ЦИТОХІМІЧНЕ ТА ІМУНОЦИТОХІМІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ ТИРЕОЇДНОЇ ПЕРОКСИДАЗИ В ПЕРЕДОПЕРАЦІЙНІЙ ДІАГНОСТИЦІ ПАПІЛЯРНОГО РАКУ ЩИТОПОДІБНОЇ ЗАЛОЗИ ТА ЙОГО РАДІОЙОДОРЕЗИСТЕНТНИХ МЕТАСТАЗІВ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-3-2019-g.7925

Відомо, що тиреоїдна пероксидаза (ТПО) — фермент, розміщений на апікальній поверхні мікроворсинок клітин фолікулярного епітелію щитоподібної залози (ЩЗ). У численних дослідженнях встановлено, що ТПО каталізує процеси органіфікації та окисної конденсації, необхідні для утворення біологічно активних тиреоїдних гормонів — трийодтироніну і тироксину [1–4]. Зниження процесу органіфікації, яке здійснюється в результаті зменшення експресії ТПО, призводить до швидкого ефлюксу радіойоду з клітини та зменшує ефективність його акумуляції. Це може бути однією з причин розвитку радіойодорезистентності, яка є серйозною проблемою в діагностиці та лікуванні тиреоїдних папілярних карцином (ПК) [5–8]. Деякі дослідження свідчать, що експресія ТПО може бути не тільки маркером малігнізації тиреоїдних пухлин, але і прогностичним чинником їх клінічної поведінки. Продемонстровано зворотну залежність між рівнем експресії ТПО у тканині пухлини та стадією за ТNM [9, 10]. У біохімічних дослідженнях встановлено, що активність ТПО у злоякісних новоутвореннях ЩЗ значно знижена у порівнянні з доброякісними пухлинами та нормальною тиреоїдною тканиною. Редукція активності ТПО та її матричної рибонуклеїнової кислоти (мРНК) при диференційованій ПК становить 55–70% [11, 12]. Біохімічний метод — найточніший метод визначення активності ферменту. Але його неможливо пристосувати при цитологічній діагностиці, оскільки для здійснення біохімічного методу необхідна значна кількість матеріалу, якого виявляється недостатньо при проведенні тонкоголкової аспіраційної пункційної біопсії (ТАПБ).

За допомогою антитіл до ТПО визначається експресія ензиму в нормальних тканинах та доброякісних новоутвореннях, але тільки у 3% злоякісних пухлин. Показано, що в пунктатах 68–87% доброякісних новоутворень з антитілами реагує більше ніж 80% клітин, а в пунктатах карцином — менше ніж 80% клітин. Тому імуноцитохімічне визначення ТПО в пунктатах активно використовують для диференційної цитологічної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень ЩЗ [13–16]. Імуноцитохімічний метод виявлення ТПО використовують у багатьох лабораторіях світу, але він дозволяє виявляти лише окремі епітопи антигену, а не активність ферменту, зміни якої відбуваються при малігнізації. Крім того, для здійснення методу необхідні високовартісні реактиви. Перспективним для визначення активності ТПО в пунктатах здається цитохімічний метод, оскільки він виявляє саме активність ферменту і не потребує високовартісних реактивів. Але поодинокі давнішні спроби цитохімічного визначення активності ТПО в матеріалі ТАПБ новоутворень ЩЗ були невдалими [17–19].

Мета виконаної роботи — визначення експресії ТПО в пунктатах новоутворень ЩЗ і післяопераційних метастазах ПК ЩЗ; порівняння результативності цитохімічного та імуноцитохімічного методів визначення експресії ензиму до оперативного втручання для прогнозування радіойодорезистентності зазначеного типу карцином.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Імуноцитохімічні та цитохімічні дослідження проводили на матеріалі ТАПБ 30 пацієнтів із карциномами ЩЗ, у 33 осіб з доброякісними новоутвореннями ЩЗ, а також при вивченні 20 метастазів, виявлених після проведення тиреоїдектомії та радіойодотерапії: 10 — радіойодочутливі метастази (РЙЧМ), 10 — радіойодорезистентні метастази (РЙРМ). Пацієнти проходили обстеження, хірургічне лікування та радіойодотерапію в клініці ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин імені В.П. Комісаренка». Усі вони дали інформовану згоду на використання їх біологічних матеріалів у дослідницьких цілях.

