ЦИТОКЕРАТИН 17 І ТИРЕОЇДНА ПЕРОКСИДАЗА В ЯКОСТІ ІМУНОЦИТОХІМІЧНИХ МАРКЕРІВ ДООПЕРАЦІЙНОГО ПРОГНОЗУВАННЯ РАДІОЙОДРЕЗИСТЕНТНОСТІ ТА ЕФЕКТИВНОСТІ РАДІОЙОДТЕРАПІЇ ПАПІЛЯРНОГО РАКУ ЩИТОПОДІБНОЇ ЗАЛОЗИ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-3-2019-g.7376

Незважаючи на переважно ефективне лікування хворих на папілярну карциному (ПК) щитоподібної залози (ЩЗ) за допомогою радіойоду, в низці випадків виявляють метастази навіть після проведення тиреоїдектомії та наступної радіойодтерапії. Найбільшою проблемою є діагностика і лікування радіойодрезистентних метастазів (РЙРМ), клітини яких втрачають здатність до накопичення радіойоду і радіойодтерапія для них стає неефективною [1–3].

Стандартним способом діагностики РЙРМ високодиференційованого раку ЩЗ є визначення рівня тиреоглобуліну з ультразвуковим дослідженням та сцинтиграфією з радіофармпрепаратом Тс-МIBI [4]. Запізнення у виявленні метастазів різко погіршує показники виживаності хворих на рак ЩЗ [5]. Тому актуальним є питання раннього доопераційного прогнозування розвитку РЙРМ ПК ЩЗ та прогнозування статусу щодо накопичення радіойоду метастазами, виявленими у післяопераційний період. Останнім часом дослідники приділяють усе більше уваги розробці методів прогнозування поведінки тиреоїдної карциноми, вивчаючи морфологічні, імуноцитохімічні та навіть молекулярні особливості клітин ПК ЩЗ [6–9]. Але в доступній літературі не знайдено даних щодо цитологічних досліджень РЙРМ папілярного раку ЩЗ та методів їх доопераційного прогнозування, що спонукає до проведення наступних досліджень.

Метою даної роботи були дослідження експресії тиреоїдної пероксидази та цитокератину 17 (ЦК17) у клітинах ПК ЩЗ і їх метастазів та оцінка можливості використання цих антигенів для прогнозування радіойодрезистентності пухлин.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідженнях використовували матеріал тонкоголкових аспіраційних пункційних біопсій 32 первинних ПК та 103 метастазів, виявлених у після­операційний період після проведення тиреоїдектомії та радіойодтерапії (79 — радіойодрезистентні, 24 — радіойодчутливі) у пацієнтів обох статей віком 8–40 років, що проходили обстеження, хірургічне лікування та радіойодтерапію в клініці ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України». Усі пацієнти були проінформовані та дали згоду на використання їх біо­логічного матеріалу для проведення досліджень. В імуноцитохімічних дослідженнях використовували матеріал пунктатів, фіксованих метанолом та забарвлених за методом Романовського [10]. Проводили імуноцитохімічні реакції виявлення антигенів непрямим імунопероксидазним методом за допомогою МкАТ миші проти тиреоїдної пероксидази (ТРО-47, DakoCytomation, Данія) та ЦК17 — клон Е3 (DakoCytomation, Данія). У другому шарі використовували антитіла проти гамма-глобулінів миші, мічені пероксидазою хрону (DakoCytomation, Данія). Після проведення імуноцитохімічної реакції ядра клітин дофарбовували розчином гематоксиліну.

Статистичне опрацювання даних робили за непараметричним методом Колмогорова — Смирнова‚ Манна — Уїтні та методом кореляційного аналізу. Розрахунки виконано в пакеті Statistica 11.0.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Наші попередні дослідження показали, що малігнізація фолікулярного епітелію ЩЗ супроводжується значним збільшенням експресії одного з білків цитоскелета епітеліальних клітин — ЦК17 (при дослідженні гістологічних зрізів доброякісних новоутворень — в середньому 0,39%, зло­якісних — 30,85%) [11]. Особливістю позитивних за ЦК17 клітин є відсутність у них антигенів, причетних до зв’язування тиреоцитами радіойоду (більшість не містить тиреоглобуліну, не визначається ТП) [12, 13]. Тому можна очікувати, що ЦК17-позитивні (ЦК17⁺) клітини можуть бути одним із джерел РЙРМ. Важливо також встановити, чи буде ефективність радіойодтерапії відрізнятися для ПК з різним вмістом клітин з ЦК17.

