ОСОБЛИВОСТІ ФОРМУВАННЯ ЯВИЩА КОМУТАГЕНЕЗУ В ОПРОМІНЕНИХ КЛІТИНАХ ОНКОЛОГІЧНИХ ХВОРИХ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-4-2021-g.9979

З’ясування закономірностей формування явища комутагенезу в опромінених клітинах людини має фундаментальне та практичне значення, оскільки пов’язане з механізмами радіаційно-індукованого мутагенезу, канцерогенезу та формуванням генетичної нестабільності клітин [1–4]. Небезпека сполук комутагенів полягає в тому, що, не проявляючи власної мутагенної активності, вони можуть суттєво модифікувати, а саме потенціювати ефекти деяких мутагенів хімічної природи [5]. Існує припущення, що комутагенні ефекти опосередковані декількома механізмами, але при цьому питання стосовно участі репараційних процесів у формуванні зазначених ефектів залишається відкритим. Такий стан зазначеної проблеми почасти можна пояснити тим, що препарати з комутагенними властивостями не виявляються при генотоксичному скринінгу, але при цьому здатні суттєво підсилювати вплив відомих хімічних мутагенів [6, 7]. Особливу небезпеку серед потенційних комутагенів становлять лікарські засоби, наприклад, блокатор кальцієвих каналів верапаміл (Вп) та антиоксидант аскорбінова кислота (АК). Прояв комутагенних властивостей Вп та АК спостерігали в дослідженнях з низкою агентів хімічної природи, у тому числі вермектином, миш’яком, цисплатином [8–10]. Поглиблене вивчення впливу комутагенів на радіочутливість соматичних клітин людини пов’язане з Чорнобильською катастрофою, внаслідок якої хронічне низькодозове опромінення — екологічний фактор, який постійно справляє вплив на окремих радіаційно забруднених територіях, що призводить до дестабілізації геному людини [1]. Це також стосується контингенту осіб, що працюють на атомних електростанціях, медичних працівників (рентгенологів, радіологів), професійно пов’язаних із джерелами іонізуючого випромінювання. До цього часу не визначено особ­ливості впливу комутагенів на формування променевих ефектів у соматичних клітинах людини, а також у здорових клітинах хворих, що оточують опромінювану пухлину.

У якості радіобіологічної основи для виконання цих досліджень пропонується тест-система культури лімфоцитів периферичної крові (ЛПК) людини з метафазним методом аналізу аберацій хромосом, що дозволяє моделювати явище комутагенезу за різних експериментальних умов, у тому числі залежно від ступеня радіочутливості [11]. Вибір цієї моделі аргументовано високою чутливістю лімфоцитів до дії мутагенів, наявністю специфічних до дії іонізуючої радіації (ІР) хромосомних перебудов [12], які визнано біологічними маркерами підвищеного канцерогенного ризику [13, 14].

Актуальним є питання визначення особливостей впливу комутагенів на геном немалігнізованих клітин пацієнтів зі злоякісними новоутвореннями. Це обґрунтовано більш високою чутливістю цих клітин до дії мутагенних факторів, оскільки прогресування пухлинного процесу пов’язане з появою нових мутаційних подій, відображенням яких є збільшення генетичних порушень внаслідок пригнічення процесів репарації за рахунок імунодепресії організму онкологічних хворих [1]. Відкритими питаннями, відповідь на які допоможе попередити розвиток стохастичних ефектів опромінення та променевих ускладнень у здорових клітинах, що оточують опромінювану пухлину, залишаються залежність прояву комутагенних ефектів від радіочутливості клітин, ступеня променевого навантаження, концентрації комутагенів.

Мета роботи: визначення особливостей формування радіаційно-індукованих аберацій хромосом у ЛПК людини за умов комутагенної модифікації (дослідження in vitro).

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом для виконання цитогенетичних досліджень були Т-лімфоцити периферичної крові 24 первинних онкогінекологічних хворих (рак тіла матки, рак шийки матки), віком 32–50 років (група дослідження) та 67 умовно здорових осіб віком 25–40 років (група порівняння). У роботі керувалися положенням Хельсінкської декларації Всесвітньої медичної асоціації (2008 р.), яка передбачає інформовану згоду пацієнтів на участь у проведенні відповідних досліджень.