Для імуноцитохімічних досліджень використовували фіксовані метанолом та забарвлені за методом Романовського пунктати. Застосовували непрямий імунопероксидазний метод із використанням моноклональних антитіл (МкАт) миші до ТПО (ТРО–47, DakoCytomation, Denmark, розведення 1:50). Як антитіла другого шару використовували МкАт проти g-глобулінів миші (DakoCytomation, Denmark, розведення 1:100).

Для цитохімічного виявлення активності ТПО в епітелії пункційного матеріалу використовували модифікований нами бензидиновий метод. Нефіксований та висушений на повітрі пунктат первинного новоутворення чи матастазу, який містив достатню кількість епітеліальних клітин (що встановлено при мікроскопічному дослідженні нативних пунктатів), обробляли буфером Трис-НCl (рН 6,0–6,15) протягом декількох секунд. Буфер обережно зливали. Після висушування препарату його обробляли 0,1% розчином NH₄Mo на 0,85% розчині NaCl протягом 10 хв при 4 °С. Після обережного зливання зазначеного розчину з препарату на останній наносили реакційну суміш, яку готували безпосередньо перед проведенням реакції: 1 мг бензидину розчиняли у 3 мл диметилформаміду чи ацетону, додавали 1,5 мл буферу Трис-НСl (рН 6,0–6,15), 1,9 мкл Н₂О₂, 10 мкл трилону Б та 10 мкл насиченого розчину NH₄Cl у воді; після закінчення реакції (приблизно 5 хв), препарат обережно промивали дистильованою водою та висушували. При кімнатній температурі на повітрі препарати втрачають яскравість реакції та знебарвлюються через 2–4 тиж. Як позитивний контроль цитохімічної реакції використовували відбитки тканини дифузного токсичного зобу, як негативний контроль — відбитки тканини медулярної карциноми, у клітинах якої активність ТПО відсутня. Додатковим негативним контролем реакції виявлення активності ТПО слугували препарати пунктатів, фіксовані метанолом, який пригнічує активність ферменту.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У результаті проведеної роботи запропоновано нову модифікацію цитохімічного бензидинового методу визначення ТПО, яка дозволила виявляти активність ферменту в матеріалі ТАПБ доброякісних та злоякісних новоутворень ЩЗ. При цьому нам вдалося позбутися недоліків методу ван Дейна, який брали за основу [18]. Так, при зміненні способу розчинення бензидину позбавилися кристалічного осаду та артефактного забарвлення ядер клітин. Введення до інкубаційної суміші буферу зі стабільним рН дозволило стабілізувати умови реакції та досягати постійного яскравого забарвлення цитоплазми тиреоцитів. Введення обробки препарату буфером перед проведенням реакції усувало проблему забарвлення еритроцитів замість цитоплазми тиреоцитів. Обробка препарату розчином NH4Mo посилила інтенсивність реакції. Таким чином, вдалося розробити модифікацію цитохімічного бензидинового методу, яка дозволила виконувати ефективніше визначення активності ТПО в пункційному матеріалі новоутворень ЩЗ. За допомогою модифікованого методу досліджено активність ТПО в цитологічних препаратах, отриманих під час ТАПБ новоутворень ЩЗ у пацієнтів, які згодом були прооперовані. Згідно з патогістологічним післяопераційним діагнозом, у 30 з них були карциноми (26 папілярних, 3 фолікулярних та 1 анапластична), у 26 — аденоматозні вузлові зоби та у 7 — фолікулярні аденоми. У пунктатах 29 (88%) із 33 доброякісних новоутворень ЩЗ практично всі тиреоцити яскраво забарвлювались, що свідчило про високу активність ТПО в їх цитоплазмі. У 4 (12%) із 33 випадків активність ТПО була виявлена не в усіх тиреоцитах (рис. 1). Цим хворим встановлено гістологічний діагноз «аденома мікрофолікулярної будови».

