РІВЕНЬ ЕКСПРЕСІЇ ТА ФОСФОРИЛЮВАННЯ PKD1/2 У КЛІТИНАХ АДЕНОКАРЦИНОМ ШЛУНКА РІЗНОГО СТУПЕНЯ ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ

До злоякісної трансформації клітин призводить накопичення незалежних мутацій, які викликають порушення регуляції сигнальних шляхів, що контролюють проліферацію, диференціювання та апоптоз клітин [1].

Пухлини шлунка — велика та різноманітна група новоутворень, яка по поширенню в світі знаходиться на другому місці серед злоякісних новоутворень. Незважаючи на кардинальні хірургічні втручання та ад’ювантну терапію, смертність хворих на рак шлунка (РШ) залишається на високому рівні і складає від 3 до 10% летальних випадків від пухлин усіх локалізацій [2]. 90% всіх пухлин шлунка злоякісні, серед них 95% — аденокарциноми шлунка (АКШ). Після лікування хворих на це захворювання, що полягає в резекції шлунка, субтотальній чи тотальній гастроектомії, лімфаденектомії, 5-річна виживаність складає всього 10–30%. Немає сумніву в тому, що подальше вивчення молекулярно-генетичних особливостей патогенезу РШ буде сприяти пошуку нових підходів для підвищення ефективності лікування хворих.

Родина серин/треонін (Ser/Thr) протеїнкіназ D (PKD) включає три кінази PKD1 (PKCμ), PKD2 та PKD3 (PKCν) [3]. Активаторами цих кіназ можуть бути форболові ефіри, аналоги діацилгліцеролу [4], нейропептиди [5], бріостатин [6], індуктори окси-

дативного стресу [7, 8], тромбоцитарний фактор росту (PDGF) [9], фактор некрозу пухлин (TNFα) [10], CCKB-гастриновий рецептор [11], антигени та ін. Протеїнкінази родини PKD характеризуються унікальною модульною структурою і містять регуляторний та каталітичний/кіназний функціональні домени. Регуляторний домен складається із структурних доменів: аполярної частини (PKD1 та PKD2), діацилгліцерол/форбол ефірзв’язуючого домену (СRD-домен), що в свою чергу складається з двох збагачених на цистеїн частин (CYS1 та CYS2), які

з’єднані між собою довгим лінкером; домену, збагаченого на негативно заряджені амінокислоти, та домену гомології плекстрину (РН). Первинна структура Ser/Thr-кіназного каталітичного домену має важливе значення в субстратній специфічності протеїнкіназ родини PKD [12–15].

Активація PKD1, PKD2 та PKD3 відбувається при фосфорилюванні залишків серину, які містяться в різних структурних модулях. Були ідентифіковані ділянки трансфосфорилювання: у людини — це Ser738/742, Ser706/710, Ser731/735 для PKD1, PKD2

та PKD3 відповідно, а також сайти аутофосфорилювання Ser910 (PKD1) і Ser876 (PKD2). Сайту аутофосфорилювання у складі PKD3 немає. Два додаткові сайти фосфорилювання ідентифіковано у регуляторному домені PKD1 — Ser197 (сайт аутофосфорилювання) та Ser249 [13, 16]. Також у складі PKD1 та PKD2 є сайти фосфорилювання по тирозину Tyr95, Tyr432, Tyr463, Tyr562 та Tyr463 і Tyr436 відповідно, фосфорилювання яких призводить до стрес-індукованої активації ядерного фактору транскрипції NF-κB [15, 17] Запропоновано декілька механізмів активації PKD1- та PKD2-протеїнкіназ. PLCγ-залежна активація PKD потребує продукції діацилгліцеролу і стимуляції класичних протеїнкіназ С [18, 19]. Було виявлено, що активація PKD в апараті Гольджі залежить від Gγβ-субодиниць [20–23], також виявлено додаткові механізми активації PKD1: розщеплення каспазами [24] та фосфорилювання Tyr463 у РН-домені [12, 13]. Активація PKD1- та PKD2-протеїнкіназ супроводжується цитоплазматичною релокалізацією і транслокацією до поверхневої мембрани [20, 25–27]. У цитоплазмі кінази залучені до везикулярного транспорту від апарату Гольджі до мембрани [5, 15, 17, 28], в ядрі вони приймають участь у епігенетичній регуляції роботи генів шляхом фосфорилювання HDAC [29]. Таке фосфорилюван-