Цитогенетичні методи: виділення з периферичної крові Т-лімфоцитів та подальше культивування ЛПК проводили за стандартним протоколом [15] напівмікрометодом з деякими модифікаціями впродовж 52 та 72 год (з урахуванням радіочутливості клітин здорових осіб та онкологічних хворих). Мета­фазний аналіз аберацій хромосом виконували з груповим каріотипуванням і враховували частоту аберантних клітин, загальну частоту аберацій хромосом, частоту аберацій хроматидного та хромосомного типів. Аналізували в середньому 200–300 метафаз на одне цитогенетичне спостереження. У якості додаткового показника дослідили проліферативну активність ЛПК — мітотичний індекс.

Опромінення культури клітин здійснювали на рентгенівській установці «РУМ-17» (МОСРЕНТГЕН, СРСР) у Національному інституті раку МОЗ України за наступних умов: сила струму — 10 мА, напруга — 180 кВ, фільтр 0,5 Cu, потужність дози — 0,89 Гр/хв, діапазон доз — 0,3; 0,5; 1,0 та 2,0 Гр на 0 год інкубації ЛПК (G₀-стадії клітинного циклу).

Умови введення комутагенів. У якості потенційних комутагенів обрано препарати профілактично-лікувального призначення: блокатор кальцієвих каналів Вп та антиоксидант АК. Комутагени вводили в культуру лімфоцитів безпосередньо після опромінення у терапевтичних концентраціях: Вп — 1,0 мкг/мл крові, АК — 20,0 мкг/мл крові; Вп вводили також у концентраціях, що перевищували значення терапевтичної дози в 1,5; 2,0 та 4,0 раза, а АК — в 2,0 та 4,0 раза відповідно.

Молекулярні методи. Дослідження мікросателітної нестабільності ДНК ЛПК виконували методом Inter-Simple Sequence Repeats полімеразно-ланцюгової реакції (ISSR-ПЛР). ДНК виділяли з цільної гепаринізованої крові. Аналіз продуктів ампліфікації здійснювали за допомогою електрофорезу в 1,7% агарозному гелі. Розмір ампліконів визначали за допомогою маркерів молекулярної маси Gene Ruler 100 bp DNA ladder plus з діапазоном 100–3000 п.н. (MBI Fermentas, Литва).

Імуноцитохімічні методи. Для дослідження процесів апоптозу в ЛПК хворих онкологічного профілю виконували подвійне імуноцитохімічне забарвлення антитілами до маркера апоптотичних ядер каспази-3 та флуоресцентного ядерного барвника Hoechst 33342. Аналіз забарвлених ЛПК проводили за допомогою лазерного скануючого конфокального мікроскопа «FluoView FV1000» (Olympus Inc., США).

Статистичні методи. Під час порівняння середніх значень цитогенетичних показників використовували t-критерій Стьюдента. Статистично значущими вважали відмінності з вірогідністю не менше 95% (р <0,05). Математичну обробку даних проведено за допомогою пакетів прикладних програм Microsoft Excel 2010, SPSS 17.

Для орієнтовної оцінки комутагенних ефектів залежно від доз діючих чинників обраховували коефіцієнт комутагенної модифікації (ККМ), який визначали за формулою: ККМ = (М₁ — М₂)/М₂·100 [6], де M₁ — загальна частота радіаційноіндукованих аберацій хромосом в ЛПК за умови додаткового впливу комутагену (Вп або АК); М₂ — загальна частота радіаційно індукованих аберацій хромосом.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитогенетичний аналіз ЛПК первинних онкологічних хворих, проведений до початку протипухлинної терапії, продемонстрував підвищення вихідного рівня хромосомних мутацій порівняно з показниками контрольної групи (~ в 3 рази), що свідчить про формування хромосомної нестабільності в клітинах внаслідок злоякісного пухлинного процесу як джерела окисного стресу та імунодепресивного стану організму [16]. Препарат Вп у концентраціях 1,0 та 4,0 мкг/мл крові істотно не впливав на величину і спектр вихідного рівня аберацій хромосом у ЛПК хворих онкологічного профілю і становив 6,0 ± 0,7 та 6,0 ± 1,0/100 метафаз відповідно.

