АБЕРАЦІЇ ХРОМОСОМ В ОНКОЛОГІЧНИХ ХВОРИХ НА ПОЧАТКОВОМУ ЕТАПІ ПРОМЕНЕВОЇ ТЕРАПІЇ НА АПАРАТІ РОКУС-АМ ТА ЛІНІЙНОМУ ПРИСКОРЮВАЧІ CLINAC 600C

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-2-2019-g.7165

ВСТУП

Сучасне лікування хворих онкологічного профілю проводиться із застосуванням різних методів, серед яких променева терапія (ПТ) займає одне з головних місць [1]. Одним із пріоритетів сучасної протипухлинної терапії, в тому числі і ПТ, є подов­ження тривалості життя пацієнтів та покращення його якості. Для цього вкрай необхідним є вивчення та оцінка ранніх та віддалених ефектів ПТ. Дія іонізувального випромінювання має низку негативних наслідків для організму людини — променеві реакції, вторинний канцерогенез та ін. Прагнення запобігти генотоксичному впливу терапевтичного опромінення на непухлинні тканини або зменшити його сприяє модернізації існуючого та розробці нового обладнання, у якому використовуються нові джерела випромінювання [2]. Тому постає необхідність розширення уявлень про ефекти ПТ з урахуванням багатьох змінних (джерело випромінювання, об’єм опроміненої ділянки тіла, строки дослідження), які безпосередньо впливають на стан організму. ПТ з використанням джерел випромінювання з високою лінійною передачею енергії лише набуває активного застосування та вивчення. При цьому випромінювання з низькою лінійною передачею енергії, наприклад гамма-терапія ⁶⁰Co (ГТ) та мегавольтна променева терапія (МПТ) на лінійному прискорювачі, сьогодні широко застосовуються у лікуванні. Проте багато аспектів, що стосуються впливу та наслідків даного виду ПТ, потребують більш поглибленого і детального дослідження. Однак існує не так багато досліджень, присвячених вивченню змін цитогенетичних показників у хворих онкологічного профілю впродовж курсу променевого лікування. Доволі часто рівень аберацій хромосом вивчали до початку ПТ та по завершенню терапевтичного опромінення [3, 4]. Якщо дослідження проводилися безпосередньо під час променевого лікування, то це переважно стосувалося більш пізніх його етапів. Є невелика кількість робіт, в яких вивчали цитогенетичні ефекти радіаційного впливу після отримання кількох перших сеансів ПТ, однак це в основному дослідження біодозиметричного характеру, де автори тестували різні підходи до розрахунків отриманих доз за частотою аберацій хромосом [5]. Показано, що у хворих з пухлинами голови та шиї після першого сеансу ПТ розподіл обмінних аберацій по клітинах за u-тестом Папворта був наддисперсним [6]. У дослідженнях також зазначається важливість врахування такого параметра, як розмір поля опромінення, для біодозиметричної оцінки дози [7]. У хворих на рак легені (РЛ), шийки матки і хребта на початковому етапі променевого лікування розподіл дицентриків змінювався залежно від ділянок впливу іонізувального випромінювання [8]. Однак вихід цитогенетичних пошкоджень та подальша інтерпретація отриманих даних залежать від багатьох факторів, а саме локальності опромінення, обсягу опроміненої ділянки тіла, джерела випромінювання. Водночас дослідження з метою зіставити генотоксичні ефекти у хворих онкологічного профілю з урахуванням локалізації пухлини та джерела випромінювання є рідкісними. Усе це зумовлює необхідність подальших досліджень, зокрема на початкових етапах ПТ, для можливості коректно оцінити ступінь впливу терапевтичного опромінення на непухлинні клітини.

