діамінобензидину, тетрагідрохлориду і перекису водню з подальшим забарвленням гематоксиліном Майєра. Реакцію вважали позитивною при виявленні гранулярного чи дифузного забарвлення коричневого кольору в місцях локалізації антигену за допомогою світлового мікроскопа. Реакцію в кожному зразку оцінювали (підраховуючи мінімум 500 пухлинних клітин) як негативну (якщо не спостерігалося позитивних клітин), слабку (+), помірну (++), сильну (+++).

Аналіз експресії гена EpCAM у зразках РМЗ також було проведено з використанням біоінформативного відкритого масиву даних Онкомайн (Oncomine). У загальнодоступній базі Oncomine містяться відомості щодо експресії та кількості копій генів (як опубліковані, так і не опубліковані у вигляді статей), що були зібрані, стандартизовані, анотовані та проаналізовані компанією Compendia Bioscience (www.oncomine.com, Thermo Fisher Scientific, Ann-Arbor, MI, США).

Аналіз функціональних зв’язків (асоціацій) білка EpCAM проведено з використанням бази даних та алгоритму FunCoup (funcoup.sbc.su.se). Cтатистичний аналіз проводили за допомогою програми GraphPadPrism7.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вивчені зразки відносилися до підтипів: «люмінальний А» — 6, «люмінальний В» — 15, «базальний» — 7, «HER-2/neu+» — 7. Між групами пацієнток із різними молекулярними підтипами пухлин була відсутня суттєва різниця за показником середнього віку (рис. 1, ліва нижня панель). У групі люмінального А підтипу РМЗ більшість злоякісних новоутворень були діагностовані як інвазивні долькові карциноми молочної залози, в інших трьох групах переважно діагностовані інвазивні протокові карциноми молочної залози (рис. 2, права колонка).

Рис. 1. Аналіз експресії білка EpCAM у клітинах зразків РМЗ. Аналіз Крускала — Уолліса для груп за алгоритмом ANOVA для непараметричних величин проведено за допомогою програми GraphPadPrism7

Рис. 2. Виявлення EpCAM (ліва колонка) та Кі67 (середня колонка) у зразках РМЗ ІГХ методом. Морфологічний аналіз (права колонка) — забарвлення гематоксиліном і еозином. × 400

За допомогою ІГХ методу забарвлення виявляли лише в пухлинних клітинах; не спостерігали позитивної реакції у клітинах строми та лімфоцитах. У всіх досліджених зразках РМЗ виявлено експресію EpCAM і Кі67, незалежно від молекулярного підтипу новоутворень (див. рис. 2, ліва та середня колонки). Найвищий рівень експресії EpCAM (р = 0,0058) виявлено у клітинах РМЗ люмінального А підтипу (див. рис. 1, ліва верхня панель; рис. 2, ліва колонка). Слід відзначити, що рівень експресії EpCAM показує обернену кореляцію з рівнем маркера проліферації Кі67: у зразках РМЗ люмінального А підтипу виявлялася найнижча (р = 0,1088) експресія Кі67 (див. рис. 1, права верхня панель).

При аналізі зразків, згрупованих за стадією (І–ІІВ) можна простежити підвищення експресії протеїну EpCAM із прогресією пухлин (р = 0,0234) (див. рис. 1, права нижня панель), що може бути пов’язано з двоякою роллю EpCAM. З одного боку, його високий рівень відповідає за збереження архітектури епітелію — при епітеліально-мезенхімальному переході (ЕМП) відбувається втрата EpCAM клітинами. З іншого боку, надмірне вираження EpCAM пов’язане з посиленою транскрипцією і трансляцією онкогена CMYC [25]. Можливо, потенційним механізмом регулювання експресії EpCAM є метилювання ДНК [26, 27].

Визначені нами залежності експресії гена EpCAM від стадії захворювання та молекулярного підтипу РМЗ було оцінено за допомогою біоінформативного аналізу відкритого масиву даних Онкомайн (Oncomine). Проаналізовано мікромасиви, отримані при вивченні великої кількості зразків РМЗ — від 76 і 112 [28] до 997 і 1051 [29]. Встановлено підвищення експресії гена EpCAM із прогресією пухлин (при групуванні за стадією), що відповідає отриманим нами даним. Таким чином, висока експресія EpCAM може бути оцінена як несприятливий прогностичний чинник.