Результати модифікуючої дії Вп (1,0 і 4,0 мкг/мл) на опромінені (0,3 Гр) ЛПК онкологічних хворих були неоднозначними та залежали від концентрації препарату. Встановлено, що під впливом Вп у концентрації 1,0 мкг/мл рівень радіаційно індукованих пошкоджень хромосом знижувався в 1,3 раза (рис. 1). Але підвищення концентрації Вп до 4,0 мкг/мл, навпаки, зумовило зростання загальної частоти хромосомних перебудов порівняно з променевим ефектом (ККМ становив 20,0%). Таким чином, з підвищенням концентрації препарат Вп здатний проявляти комутагенну активність в опромінених немалігнізованих клітинах хворих онкологічного профілю.

Шляхом імуноцитохімічного аналізу встановлено, що під час опромінення низькою дозою та додаткової дії Вп у концентраціях 1,0 та 4,0 мкг/мл на ЛПК онкологічних хворих найбільша кількість каспаз-3-позитивних ядер цих клітин спостерігається за дії комутагену в концентрації 1,0 мкг/мл. Припускаємо, що внаслідок комбінованої дії ІР (0,3 Гр) та Вп (1,0 мкг/мл) частина ЛПК, ядра яких найбільш навантажені структурними пошкодженнями, елімінуються шляхом апоптозу і, як результат, зменшується кількість клітин з абераціями хромосом порівняно з ефектом опромінення. Зниження рівня радіаційно індукованих хромосомних перебудов, яке спостерігається під дією Вп в концентрації 1,0 мкг/мл, може бути пов’язане з активацією каспази-3, яка, у свою чергу, запускає каскад реакцій, результатом яких є загибель клітин [17]. Оскільки апоптоз ініціюється за рахунок підвищеного рівня іонів кальцію в клітинах, Вп (4,0 мкг/мл) інгібує його надходження в клітини, внаслідок чого кількість каспаз-позитивних ядер в опромінених ЛПК зменшується, що зумовлює формування комутагенного ефекту цього препарату (рис. 2).

Встановлено, що АК також, як і Вп, не впливає на вихідний рівень аберацій хромосом у неопромінених ЛПК онкологічних хворих (рис. 3). Характер комбінованої дії ІР в низьких дозах (0,3 Гр) і АК (20,0 та 80,0 мкг/мл) на ЛПК онкологічних хворих та здорових осіб в аналогічних модельних дослідженнях був різним. При опроміненні in vitro лімфоцитів крові хворих у низькій дозі (0,3 Гр) і додатковій дії АК (20,0 і 80,0 мкг/мл) встановлено комутагенний ефект — підвищення частоти аберацій в 1,7–1,4 раза порівняно з променевим ефектом (19,0 ± 0,5 (p <0,05) та 15,0 ± 0,7 (p <0,05) проти 11,0 ± 0,4) (див. рис. 3). В опромінених (0,3 Гр) ЛПК відносно здорових осіб АК в концентрації 20 мкг/мл проявляла радіопротекторну дію, в концентрації 40 і 80 мкг/мл — комутагенний ефект (рис. 4). Комутагенний ефект АК формується в основному за рахунок аберацій хромосомного типу. Варто звернути увагу на те, що в опромінених клітинах онкологічних хворих найбільше підвищення частоти аберацій хромосом спостерігалося за додаткової дії АК в терапевтичній концентрації. Тобто замість очікуваного радіопротекторного ефекту ми спостерігаємо комутагенний ефект з коефіцієнтом модифікації 72,7%, який пов’язуємо з підвищеною радіочутливістю клітин хворих онкологічного профілю.