Пацієнти, прооперовані з приводу папілярного раку ЩЗ, які проходили обстеження та лікування за допомогою радіойоду, були розподілені на дві групи залежно від ефективності радіойодтерапії. До першої групи включено 14 пацієнтів, які отримали лише одну лікувальну дозу радіойоду та протягом 5–10 років спостереження не мали рецидивів раку ЩЗ. До другої групи увійшли 18 пацієнтів, котрі отримали від 2 до 7 лікувальних курсів радіойодтерапії та у яких було виявлено поодинокі або численні метастази ПК ЩЗ у лімфатичні вузли шиї, легені, середостіння.

У результаті проведених досліджень виявилося, що в пунктатах первинної ПК пацієнтів першої групи у 71% випадків (10/14) не було знайдено клітин з ЦК17. У пунктатах 29% пацієнтів цієї групи (4/14) ЦК17⁺ клітини становили лише 1–4,7% від загальної популяції тиреоцитів пунктату. У пунктатах пацієнтів другої групи відсоток ЦК17⁺ клітин був значно вищим (5–100% тиреоцитів пунктату у 67% хворих).

У пацієнтів другої групи, у пунктатах первинної ПК яких вміст ЦК17⁺ клітин був найвищим і становив 55–100%, відмічали розвиток численних метастазів ПК ЩЗ, які не піддавалися лікуванню радіойодом та були видалені хірургічним шляхом. Важливо відмітити, що всі вони мали дифузно-склерозуючий варіант ПК ЩЗ, майже всі епітеліальні клітини якої містили ЦК17 (рис. 1).

Рис. 1. Епітеліальні ЦК17⁺ клітини в пунктаті (а) та на гістологічному зрізі (б) первинної ПК ЩЗ. Імуноцитохімічна реакція з антитілами до ЦК17. Зб. × 40

Математична обробка за методом Колмогорова — Смирнова та Манна — Уїтні показала, що різниця за відсотком ЦК17⁺ клітин у пунктатах ПК ЩЗ між двома групами пацієнтів із різною ефективністю радіойодтерапії є статистично підтвердженою (р < 0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Вміст ЦК17⁺ клітин в пунктатах первинних ПК ЩЗ пацієнтів з високою (серія 1) та низькою (серія 2) ефективністю радіойодтерапії

Таким чином, ЦК17 може бути використаний на ранньому доопераційному етапі як цитологічний маркер прогнозування радіойодрезистентності з вірогідністю 70%, що перевищує подібний показник для натрій-йодного симпортера (natrium-iodine symporter — NIS) [9]. Прогнозування радіойодрезистентності ПК має важливе клінічне значення для вибору подальшої тактики лікування. Метод дозволяє виділити групу ризику пацієнтів з високою вірогідністю появи РЙРМ та більш ретельно спостерігати за ними. Тобто навіть при отриманні радіойоднегативних сканограм у таких пацієнтів варто враховувати можливість наявності «мовчазних» РЙРМ, які можуть бути візуалізовані за допомогою таких додаткових методів дослідження, як рентген, ультразвукове дослідження, FDG-РЕТ-діагностика. Враховуючи значний ризик агресії ПК із високою експресією ЦК17, ця інформація може сприяти рішенню хірургів про розширення обсягу первинного оперативного втручання до тиреоїдектомії (навіть у випадках мікрокарцином) та проведення профілактичної дисекції лімфатичних колекторів серединного відсіку шиї.

У післяопераційний період, навіть після проведення тиреоїдектомії та наступної радіойодтерапії, у пацієнтів можуть з’являтися як РЙРМ, для яких радіойодтерапія є неефективною, так і метастази, що накопичують радіойод та можуть бути успішно вилікувані за його допомогою.

Імуноцитохімічне дослідження експресії тиреоїдної пероксидази (thyroid peroxidase — ТРО) в пунктатах метастазів, виявлених у післяопераційний період, дозволило встановити статистично достовірну різницю між радіойодрезистентними та радіойодчутливими метастазами (РЙЧМ) ПК ЩЗ за відсотком клітин, що реагують з антитілами до ТРО (рис. 3).

Рис. 3. Експресія тиреоїдної пероксидази в клітинах пунктатів РЙЧМ (а) та РЙРМ (б). Імуноцитохімічна реакція з антитілами до ТРО. Зб. × 40

У відповідності з непараметричним критерієм Манна — Уїтні підтверджено альтернативну гіпотезу про наявні значущі відмінності (рівні значущості 0,05 та 0,001) між показниками двох груп (p = 0,000000). У 77,5% пунктатів метастазів, які накопичували радіойод, виявлено високий рівень експресії ТРО (імунопозитивні тиреоцити становили від 65 до 100%). У 3 пунктатах (12,5%) імунопозитивні клітини становили 30–46%. У групі РЙРМ, навпаки, в 83% випадків експресія ТРО була відсутня, а в 17% випадків — імунопозитивні тиреоцити становили лише 6–22% загальної кількості клітин (рис. 4).