ня сприяє зв’язуванню HDAC з білком 14-3-3 та ядерному експорту і призводить до ацетилування гістонів і активації роботи генів [30], що може впливати на біологічні властивості клітин. Висока структурна гомологія PKD1 та PKD2 обумовлює подібні механізми регуляції активації цих кіназ, але вони відрізняються за внутрішньоклітинною локалізацією, клітинно-специфічною експресією та субстратною специфічністю [31].

Промоторами канцерогенезу шлунковокишкового тракту у людини можуть бути гастроентеропанкреатичні гормони [32]. Зокрема, гастрин має трофічний вплив, викликає гіперплазію обкладових і головних клітин, проліферацію клітин слизової оболонки шлунка і таким чином може впливати на пухлинний ріст [33, 34]. При створенні експериментальної моделі РШ у щурів за допомогою N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідину введення гастрину призводить до розвитку РШ дифузного типу [35]. Активація PKD2 у лінії клітин АКШ під дією гастрину свідчить про можливу участь цієї кінази у патогенезі захворювання у людини. У той же час залишаються відкритими питання про рівень експресії, функціональну активність та роль PKD1- та PKD2-кіназ у регуляції сигнальних каскадів при розвитку РШ. В епітеліальній клітинній лінії AGS, яка походить з АКШ людини, експресована неактивна/нефосфорильована PKD2 [11], але чи експресована PKD2-кіназа в нормальних та злоякісно трансформованих тканинах шлунка раніше досліджено не було. Крім того, ще мало відомо про експресію та функціональну активність ферментів родини PKD у клітинах різного походження [11]. Нещодавно виявлена епігенетична інактивація експресії PKD1 у клітинних лініях, що походять з РШ, а також у 59% випадків РШ [37], що є клінічним спостереженням хворих, але дослідниками не був проведений аналіз з урахуванням ступеня диференціації пухлин, а також не вивчали активність цієї кінази. Саме тому мета нашої роботи — дослідити рівень експресії та аутофосфорилювання РKD1- та РKD2-кіназ у пухлинних клітинах хворих на АКШ.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктом досліджень були операційні гістопрепарати видаленої пухлинної тканини 36 хворих на АКШ, тканини шлунка, що використовувалися як умовний контроль (12 випадків) та реактивно змінені тканини шлунка (3 випадки). Хворі віком від 40 до 75 років були прооперовані у Київській міській онкологічній лікарні і не отримували неоад’ювантної протипухлинної терапії. Розподіл досліджуваних гістопрепаратів РШ проводили з урахуванням ступеня диференціації. Відповідно до нього хворі були поділені на 2 групи: хворі з помірнота з низькодиференційованою АКШ.

Лізати пухлинних тканин виготовлено із по-

передньо кріоконсервованих у рідкому азоті шматочків пухлин, гомогенізованих механічним

шляхом. Для лізису було використано лізисний буфер (0,05M Tris, 2mM EDTA, 2mM EGTA, 1%

Triton X-100 pH 7,4), що містив інгібітори протеаз (апротинін 1 μg/мл, леупептин 1 μg/мл, пепстатин 1 μg/мл, PMSF 2 mM, інгібітор трипсину із соєвих бобів 100 μg/мл, мікроцистін (0,2 μg/мл), інгібітори фосфатаз (Na3VO4 100 mM, NaF 50 mM, Na4P2O7 5 mM). Для лізису гомогенізовані тканини інкубували у буфері 40 хв при 4 °С. Лізати центрифугували при 14 000 об./хв 15 хв при 4 °С. Кількість білка в супернатанті вимірювали за допомогою набору для вимірювання концентрації білків (Pierce, USA) та Multiscan ELISA reader (STAT FAX 2100, AWARENESS Technology Inc., USA). Зразки зберігали при температурі –70 °С до подальшого

використання.