Беручи до уваги тісний зв’язок між розвитком злоякісного процесу та мікросателітною нестабільністю (МСН) ДНК [18], дослідили вплив комутагену АК (20,0 та 80,0 мкг/мл) на формування МСН ДНК в опромінених немалігнізованих клітинах онкологічних хворих. ISSR-ПЛР аналіз зразків крові первинних онкологічних хворих показав, що 4 праймери із 6 досліджених виявилися мономорфними (GA)9C; (AC)8G; (AC)8C; (GACA)4 до комбінованої дії малих доз ІР (0,3 Гр) та АК (20,0; 80,0 мкг/мл). Відмінності між досліджуваними зразками крові хворих проявляються при використанні двох інших праймерів, що містили повтор (AG)8 (рис. 5а та 5б).

Встановлено, що у підтримці стабільності геному важливу роль відіграє система репарації неканонічних пар нуклеотидів у ДНК («mismatch repair») [14]. Відмінності в патернах фрагментів ампліфікації з праймерами (AG)8Т та (AG)8CT в порівнянні з контрольними показниками вказують на вплив комутагену АК на реорганізацію нуклеотидної послідовності ДНК. На відміну від цього ISSR-ПЛР-аналіз зразків крові в контрольній групі (здорових донорів) показав, що всі зразки, окрім контрольного, виявилися мономорфними за дослідженими праймерами. Таким чином, уперше виявлена МСН ДНК внаслідок комутагенної дії АК на опромінені в низькій дозі ЛПК онкологічних хворих, що може свідчити про порушення системи репарації помилково спарених нуклеотидів.

Показано, що Вп (1,0 та 4,0 мкг/мл) підвищує мітотичний індекс ЛПК онкологічних хворих в 1,2 та 1,3 раза відповідно. Однак при опроміненні в низьких дозах (0,3 Гр) за рахунок додаткового впливу Вп у високій концентрації (4,0 мкг/мл) мітотичний індекс ЛПК пригнічується в 1,2 раза порівняно з променевим ефектом та в 1,4 раза — з інтактним контролем (рис. 6а). АК незалежно від концентрації підвищує мітотичний індекс як в інтактних, так і в опромінених ЛПК онкологічних хворих, в 2,0 раза порівняно з променевим ефектом та в 1,6 раза — із контролем (рис. 6б).

Одержані результати дають підстави вважати, що комутагенні ефекти Вп та АК в опромінених ЛПК здорових осіб та онкологічних хворих формуються також за рахунок посиленої проліферації клітин, внаслідок чого скорочується час для репарації променевих пошкоджень. Такий механізм спричиняє реалізацію первинних радіаційно-індукованих пошкоджень у хромосомні аберації.

Таким чином, формування комутагенних ефектів в опромінених клітинах людини залежить як від величини дози ІР, ступеня радіочутливості клітин, так і від концентрації препаратів з комутагенною активністю та специфіки їх дії. В основі явища комутагенезу, що розвивається в опромінених здорових клітинах онкологічних хворих, у тому числі лімфоцитах циркулюючого пулу крові, лежать процеси формування хромосомної та мікросателітної нестабільності, апоптоз, стимуляція проліферації клітин.

ВИСНОВКИ

1. При опроміненні (0,3 Гр) лімфоцитів крові онкологічних хворих в АК проявляє комутагенні властивості, підвищуючи частоту аберацій хромосом, в терапевтичній концентрації (20 мкг/мл), а Вп — у підвищеній концентрації (4,0 мкг/мл крові).

2. З підвищенням концентрації АК (20,0; 40,0; 80,0 мкг/мл) та Вп (1,0; 1,5; 2,0 та 4,0 мкг/мл) здійснюють стимулювальний вплив на мітотичну активність опромінених ЛПК онкологічних хворих.

3. На підставі проведеного ISSR-ПЛР-аналізу вперше встановлено, що в механізмах формування комутагенних ефектів АК в опромінених ЛПК хворих певну роль відіграють порушення системи репарації помилково спарених нуклеотидів, що зумовлюють зміни в структурній організації ДНК (мікросателітна нестабільність).