Рис. 4. Розподіл РЙРМ та РЙЧМ за показником ТРО⁺ клітин (%)

Якщо група РЙРМ була однорідною за відсотком ТРО⁺ клітин, то в групі РЙЧМ відмічали гетерогенність за дослідженим показником (30–100% ТРО⁺ клітин). У групі РЙЧМ ефективність радіойодтерапії у пацієнтів з різним відсотком ТРО⁺ клітин була різною, незважаючи на те, що всі метастази накопичували радіойод. Так, для 87,5% пацієнтів радіойодтерапія була успішною, нові метастази не з’являлися (вміст ТРО⁺ клітин у пунктатах метастазів перевищував 50%). Водночас у 12,5% пацієнтів цієї групи клітини метастазів з часом втрачали здатність накопичувати радіойод, тобто розвивалася вторинна радіойодрезистентність, і такі метастази були видалені хірургічно (вміст ТРО⁺ клітин у пунктатах — від 30,0 до 46,0%). Це демонструє, що наявність 30,0–46,0% клітин з експре­сією ТРО хоча й зумовлює помірне накопичення радіойоду, але може не бути достатньою умовою для успішної радіойодтерапії. Пояснити різну ефективність радіойодтерапії для групи, гетерогенної за відсотком ТРО⁺ клітин у пунктатах метастазів, можна, враховуючи існування явища фенотипічної гетерогенності популяції тиреоцитів метастазу. Вірогідно, невеликий відсоток ТРО⁺ клітин знищується за допомогою радіойоду, а ТРО– клітини стають субстратом для розвитку вторинної радіойодрезистентності та прогресії метастазу.

Аналіз діаграми (див. рис. 4) демонструє, що медіана відсотка ТРО⁺ клітин для групи РЙРМ становить 0,0%, а для групи РЙЧМ — 77,5%. Значення медіани можна використовувати в якості граничного відсотка ТРО⁺ клітин, перевищення якого однозначно вказує на радіойодчутливість досліджуваного метастазу. Водночас відсутність клітин з експресією ТРО однозначно свідчить про радіойодрезистентність метастазу. Отже, у результаті проведених досліджень вперше був розроблений спосіб перед­операційного прогнозування радіойодрезистентності метастазів ПК ЩЗ на основі імуноцитохімічного визначення експресії ТРО у клітинах пунктатів метастазів. При відсутності експресії ТРО прогнозується радіойодрезистентність метастазу, неефективність радіойодтерапії та необхідність його хірургічного видалення. Якщо частка пухлинних клітин, які містять ТРО, перевищує 77,5% (значення медіани), прогнозується можливість проведення успішної радіойодтерапії. Такий простий, достатньо швидкий і зручний спосіб прогнозування радіойодрезистентності папілярного тиреоїдного раку та ефективності радіойодтерапії був запатентований та використовується в практичній діяльності нашого інституту [14].

Проведені дослідження продемонстрували, що у випадках, коли вміст ТРО⁺ клітин у пунктатах метастазів становить 30,0–46,0%, необхідно враховувати можливість розвитку вторинної радіойодрезистентності метастазів, які попередньо накопичували радіойод, та неефективність і недоцільність подальшого проведення радіойодтерапії.

Прогнозування радіойодчутливості метастазів ПК ЩЗ може бути одним з факторів, який визначає персоналізовану тактику лікування у випадках неповної структурної відповіді на початкову терапію, коли після першого курсу проведення радіойодтерапії визначаються персистентні локально-регіонарні метастази. Таким чином, простий метод визначення ТРО у клітинах пунктатів виявлених у післяопераційний період метастазів дозволяє передбачити ефективність радіойодтерапії та доцільність її подальшого проведення, а також необхідність виконання дисекції шиї у пацієнтів із РЙРМ. На думку клініцистів, цитологічне дослідження лімфогенних метастазів із визначенням маркерів йодрезистентності є мінімально травматичним та дозволяє коригувати програму лікування [14].

ВИСНОВКИ

1. Виявлення за допомогою імуноцитохімічних методів маркерів ЦК17 та ТРО у клітинах пункційного матеріалу пухлини та її метастазів може бути використане для доопераційного моніторингу РЙРМ ПК ЩЗ; дозволить досить точно прогнозувати радіойодрезистентність та обирати правильну тактику лікування (радіойодтерапія або хірургічне видалення метастазів).