Рівень експресії PKD1 та PKD2 у гістопрепаратах АКШ досліджено шляхом Вестерн-блот-аналізу. Розділення білків проводили методом електрофорезу у 7,5% додецил-сульфат Na-поліакриламідному гелі у редукуючих умовах. Зразки наносили на гель у кількості 100 мкг на лунку, потім їх переносили на нітроцелюлозну мембрану (Immobilon-NC, Millipore corp., Billarica, MA) у камері для переносу білків (Hoefer, USA). Блокування місць неспецифічного зв’язування проводили у Tris-буферному розчині (PBS) з 0,1% твін-20 та 5% сухого знежиреного молока. Після ретельного відмивання у PBS з 0,1% твін-20 (PBS-Т) мембрани інкубували з первинними антитілами (АТ) у робочому розведенні протягом 2 год при кімнатній температурі. Після відмивання нітроцелюлози у PBS-Т проводили інкубацію із вторинними АТ, міченими пероксидазою протягом 2 год при температурі 4 °С, відмивали блоти та проводили їх інкубацію у реагенті для детекції посиленої хемілюмінесценції (PerkinElmer, Boston, MA, USA). Далі проводили експозицію на плівці для детекції реакції хемілюмінесценції (рентгенівська плівка Agfa CP-BU new, Belgium). Нами були використані кролячі АТ, що розпізнають як PKD1-, так і PKD2-кіназу (люб’язно надані проф. Ван Лінтом, Бельгія), АТ до PKD2 (Calbiochem, USA) і pPKD2 (Upstate, USA) та вторинні сироватки, кон’юговані з пероксидазою і адсорбовані імуноглобулінами людини (Santa Cruz, CA, USA). У якості позитивних контролей були використані лізати клітин лінії НЕК293-Т, трансфікованих плазмідами pcDNA3- PKD1 та pcDNA3-PKD2.

Для морфологічної верифікації діагнозу та проведення імуногістохімічних досліджень зразки тканин шлунка розміром 1–1,5 см обробляли за стандартною гістологічною технікою. Патогістологічний діагноз встановлювали при морфологічному дослідженні зрізів, забарвлених гематоксиліном та еозином. Для визначення рівня експресії та аутофосфорилювання РКD1/2 був проведений імуногістохімічний аналіз з використанням поліклональних кролячих АТ до РКD1/2 та pРКD1/2 (сайти аутофосфори-

лювання — Ser910 в РКD1 та Ser876 в РКD2), що розпізнають обидві кінази (надані проф. Ван Лінтом, Бельгія). На паралельних зрізах оцінювали кількість проліферуючих клітин за допомогою МкАТ IPO-38 (ІЕПОР).