Метою даної роботи було визначення рівня аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові на початковому етапі променевого лікування хворих онкологічного профілю з пухлинами різних локалізацій (рак тіла матки (РТМ), РЛ, голови та шиї (РГШ)) залежно від джерела випромінювання.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для проведення цього дослідження відібрано 45 хворих з пухлинами різних локалізацій, лікування яким надавали у відділі радіології та відділенні онкогінекології ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор’єва НАМН України». ПТ проводили із застосуванням апарата РОКУС-АМ із середньою енергією випромінювання 1,25 МеВ або лінійного прискорювача Clinac 600C з енергією фотонного випромінювання 6 МеВ. При цьому разова вогнищева доза дорівнювала 1,8–2,0 Гр. Усі пацієнти надали інформовану згоду на використання їх біологічних матеріалів у дослідницьких цілях.

Група онкогінекологічних хворих віком від 44 до 68 років (середній вік 59 років), яким було діа­гностовано РТМ I–III (T1–2N0–1M0) стадії, налічувала 21 пацієнтку, з яких 12 отримували ГТ і 9 — МПТ. До групи хворих на недрібноклітинний РЛ II–IV (T1–4N1–3M0–1) стадії увійшли 16 пацієнтів (14 чоловіків та 2 жінки) віком 53–79 років (середній вік 65,6 року), половині з яких проведено ГТ, а іншій половині — МПТ. У групі з 8 (7 чоловіків та 1 жінка) хворих із пухлинами голови та шиї за даними гістологічного аналізу підтверджено плоскоклітинний рак I–III стадії (T1–3N1M0). Вік пацієнтів становив від 55 до 84 років (середній вік 64,6 року). Серед них лікування за допомогою ГТ проводили у 2 пацієнтів, МПТ — у 6.

Забір венозної крові у пацієнтів здійснювали до початку ПТ та через 24 год після отримання ними першого сеансу (першої фракції).

Культивування лімфоцитів периферичної крові здійснювали за стандартною методикою [9]. Гепаринізовану кров вносили до культуральної суміші із вмістом середовищ Ігла та RPMI 1640 у співвідношенні 1:1, бромдезоксіуридину, сироватки великої рогатої худоби та фітогемаглютиніну. Клітини культивували протягом 50–54 год у термостаті за температури 37,5 °С. За 4 год до завершення культивування вносили розчин колхіцину. Розчин KCl використовували для гіпотонічної обробки, після якої фіксували метафазні клітини сумішшю метанолу і крижаної оцтової кислоти. Предметне скло з нанесеною суспензією клітин висушували при кімнатній температурі та забарвлювали за технікою Гімзи або флуоресцентного-плюс-Гімзи (FPG) методу [9].

Під час аналізу кодованих препаратів використовували світлові мікроскопи Axioskop, Micros MC300Х та Olympus BX43 з масляною імерсією та систему пошуку зображень. При розпізнаванні цитогенетичних перебудов та контролі клітинного циклу застосовували загальноприйняті критерії [9].

Аналізуючи метафазні препарати реєстрували весь спектр аберацій хромосом, які розпізнавалися в аберантних клітинах. У роботі наведено дані для аберацій хромосомного типу (А Хс_unst), серед яких враховували дицентричні хромосоми (Диц), вільні ацентричні хромосомні фрагменти (Ац Фр).

Середні рівні (Y) аберантних клітин та аберацій хромосом визначали у розрахунку на 100 проаналізованих нормоплоїдних клітин. Стандартні похибки середніх рівнів цитогенетичних порушень (SE) обчислювали, виходячи з дисперсії поклітинних розподілів аберацій (σ²) в об’єднаних вибірках метафаз. За відношенням дисперсії до середнього (σ²/Y) та за u-тестом Папворта (u) оцінювали відповідність розподілу структурних аберацій хромосом по клітинах статистиці Пуассона і рандомізованість розподілу частот цитогенетичних пошкоджень [10]. Вірогідність різниці між середніми значеннями цитогенетичних показників визначали за t-критерієм Стьюдента [11].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Індивідуальні дані дослідження об’єднували у вибірки залежно від локалізації пухлини та джерела випромінювання, яке застосовували при ПТ. Рівень цитогенетичних пошкоджень визначали до початку лікування та після отримання першого сеансу ГТ або МПТ. Як і у наших попередніх дослідженнях [12], було показано, що рівень цитогенетичних пошкоджень у лімфоцитах периферичної крові хворих зі злоякісними пухлинами до початку ПТ вірогідно перевищував такий (спонтанні пошкодження) у практично здорових осіб (30 донорів).