Рис. 1. Розподіл доброякісних новоутворень ЩЗ за наявністю в пунктатах ТПО-позитивних клітин: 1 — пухлини, в яких всі клітини мають активність ТПО; 2 — пухлини, в яких лише частина клітин проявляє ТПО-активність

Водночас епітеліальні клітини з активністю ТПО не виявлені в пунктатах у 20 (67%) із 30 пацієнтів із карциномами. Серед інших 10 (33%) випадків досліджених карцином наявні поодинокі клітини, що проявляли зазначену активність. Таким чином, за допомогою адаптованого нами цитохімічного методу виявлення активності ТПО доведено, що в більшості пунктатів доброякісних новоутворень усі епітеліальні клітини демонстрували таку активність. Навпаки, серед 30 вивчених карцином не було жодної, в пунктаті якої ферментативна активність виявлялася б в усіх клітинах тиреоїдного епітелію (рис. 2).

Рис. 2. Розподіл злоякісних новоутворень ЩЗ за наявністю в пунктатах клітин з активністю ТПО: 1 — пухлини, в пунктатах яких відсутня активність ТПО; 2 — пухлини з поодинокими клітинами з активністю ТПО

Це дозволяє вважати метод цитохімічного виявлення активності ТПО в пунктатах корисним у передопераційній цитологічній диференційній діагностиці новоутворень ЩЗ. Якщо в пунктатах досліджуваного новоутворення ЩЗ всі клітини пластів тиреоїдного епітелію містять ТПО, слід вважати новоутворення доброякісним. При відсутності активності ТПО в епітелії пунктату — висока ймовірність злоякісного характеру новоутворення. Усі випадки, в яких відповідно до результатів проведеної реакції в пунктатах ми надали висновок «папілярна карцинома, Bethesda-6», підтверджені при післяопераційному гістологічному дослідженні. У 20% усіх випадків ПК вдалося діагностувати карциному на передопераційному етапі внаслідок відсутності реакції ТПО в пунктатах, коли використання лише цитологічних ознак було недостатнім (були відсутні внутрішньоядерні інвагінації, які вважаються найточнішою цитологічною ознакою карцином ЩЗ). Таким чином, нами був запропонований спосіб передопераційної діагностики ПК ЩЗ за допомогою цитохімічного визначення активності ТПО в пунктатах новоутворень. Досить високі показники точності позитивного прогнозування (100%), специфічності (88%) та чутливості (70%) методу ще раз свідчать про його важливість. Однією з переваг цього методу є те, що він дозволяє виявляти саме активність ферменту (а не лише наявність антигенних детермінант) та дозволяє обходитися без високовартісних реактивів. Використання цитохімічного визначення активності ТПО в пунктатах особливо доцільне у складних для цитологічної діагностики випадках, коли пунктати ПК не містять повного комплексу цитологічних ознак малігнізації, таких як внутрішньоядерні інвагінації.

Раніше виявлено дуже високозначиму відмінність (при рівні значимості р<0,001) між часткою тиреоцитів, які експресують ТПО в РЙРМ, та РЙЧМ ПК ЩЗ. На підставі цього запропоновано новий метод передопераційного прогнозування ефективності радіойодотерапії метастазів ПК ЩЗ, виявлених після проведення тиреоїдектомії та радіойодотерапії. При цьому відсутність ТПО в пунктатах метастазів ПК, виявлених у післяопераційний період, свідчить про нездатність їх клітин до зв’язування радіойоду, безперспективність лікування цим препаратом у разі наявності таких метастазів і доцільність їх хірургічного видалення. Якщо більше 77,5% тиреоцитів пунктату метастазу містять ТПО, можна прогнозувати високу ефективність радіойодотерапії та доцільність її подальшого використання. Це може позбавити пацієнтів із РЙРМ зайвих курсів радіойодотерапії, а пацієнтів із РЙЧМ направити на радіойодотерапію замість виконання оперативного втручання [20].