Парафінові зрізи товщиною 4–5 мкм прикріпляли на скельця, оброблені 0,1% розчином полі-L-лізину, і залишали в термостаті при температурі 37 °С на 30 хв. Через добу зрізи на скельцях депарафінували у ксилолі і відмивали у розчинах етилового спирту різної концентрації, після чого промивали водою. Скельця зі зрізами поміщали у цитратний буфер (рН 5,2) і обробляли 5 хв у мікрохвильовий печі для демаскування антигенів. Після цього їх охолоджували до кімнатної температури, промивали забуференим фізіологічним розчином (РВS) хлориду натрію і блокували неспецифічне зв’язування АТ сироваткою кози та 1% розчином альбуміну сироватки бика (BSA) по 30 хв відповідно. Потім на зрізи наносили первинні АТ у концентрації 20 мкг/мл і проводили інкубацію протягом 1 год при кімнатній температурі у вологій камері та промивали у PBS. Далі зрізи інкубували з системою візуалізації EnVision (DaкoCytomation EnVision + System- HRP, USA). Термін інкубації становив 40 хв при кімнатній температурі. Після промивання зрізів у 3 змінах PBS для видалення реактиву, який не зв’язався, проводили виявлення активності пероксидази за допомогою діамінобензидину (DAB), (DaкoCytomation, USA). Розчин для виявлення активності пероксидази наносили на зрізи на 1–3 хв. Скельця ретельно промивали водою, дозабарвлювали гематоксиліном, додавали канадський бальзам і накривали покривними скельцями. У місцях локалізації антигену спостерігали гранулярне забарвлення коричневого кольору. Рівень експресії та активації білка у зразках оцінювали з використанням H-score [36]. Цей спосіб враховує інтегральний показник ступеня експресії об’єкта дослідження, визначений сумою балів, що відображає відсоток забарвлених клітин та інтенсивність забарвлення цих клітин. Підрахунок кількості клітин з різною інтенсивністю забарвлення на 1000 пухлинних клітин проводили на світловому мікроскопі Micros Austria MC-300 при загальному збільшенні х 400 і фотографували, використовуючи цифрову камеру Nikon VE8400 Coolpix. Результати обчислювали за формулою: H-score = 1 х Сл + 2 х Пом + 3 х Сил (H-score, histological score — сума набраних імуногістохімічних балів; Сл — відсоток клітин із забарвленням слабкої інтенсивності, Пом — із забарвленням помірної інтенсивності, Сил — із забарвленням сильної інтенсивності). Оцінку ступеня експресії проводили за сумою набраних імуногістохімічних балів: 0–50 — негативний, 51–100 — низький, 101–200 — помірний, ≥ 201 — високий ступінь експресії. Для контролю дослідження рівня

експресії протеїнкінази D та рівня її фосфорилювання в АКШ взяті умовно-нормальні, максимально віддалені від пухлин ділянки шлунка, а також реактивно змінені тканини шлунка (виразка та хронічний запальний процес по типу псевдолімфоматозу).

Статистичну обробку даних проводили з використанням методів варіаційної та кореляційної статистики із застосуванням пакету прикладних програм

«STATISTICA 6.0». Ступінь кореляційного зв’язку між окремими показниками визначали методом непараметричної рангової кореляції Спірмана (r). Результати вважали достовірними при коефіцієнті вірогідності p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведений Вестерн-блот-аналіз експресії PKD1- та PKD2-кіназ у хворих на АКШ. АТ до PKD2 розпізнавали білок розміром 105 кДа як в пухлинних, так і в умовно-нормальних тканинах (рис. 1а); при використанні АТ до PKD1 було виявлено експресію білка з молекулярною масою 120 кДа (рис. 1б). У зв’язку з тим, що анти-PKD1- АТ мають перехресну реактивність з PKD2, також було відзначено слабке забарвлення білка з молекулярною масою 105 кДа, що відповідає розміру PKD2 у контролі. АТ до Ser910 (PKD1) та Ser876 (PKD2) виявили аутофосфорилювання як PKD1, так і PKD2. Оскільки в умовно-нормальних тканинах та пухлинах шлунка Вестерн-блот-аналізом нами була показана експресія як PKD1, так і PKD2, на підставі даних біохімічного дослідження можна зробити висновок, що безпосередньо в пухлинних клітинах хворих на РШ експресовані як PKD1-, так і PKD2-кінази, причому обидві кінази можуть бути аутофосфорильованими (дані в статті не наведено).

Рис. 1 Вестерн-блот-аналіз лізатів АКШ. 1, 2 — низькодиференційована АКШ (умовно-нормальна тканина, пухлина); 3, 4 — помірнодиференційована АКШ (умовно-нормальна тканина, пухлина); 5, 6 — контролі (PKD2 у pcDNA-293T та PKD1 у pcDNA-293T)

Перехресна реактивність АТ до PKD1 та PKD2 ускладнює ідентифікацію кіназ в імуногістохімічних дослідженнях. У зв’язку з цим використання АТ в імуногістохімічних дослідженнях дає можливість виявляти сумарну експресію PKD1 та PKD2, а також аутофосфорилювання обох кіназ.