У хворих на РТМ вже після першої фракції опромінення спостерігали достовірне зростання цитогенетичних порушень хромосомного типу у зіставленні зі значеннями до початку ПТ (табл. 1). Це стосувалося як пацієнток, що отримували ГТ, так і хворих за дії МПТ. Темпи зростання показників були ідентичними для обох джерел випромінювання, що зумовило відсутність вірогідної різниці між різними видами ПТ. Так, порівняно з обстеженням до опромінення середній рівень А Хс_unst в підгрупах ГТ та МПТ підвищився у 2,7 раза (t = 9,07, t = 8,70 відповідно; p < 0,001 для обох підгруп). Частота Диц зросла у 9,4 та 8,5 раза (t = 9,25, t = 8,49 відповідно; p < 0,001 для обох підгруп), Ац Фр — у 1,7 та 1,8 раза (t = 4,00, t = 4,40 відповідно; p < 0,001 для обох підгруп). При цьому темпи зростання показників для Диц були вищими, ніж для Ац Фр. До початку ПТ співвідношення Диц і Ац Фр дорівнювало 1,0 : 7,1, після першого сеансу ПТ — 1,0 : 1,3 у групі ГТ та 1,0 : 1,5 — у групі МПТ.

Примітка до табл. 1 і табл. 2: аналогічні показники практично здорових донорів 0,5–1,5 та 0,05–0,1 на 100 клітин [12].

У хворих на РЛ спостерігали схожу картину (табл. 2). Після першого сеансу ПТ вірогідно підвищувалася як сумарна частота А Хс_unst, так і частота їх окремих видів у порівнянні з допроменевими значеннями. При цьому схожа швидкість зростання радіаційно-індукованих пошкоджень при обох видах застосованої ПТ не забезпечила вірогідних розбіжностей між підгрупами ГТ та МПТ. Загальний рівень А Хс_unst підвищувався у 2,9 та 2,6 раза відповідно (t = 5,48, t = 5,95; p < 0,001 для обох підгруп). Зростання рівня Диц відбувалося з вищою інтенсивністю, ніж рівня Ац Фр. Так, у підгрупі ГТ підвищення Диц становило 4,1 раза, у підгрупі МПТ — 4,5 раза (t = 4,42, t = 4,85; p < 0,001 для обох підгруп). Приріст Ац Фр від початку лікування до першої фракції ПТ в обох підгрупах був однаковим і дорівнював 1,8 раза (відповідно t = 2,05, p < 0,05; t = 2,90, p < 0,01). До початку ПТ співвідношення рівня Диц і Ац Фр сягало 1,0 : 3,3, після першої фракції — 1,0 : 1,3 у підгрупі ГТ та 1,0 : 1,5 — у підгрупі МПТ.

Для з’ясування впливу розміру опроміненої ділянки тіла на частоту цитогенетичних пошкоджень було проведено зіставлення даних дослідження на ранніх етапах променевого лікування хворих з пухлинами різних локалізацій (табл. 3). Для цього, окрім хворих на РТМ та РЛ, додатково були обстежені пацієнти з РГШ.