Результати проведеного аналізу ефективності радіойодотерапії свідчать, що у 12,5% пацієнтів з РЙЧМ, в яких спочатку клітини метастазів помірно накопичували радіойод, з часом вони втрачали цю здатність. Тобто розвивалася вторинна радіойодорезистентність. Подібні метастази видалено хірургічним шляхом (частка ТПО-позитивних клітин у пунктатах таких метастазів становила 30–46%). Це демонструє, що проміжні значення частки клітин з експресією ТПО (30–46%), хоча й зумовлюють помірне накопичення радіойоду, але можуть не бути достатніми для успішної радіойодотерапії. Саме в цих випадках важливо мати уявлення про активність ТПО, що визначається за допомогою цитохімічного методу.

Проведено порівняльні дослідження експресії ТПО в пунктатах післяопераційних РЙЧМ та РЙРМ ПК ЩЗ за допомогою методів цитохімічного та імуноцитохімічного дослідження. У результаті виконаних досліджень за допомогою обох методів не виявлено експресії ТПО у групі РЙРМ. Водночас у пунктатах пацієнтів із РЙЧМ наявна експресія ТПО в усіх випадках. При імуноцитохімічному дослідженні експресію ТПО відзначали у 68–100% епітеліоцитів. При цитохімічному дослідженні експресію ТПО також спостерігали у більшості клітин. Однак точні підрахунки частки ТПО-позитивних клітин були невдалими у зв’язку з неможливістю дозабарвлення ядер клітин гематоксиліном та точної оцінки їхнього вмісту. Таким чином, результати вивчення експресії ТПО в пунктатах післяопераційних метастазів ПК ЩЗ, отримані з використанням цитохімічного та імуноцитохімічного методів, зіставні й свідчать про те, що метод цитохімічного дослідження не виявляє додаткової активності ферменту порівняно з імуноцитохімічним. Обидва методи можуть бути придатними для передопераційного прогнозування радіойодорезистентності ПК ЩЗ (рис. 3).

Для передопераційної диференційної діагностики цитохімічний метод визначення активності ТПО в пунктатах має в певних випадках перевагу перед імуноцитохімічним, дозволяючи швидко виявити активність ТПО, а при визначенні радіойодочутливості післяопераційних метастазів необхідно мати достатню кількість пункційного матеріалу для проведення цитологічного та цитохімічного досліджень. Забарвлені препарати можуть бути використані одночасно для проведення цитологічного дослідження та імуноцитохімічного виявлення ТПО. Водночас цитохімічна реакція виявлення експресії ТПО проводиться на нефіксованих та незабарвлених цитологічних препаратах. Тому в кожному випадку слід вирішувати, який з методів (імуноцитохімічний або цитохімічний) доцільніше використовувати.

Рис. 3. Цитохімічне (a) та імуноцитохімічне (б) визначення експресії ТПО в пунктатах РЙЧМ та цитохімічне визначення експресії ТПО в пунктатах РЙРМ ПК ЩЗ (в). х 400

ВИСНОВКИ

1. У результаті проведеної роботи запропоновано модифікацію цитохімічного визначення активності ТПО в епітелії пунктатів пухлин ЩЗ, яка ефективна в диференційній цитологічній діагностиці злоякісних та доброякісних тиреоїдних пухлин.