Наступним питанням було вивчення додаткових функціональних зв’язків білка EpCAM, крім відомих і описаних в літературі. Застосування бази даних та алгоритму FunCoup дозволило виявити, що EpCAM утворює функціональні зв’язки з 4 протеїнами: CLDN7 (confidence 1,000), АТР1А1 (0,979), АТР1В1 (0,983) та UBC (0,822) (рис. 3). Найсильніший зв’язок (1,000) виявлено між EpCAM та CLDN7 (Claudin 7), який бере участь у формуванні щільних сполучень між епітеліальними клітинами і відіграє важливу роль у підтримці полярності клітин [30]. Спільна експресія РНК EpCAM та CLDN7 в експериментальних модельних системах (лінії клітин, миші) та у зрізах тканин пацієнтів свідчить про суттєвий функціональний зв’язок між цими протеїнами. Між білком EpCAM та білками АТР1А1 та АТР1В1 (Na+/K+-АТФазами) також виявлена сильна взаємодія, що пов’язує EpCAM з натрієво-калієвим насосом клітин людини [31]. Найслабкіша взаємодія визначена з білком UBC (убіквітин С), який відіграє ключову роль у підтримці сталої кількості убіквітину в клітині [32]. Зазначимо, що для всіх виявлених зв’язків філогенетична подібність профілів відсутня.

Рис. 3. Аналіз функціональних зв’язків протеїну EpCAM за допомогою бази даних та алгоритму FunCoup

Визначені особливості експресії протеїну EpCAM у клітинах РМЗ разом із виявленими функціональними асоціаціями цього білка свідчать про його можливу роль у контролі за архітектурою епітеліальної тканини. При прогресуванні захворювання рівень експресії EpCAM підвищується, що може бути пов’язано зі зміною експресії онкогенів та непрямими взаємодіями між ними.

ВИСНОВОК

Визначення рівня експресії білка EpCAM у клітинах РМЗ може бути використано як додатковий критерій для характеристики молекулярного підтипу пухлини і прогнозу перебігу захворювання.

Робота виконана за підтримки цільової комплекс­ної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України 2017–2021 рр. «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» (№ держреєстрації 0117U002034).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