У всіх групах пацієнтів направленість формування цитогенетичних перебудов була подібною. При цьому після першої фракції розподіли індивідуальних частот суми нестабільних аберацій по клітинах були наддисперсними щодо статистики Пуассона (для групи РТМ: σ²/Y = 1,33, u = 18,33; для групи РЛ: σ²/Y = 1,16, u = 5,81; для групи РГШ: σ²/Y = 1,53, u = 18,62), що свідчить про локальність опромінення [13]. Проте порівняльний аналіз виявив певні відмінності в інтенсивності утворення аберацій хромосомного типу після отримання першої фракції дистанційної ПТ. Встановлено, що рівень А Хс_unst у групі РТМ вірогідно відрізнявся від значення цього показника у групах РЛ та РГШ (t = 4,07 та t = 5,25 відповідно; p < 0,001 для обох груп). Підвищення нестабільних хромосомних аберацій відбувалося як за рахунок обмінних, так і фрагментних аберацій. Для Диц та Ац Фр також спостерігали вірогідне перевищення їх рівнів у пацієнток онкогінекологічного профілю при зіставленні з даними у хворих на РЛ та РГШ (для групи РЛ: t = 2,96, p < 0,01 та t = 3,40, p < 0,001 відповідно; для групи РГШ: t = 3,00, p < 0,01 та t = 4,03, p < 0,001 відповідно). Слід зазначити, що темпи приросту А Хс_unst у групах РТМ, РЛ та РГШ були такими, що співвідношення нестабільних аберацій хромосом після першого сеансу залишалося майже незмінним та дорівнювало 1,0 : 0,67 : 0,57.

Таким чином, аналіз аберацій хромосомного типу на початковому етапі ПТ показав високу інформативність цитогенетичного дослідження для детекції як самого факту іонізувального випромінювання, так і його локальності. При цьому для ГТ та МПТ на лінійному прискорювачі відразу після першого сеансу не виявлено вірогідних розбіжностей, які спостерігаються на більш пізніх етапах ПТ. Водночас отримані результати in vivo в онкологічних хворих вказують на залежність виходу радіаційно-індукованих хромосомних перебудов від локалізації пухлин. Так, показано достатньо виражений вплив об’єму опроміненої ділянки тіла вже після першого сеансу променевого лікування, про що свідчить вірогідна різниця значень досліджуваних цитогенетичних показників у хворих з найбільшим об’ємом опромінення, а саме онкогінекологічного профілю, у порівнянні з іншими групами пацієнтів.

В останні роки відбувається пошук та аналіз методів оцінки ранніх специфічних та неспецифічних ефектів радіаційного впливу на непухлинні тканини [14]. Як відомо, рівень аберацій хромосом зростає з підвищенням дози іонізувального випромінювання, що показано для випадків тотального опромінення та в експериментах in vitro. Що ж стосується характерного для ПТ локального, тим більше фракціонованого, опромінення, то виявлення наслідків дії радіаційного впливу та оцінка індивідуальної радіочутливості на ранніх етапах променевого лікування є важчими методологічно. Це ускладнюється насамперед досить невисоким рівнем хромосомних аберацій, утворення яких є стохастичним, щоправда не в усьому діапазоні доз. Тож закономірності, притаманні пізнім строках ПТ, не досить коректно екстраполювати на ранні етапи лікування.

Результати, отримані при виконанні цього дослідження, доповнюють відомості про цитогенетичні ефекти у хворих онкологічного профілю, зокрема на ранніх етапах променевого лікування, та є вкрай важливим для радіобіологічного супроводу ПТ.