2. Проведення порівняння цитохімічного та імуноцитохімічного методів визначення експресії ТПО в епітелії пунктатів післяопераційних РЙРМ і РЙЧМ демонструє зіставні результати обох методів дослідження, що обґрунтовує можливість використання обох методів в передопераційному прогнозуванні радіойодорезистентності ПК ЩЗ.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Dunn JT, Dunn AD. Update on intrathyroidal iodine metabolism. Thyroid 2001; 11 (5): 407–17.
• 2. De la Vieja A, Santisteban P. Role of iodide metabolism in physiology and cancer. Endocrine-related cancer 2018; 25 (4): 225–45.
• 3. Mansourian AR. Metabolic pathways of tetraidothyronine and triidothyronine production by thyroid gland: a review of articles. Pak J Biol Sci 2011; 14 (1): 1–12.
• 4. Godlewska M, Arczewska KD. Thyroid peroxidase (TPO) expressed in thyroid and breast tissues shows similar antigenic properties. PLoS One 2017; 12 (6): e0179066.
• 5. Furuya F, Shimura H, Hideyo S, et al. Histone deacetylase inhibitors restore radioiodide uptake and retention in poorly differentiated and anaplastic thyroid cancer cells by expression of the sodium/iodide symporter thyroperoxidase and thyroglobulin. Cancer 2004; 145 (6): 2865.
• 6. Liu Ying, Marcel P, Stokkel L, et al. Bexarotene increases uptake of radioiodide in metastases of differentiated thyroid carcinoma. European J Endocrinology 2006; 154 (4): 525–31.
• 7. Markovina S, Grigsby P, Schwarz J, et al. Treatment approach, surveillance, and outcome of well-differentiated thyroid cancer in childhood and adolescence. Thyroid 2014; 24 (7): 1121–26.
• 8. Haugen B, Alexander E, Bible K, et al. 2015 American Thyroid Association management guidelines for adult patients with thyroid nodule sand differentiated thyroid cancer: The American Thyroid Association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid 2016; 26 (1): 1–133.
• 9. Pulcrano M, Boukheris H, Talbot M, et al. Poorly differentiated follicular thyroid carcinoma: prognostic factors and relevance of the histological classification. Thyroid 2007; 17: 639–46.
• 10. Caballero Y, López-Tomassetti EM, Favre J, et al. The value of thyroperoxidase as a prognostic factor for differentiated thyroid cancer — a long-term follow-up study. Thyroid Res 2015; 8: 12.
• 11. Czarnocka B, Pastuszko D, Janota-Bzowski M, et al. Is there loss or qualitative changes in the expression of thyroid peroxidase protein in thyroid epithelial cancer? British Journal of Cancer, 2001; 85 (6): 875–80.
• 12. Mizukami Y, Matsubara F. Correlation between thyroid peroxidase activity and histopathological and ultrastructural changes in various thyroid diseases. Endocrinol Jpn 1981; 28 (4): 381–9.
• 13. De Micco C, Savchenko V, Giorgi R, et al. Utility of malignancy markers in fine-needle aspiration cytology of thyroid nodules: Comparison of Hector Battifora mesothelial antigen-1, thyroid peroxidase and dipeptidyl aminopeptidase IV. Br J Cancer 2008; 98 (4): 818–23.
• 14. Paunovic I, Isic T, Havelka M, et al. Combined immunohistochemistry for thyroid peroxidase, galectin-3, CK19 and HBME-1 in differential diagnosis of thyroid tumors. APMIS 2012; 120: 368–79.
• 15. Savin S, Cvejic D, Isic T, et al. Thyroid peroxidase immunohistochemistry in differential diagnosis of thyroid tumors. Endocr Pathol 2006; 17: 53–60.
• 16. Hoperia V. Immunocytochemical (HBME-1, TPO) and cytochemical (DAP 4) study after TAPB nodes of the thyroid gland. Clinical endocrinology and endocrine surgery 2010; 3 (32): 9–14. (in Ukrainian).
• 17. Smejkal V. A new method for the cytochemical demonstration of peroxidase activity for light, fluorescence, electron microscopy. J histoch cytochemistry 1976; 24: 82–90.
• 18. Shtange MB. Detection of iodine peroxidase activity in the thyroid gland of human fetuses. Probl endocrinology 1968; 2: 88–94.
• 19. Ofverholm T, Ericson LE. Diffusion artefacts and tissue fixation in thyroperoxidase cytochemistry. Histochemistry 1984; 81 (1): 1–8.
• 20. Zelinskaya HV. Cytokeratin 17 and thyroid peroxidase as immunocytochemical markers for preoperative prediction of radioiodine resistance and the effectiveness of radioiodine therapy of papillary thyroid carcinoma. Oncology 2019; 21 (1): 31–5. (in Ukrainian)

Адреса для листування:
Зелінська Г.В.
04114, Київ, вул. Вишгородська, 69
ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин
ім. В.П. Комісаренка НАМН України»
Е-mail: Ann.zelinskaya@ukr.net

Одержано: 02.07.2019