2. Розвиток радіойодрезистентності можна прогнозувати, якщо відсоток ЦК17⁺ клітин перевищує 5% у пунктатах первинних ПК ЩЗ. Для пацієнтів, у клітинах пунктатів ПК яких вміст тиреоцитів з ЦК17 становив менше 5%, проведення радіойодтерапії було ефективним.

3. Для прогнозування радіойодрезистентності метастазів папілярного тиреоїдного раку, які виникли в післяопераційний період, запропоновано імуноцитохімічне визначення експресії ТРО. Можливість проведення успішної радіойодтерапії прогнозується при наявності в пунктатах 77,5% і більше ТРО⁺ клітин.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Bryan R, Haugen BR, Alexander EK, et al. 2015 American thyroid association management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: the american thyroid association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid 2016; 26 (1): 1–133.
• 2. Pacini F, Yasuhiro I, Markus L. Radioactive iodine-refractory differentiated thyroid cancer: unmet needs and future directions. Expert Rev Endocrin Metab 2012; 7 (5): 541–4.
• 3. Pfister DG, Fagin JA. Refractory thyroid cancer: a paradigm shift in treatment is not far off. J Clin Oncol 2008; 26 (29): 4701–4.
• 4. Rubello D, Mazzarotto R, Casara D, et al. The role of technecium-99m-methoxyisobutylisonitrile scintigraphy in the planning therapy and follow-up of patient with differentiated thyroid carcinoma after surgery. Eur J Nucl Med; 2000; 27 (4): 431–40.
• 5. Epstein EB, Oleinik VA, Sovenko TC. Treatment of differentiated thyroid cancer. Promeneva diahnostyka, promeneva terapiya 2000; (1): 53–4 (in Russian).
• 7. Ricorde-Filho JC, Ryder M, Chitale DA, et al. Mutational profile of advanced primary and metastatic radioactive iodine-refractory thyroid cancers reveals distinct pathogenetic roles for BRAF, PIK3CA, and AKT1. Cancer Res 2009; 69 (1): 4885.
• 8. Deandreis D, Ghuzlan A, Leboulleux S, et al. Do histological, immunohistochemical, and metabolic (radioiodine and fluorodeoxyglucose uptakes) patterns of metastatic thyroid cancer correlate with patient outcome? Endocr Relat Cancer 2011; 1 (18): 159–69.
• 9. Xing M, Westra WH, Tufano RP, et al. BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer. J Clin Endocrin Metab 2005; 90 (12): 6373.
• 10. Min JJ, Chung JK, Lee YJ, et al. Relationship between expression of the sodium/iodide symporter and ¹³¹I uptake in reccirent lesions of differentiated thyroid carcinoma. Eur J Nucl Med 2001; 28 (5): 639–45.
• 11. Bozhok YM‚ Tavokina LV, Epstein EV. The new things in diagnostic of thyroid cancer. Optimal combination of morphological and immunocytochemistry research methods of punctious materials. Med Announcer (USA) 1996: 138 (1): 40–3.
• 14. Zelinskaya AV, Bozhok YuM. The use of immunocytochemical detection of cytokeratin N17 determinants in the preoperative cytological diagnosis of thyroid malignant tumors. Oncology 2000; 2 (1–2): 56–60 (in Russian).
• 17. Dunn JT, Dunn AD. Update on intrathyroidal iodine metabolism. Thyroid 2001; 11 (5): 407–17.
• 18. Furuya F, Shimura H, Hideyo S, et al. Histone deacetylase inhibitors restore radioiodide uptake and retention in poorly differentiated and anaplastic thyroid cancer cells by expression of the sodium/iodide symporter thyroperoxidase and thyroglobulin. Cancer 2004; 145 (6): 2865.
• 19. Zelinska HV. Method for prediction of effectiveness of radioiodine therapy of post-operative metastases of papillary cancer of thyroid dland (Pat. № 86375). Publ. 25.12.2013 UA. Bul. № 24 (in Ukrainian).
• 21. Method recommendations Leadership of the American Thyroid Association 2015: Edited by AE Kovalenko, MI Bobrik. Kiev 2016. 62 p. (in Russian).

Адреса для листування:
Зелінська Г.В.
Київ, вул. Вишгородська, 69
ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин
ім. В.П. Комісаренка НАМН України»
Е-mail: Ann.zelinskaya@ukr.net

Одержано: 28.01.2019