ВИСНОВКИ

1. Під впливом опромінення на апараті РОКУС-АМ та лінійному прискорювачі у хворих на РТМ та РЛ вже після першого сеансу встановлено достовірне зростання рівня обмінних та фрагментних аберацій порівняно з допроменевими значеннями.
2. Після отримання першої фракції ПТ у групах РТМ та РЛ для частоти Диц не виявлено вірогідної різниці залежно від джерел променевого лікування. Однак для обох джерел випромінювання у хворих на РТМ рівень Диц зростав у середньому у 9,0, а у хворих на РЛ — у 4,5 раза. Швидкість утворення вільних Ац Фр була дещо нижчою за темпи зростання дицентриків. В обох групах хворих за дії ГТ та МПТ рівень Ац Фр підвищувався приблизно в 1,8 раза при зіставленні зі значеннями до початку променевого лікування.
3. Інтенсивність зростання цитогенетичних пошкоджень у хворих онкологічного профілю була різною залежно від локалізації пухлини. Встановлено вірогідну різницю для всіх радіаційно-специфічних пошкоджень хромосом у хворих групи РТМ у порівнянні з групами РЛ та РГШ. Співвідношення А Хс_unst для груп РТМ, РЛ та РГШ дорівнювало 1,0 : 0,67 : 0,57, що свідчить про вищий рівень аберацій хромосомного типу у хворих онкогінекологічного профілю, тобто з найбільшим об’ємом опроміненої ділянки тіла.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Thariat J, Hannoun-Levi JM, Sun Myint A, Vuong T, et al. Past, present, and future of radiotherapy for the benefit of patients. Nat Rev Clin Oncol 2013; 10 (1): 52–60.
• 2. Vinogradov VM. Perspective methods of radiation therapy. Practical Oncol 2007; 8 (1): 194–204 (in Russian).
• 3. Muller I, Geinitz H, Braselmann H, et al. Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 63 (4): 1214–20.
• 4. Tawn EJ, Whitehouse CA. Persistence of translocation frequencies in blood lymphocytes following radiotherapy: implications for retrospective radiation biodosimetry. J Radiol Prot 2003; 23 (4): 423–30.
• 5. Khvostunov IK, Kursova LV, Shepel NN, et al. The estimation of appropriateness of chromosomal aberration assay as a biological dosimetry based on cytogenetic investigation of lung cancer patients given non-uniform fractional exposures to high doses of therapeutic 60Co γ-rays. Radiat Biol Radioecol 2012; 52 (5): 467–80 (in Russian).
• 6. Roch-Lefevre S, Pouzoulet F, Giraudet AL, et al. Cytogenetic assessment of heterogeneous radiation doses in cancer patients treated with fractionated radiotherapy. Br J Radiol 2010; 83 (993): 759–66.
• 7. Fong L, Chen JY, Ting LL, et al. Chromosome aberrations induced in human lymphocytes after partial-body irradiation. Radiat Res 1995; 144 (1): 97–101.
• 8. Sreedevi B, Rao BS, Nagaraj H, Pal NK. Chromosome aberration analysis in radiotherapy patients and simulated partial body exposures: biological dosimetry for non-uniform exposures. Radiat Prot Dosim 2001; 94 (4): 317–22.
• 9. Cytogenetic dosimetry: applications in preparedness for and response to radiation emergencies 2011; Vienna: International Atomic Energy Agency. 229 p.
• 10. Higueras M, Gonzalez JE, Di Giorgio M, Barquinero JF. A note on Poisson goodness-of-fit tests for ionizing radiation induced chromosomal aberration samples. Int J Radiat Biol 2018; 94 (7): 656–63.
• 11. Atramentova LA, Utevskaya OM. Statistical methods in biology. Gorlovka: Vydavnytstvo Likhtar, 2008. 248 p. (in Russian).
• 12. Maznyk NO, Vinnikov VA, Mikhanovskyi OA, et al. Cytogenetic effects in patients with cervical and ovarian cancers undergoing radiation therapy. Ukr Radiol Zhurnal 2002; 10 (1): 32–6 (in Ukrainian).
• 13. Senthamizhchelvan S, Pant GS, Rath GK, et al. Biodosimetry using micronucleus assay in acute partial body therapeutic irradiation. Phys Med 2009; 25 (2): 82–7.
• 14. Dіomina EA, Ivankova VS. The individual radiation sensitivity of cancer patients: radiobiological and clinical aspects. Neoplasm 2012; 1–2 (9–10): 201–5 (in Ukrainian).

Адреса для листування:
Мазник Н.О.
61024, Харків, вул. Пушкінська, 82
ДУ «Інститут медичної радіології
ім. С.П. Григор’єва НАМН України»
E-mail: maznik.cytogen@mail.ru

Одержано: 24.05.2019