4. В основі явища комутагенезу, що розвивається в опромінених ЛПК онкологічних хворих, лежать процеси формування хромосомної та мікросателітної нестабільності, апоптоз, стимуляція проліферації клітин.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

З метою запобігання віддаленим променевим ускладненням терапевтичного опромінення онкологічних хворих, у тому числі виникненню вторинних пухлин радіаційного генезу, рекомендується впровадження розробленого авторами статті Способу оцінки канцерогенної небезпеки за умов поєднаної дії малих доз іонізуючої радіації та препаратів з комутагенними властивостями у практику онкологічних закладів (інформаційній лист МОЗ України № 202-2015, Київ, МОЗ України; Укрмедпатент­інформ, 2015).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Domina EA. Radiogenic cancer: Epidemiology and primary prevention. Kyiv: Naukova dumka, 2016. 196 p (in Russian).
• 2. Domina EA, Pylypchuk OP, Mikhailenko VM. Destabilization of human cell genome under the combined effect of radiation and ascorbic acid. Exp Oncol 2014; 36 (4): 236–40.
• 3. Domina EA, Pylypchuk OP, Mikhailenko VM. The modifying effect of co-mutagens on the frequency and spectrum of radiation-induced chromosome aberrations in human cells. Pharm Anal Acta 2015; 6: 377.
• 4. Morgan WF, Sowa MB. Non-targeted effects induced by ionizing radiation: mechanisms and potential impact on radiation induced health effects. Cancer Lett 2015; 356 (1):17–21.
• 5. Durnev AD, Seredenin SB. Co-mutagenesis as new vistas in genotoxicology. Bull Exp Biol Med.2003; 135 (6): 513–20.
• 6. Durnev AD, Daugel-Dauge NO, Zhanataev AK, et al. Comutagenic effects of valocordin. Ecol Genet 2012; 10 (3): 53–8 (in Russian).
• 7. Ashraf AA, Shakoori AR. Cytotoxic and genotoxic effects of arsenic on primary human breast cancer cell lines. Pakistan J Zool 2015; 47 (1): 79–87.
• 8. Grujicic D, Milosevic-Djordjevic O, Arsenijevic S, Marinković D. Treatment of pregnant women with a beta mime­tic and verapamil increases the micronuclei frequency in umbilical cord blood lym phocytes. Tohoku J Exp Med 2008; 215 (4): 363–71.
• 9. Ashmawy IM, Nahas AF., Bayad AE. Teratogenic and cytogenetic effects of ivermectin and its interaction with P-glycoprotein inhibitor. Res Vet Sci 2011; 90 (1): 116–23.
• 10. Konopacka M. Rogolinski J. Clastogenic effects in human lymphocytes exposed to low and high dose rate X-ray irradiation and vitamin C. Nukleonika 2011; 56 (4): 253–7.
• 11. Demina EA, Pilinskaya MA, Petunin YuI, et al. Radiation cytogenetics: Russian-English dictionary-reference book. Kyiv: Zdorov’ya, 2009. 386 p (in Russian).
• 12. Sevankaev AV, Parshin VS, Mikhailova GF, et al. Comparative analysis of cytogenetic parameters with the morpho-functional state of the thyroid gland in children and adolescents living since the accident at the Chernobyl nuclear power plant in the territories of the Oryol and Kaluga regions contaminated with radionuclides. Radiat Risk 2006; 15 (1–2): 134–45 (in Russian).
• 13. Hagmar L, Strömberg U, Bonassi S, et al. Impact of types of lymphocyte chromosomal aberrations on human cancer risk: results from Nordic and Italian cohorts. Cancer Res 2004; 64 (6): 2258–63.
• 14. Joyner MS, Kogel O. Fundamentals of clinical radiobio­logy. Moscow: Binom. 2013. 600 р (in Russian).
• 15. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. Vienna: IAEA, 2011. 232 p.
• 16. Thompson SL, Compton DA. Chromosomes and cancer cells. Chromosome Res 2011; (19): 433–44.
• 17. Mazurkevich TA, Akseninko AV. Apoptosis and its mechanisms (review). Scientific works of the Southern branch of the National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine 2013; (155): 309–16 (in Ukrainian).
• 18. Sinicrope FA, Sargent DJ. Molecular pathways: microsa­tellite instability in colorectal cancer: prognostic, predictive, and therapeutic implications. Clin Cancer Res 2012; 18 (6): 1506–12.

Адреса для листування:
Дьоміна Е.А.
Київ, 03022, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: edjomina@ukr.net

Одержано: 30.05.2021