  • 1. Linnenbach AJ, Wojcierowski J, Wu SA, et al. Sequence investigation of the major gastrointestinal tumor-associated antigen gene family, GA733. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86 (1): 27–31.
  • 2. Zhang D, Liu X, Gao J, et al. The role of epithelial cell adhesion molecule N-glycosylation on apoptosis in breast cancer cells. Tumour Biol 2017; 39 (3): 1010–34.
  • 3. Litvinov SV, Bakker HA, Gourevitch MM, et al. Evidence for a role of the epithelial glycoprotein 40 (Ep-CAM) in epithelial cell-cell adhesion. Cell Adhes Commun 1994; 2 (5): 417–28.
  • 4. Liu X, Gao J, Sun Y, et al. Mutation of N-linked glycosylation in EpCAM affected cell adhesion in breast cancer cells. Biol Chem 2017; 398 (10): 1119–26.
  • 5. Balzar M, Winter MJ, de Boer CJ, Litvinov SV. The biology of the 17–1A antigen (Ep-CAM). J Mol Med 1999; 77 (10): 699–712.
  • 6. Casaletto JB, Geddie ML, Abu-Yousif AO, et al. MM-131, a bispecific anti-Met/EpCAM mAb, inhibits HGF-dependent and HGF-independent Met signaling through concurrent binding to EpCAM. Proc Natl Acad Sci USA 2019; 116 (15): 7533–42.
  • 7. Kuan II, Lee CC, Chen CH, et al. The extracellular domain of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) enhances multipotency of mesenchymal stem cells through EGFR-LIN28-LET7 signaling. J Biol Chem 2019; 294 (19): 7769–86.
  • 8. Carneiro FP, Muniz-Junqueira MI, Carneiro MV, et al. Anti-EpCAM antibodies for detection of metastatic carcinoma in effusions and peritoneal wash. Oncol Lett 2019; 18 (2): 2019–24.
  • 9. Pauli C, Munz M, Kieu C, et al. Tumor-specific glycosy­lation of the carcinoma-associated epithelial cell adhesion molecule EpCAM in head and neck carcinomas. Cancer Lett 2003; 193 (1): 25–32.
  • 10. Baeuerle PA. Gires O. EpCAM (CD326) finding its role in cancer. Br J Cancer 2007; 96 (3): 417–23.
  • 11. Osta WA, Chen Y, Mikhitarian K, et al. EpCAM is overexpressed in breast cancer and is a potential target for breast cancer gene therapy. Cancer Res 2004; 64 (16): 5818–24.
  • 12. Wen KC, Sung PL, Chou YT, et al. The role of EpCAM in tumor progression and the clinical prognosis of endometrial carcinoma. Gynecol Oncol 2018; 148 (2): 383–392.
  • 13. Heideman DA, Snijders PJ, Craanen ME, et al. Selective gene delivery toward gastric and sophageal adenocarcinoma cells via EpCAM-targeted adenoviral vectors Cancer Gene Ther 2001; 8 (5): 342–51.
  • 14. Fong D, Steurer M, Obrist P, et al. Ep-CAM expression in pancreatic and ampullarycarcinomas: frequency and prognostic relevance. J Clin Pathol 2008; 61: 31–35.
  • 15. Dhayat S, Sorescu S, Vallböhmer D, et al. Prognostic significance of EpCAM-positive disseminated tumor cells in rectal cancer patients with stage I disease. Am J Surg Pathol 2012; 36 (12): 1809–16.
  • 16. Varga M, Obrist P, Schneeberger S, et al. Overexpression of epithelial cell adhesionmolecule antigen in gallbladder carcinoma is an independent marker for poor survival.Clin Cancer Res 2004; 10: 3131–36.
  • 17. Spizzo G, Went P, Dirnhofer S, et al. Overexpression of epithelial cell adhesionmolecule (Ep-CAM) is an independent prognostic marker for reduced survival ofpatients with epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 2006; 10: 483–88.
  • 18. Maetzel D, Denzel S, Mack B, et al. Nuclear signalling by tumour-associated antigenEpCAM. Nat Cell Biol 2009; 11: 61–71.
  • 19. Gao J, Liu X, Yang F et al. By inhibiting Ras/Raf/ERK and MMP-9, knockdown of EpCAM inhibits breast cancer cell growth and metastasis. Oncotarget 2015: 6 (29): 27187–98.
  • 20. Gong Y, Liu YR, Ji P, et al. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Sci Rep 2017; 27 (7): 45411–21.
  • 21. Prado-Vázquez G, Gámez-Pozo A, Trilla-Fuertes L, et al. A novel approach to triple-negative breast cancer molecular classification reveals a luminal immune-positive subgroup with good prognoses. Sci Rep 2019; 9 (1): 1538–50.
  • 22. Prat A, Pineda E, Adamo B, et al. Clinical implications of the intrinsic molecular subtypes of breast cancer. Breast 2015; 24: 26–35.
  • 23. Jiang Z, Deng T, Jones R, et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. J Clin Invest 2010; 120 (9): 3296–309.
  • 24. Shulman M, Wilde CD, Kohler G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature 1978; 276: 269–70.
  • 25. Munz M, Kieu C, Mack B, et al. The carcinoma-associated antigen EpCAM upregulates c-myc and induces cell proliferation. Oncogene 2004; 23 (34): 5748–58.
  • 26. Spizzo G, Gastl G, Obrist P, et al. Methylation status of the Ep-CAM promoter regionin human breast cancer cell lines and breast cancer tissue. Cancer Lett 2007; 246: 253–61.
  • 27. Chen Y, Liu L, Guo Z, et al. Lost expression of cell adhesion molecule 1 is associated with bladder cancer progression and recurrence and its overexpression inhibited tumor cell malignant behaviors. Oncol Lett 2019; 17 (2): 2047–56.
  • 28. Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 (14): 8418–23.
  • 29. Curtis C, Shah SP, Chin SF, et al. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature 2012; 486 (7403): 346–52.
  • 30. Fan J, Tatum R, Hoggard J, Chen YH. Claudin-7 Modulates Cl- and Na+ Homeostasis and WNK4 Expression in Renal Collecting Duct Cells. Int J Mol Sci 2019; 20 (15): 3798–812.
  • 31. Tummala R, Wolle D, Barwe SP, et al. Expression of Na,K-ATPase-beta(1) subunit increases uptake and sensitizes carcinoma cells to oxaliplatin. Cancer Chemother Pharmacol 2009; 64 (6): 1187–94.
  • 32. Kedves AT, Gleim S, Liang X, et al. Recurrent ubiquitin B silencing in gynecological cancers establishes dependence on ubi­quitin C. J Clin Invest 2017; 127 (12): 4554–568.

Адреса для листування:
Ковалевська Л.М.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького
НАН України
E-mail: kreyl@yahoo.com

Одержано: 12.09.2019


Без коментарів » Додати коментар