У табл. 1 наведені узагальнені результати гістологічних та імуногістохімічних досліджень. При дослідженні тканин з виразкою шлунка ми виявили, що клітини циліндричного епітелію мають високий рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2. Найвищий рівень експресії та ауто-

фосфорилювання PKD1/2 відзначали в апікальній частині епітеліальних клітин слизової оболонки шлунка, що може бути пов’язано з участю PKD1/2 у створенні та секреторній функції апарату Гольджі. У всіх інших епітеліальних та сполучнотканинних елементах зразку виявлено помірний рівень експресії кінази PKD1/2 у цитоплазмі та слідовий рівень аутофосфорилювання PKD1/2 (рис. 2). Для епітеліальних клітин при хронічному запальному процесі по типу псевдолімфоматозу шлунка був характерним високий рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 як у ядрі, так і в цитоплазмі клітин та велика кількість проліферуючих клітин (рис. 3).

Рис. 2. Експресія та аутофосфорилювання PKD1/2 у тканинах шлунка при виразці шлунка. Морфологія дослідженої ділянки (a), експресія IPO-38 (б), експресія PKD1/2 (в), експресія аутофосфорильованої PKD1/2 (г). х 400

Досліджені зразки АКШ (різного ступеня диференціювання) характеризувались гетерогенністю як за рівнем проліферації клітин (ІПО-38), рівнем експресії та активності PKD1/2-кіназ, так і за їх внутрішньоклітинною локалізацією (у ядрі чи цитоплазмі клітин).Пухлинні клітини низькодиференційованих АКШ відрізнялися низьким рівнем експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 у цитоплазмі при помірній кількості проліферуючих клітин (рис. 4). Для клітин помірнодиференційованих АКШ був характерним помірний і високий рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 як у цитоплазмі, так і в ядрі на фоні помірної кількості проліферуючих клітин (рис. 5).

Рис. 3. Експресія та аутофосфорилювання PKD1/2 у тканинах шлунка при хронічному запальному процесі по типу псевдолімфоматозу шлунка. Морфологія дослідженої ділянки (a), експресія IPO-38 (б), експресія PKD1/2 (в), експресія аутофосфорильованої PKD1/2 (г). х 400

Рис. 4. Експресія та аутофосфорилювання PKD1/2 у тканинах шлунка при низькодиференційованій АКШ. Морфологія дослідженої ділянки (a), експресія IPO-38 (б), експресія PKD1/2 (в), експресія аутофосфорильованої PKD1/2 (г). х 400

Рис. 5. Експресія та аутофосфорилювання PKD1/2 у тканинах шлунка при помірнодиференційованій АКШ. Морфологія дослідженої ділянки (a), експресія IPО-38 (б), експресія PKD1/2 (в), експресія аутофосфорильованої PKD1/2 (г). х 400

За результатами зіставлення отриманих даних із клінічними показниками у досліджуваних групах

були виділені підгрупи з урахуванням локалізації пухлин. Вищий рівень експресії PKD1/2 відзначено у пухлинах з нижньої третини шлунка, нижчий — переважно з верхньої та середньої третин шлунка (табл. 1). Можна припустити, що це пов’язано з різною кислотністю у відділах шлунка та можливою наявністю H. pylori у нижній третині шлунка.

Результати власних імуногістохімічних досліджень свідчать про існування відмінностей щодо експресії PKD у хворих на АКШ із різними стадіями пухлинного процесу порівняно з хворими, у яких не було пухлинних захворювань шлунка (виразка та реактивно змінені тканини). Також виявлені відмінності між рівнем експресії та фосфорилювання кінази у пухлинних тканинах та тканинах умовного контролю. Низькодиференційовані (але непомірнодиференційовані) АКШ порівняно з умовно-нормальними тканинами шлунка мали знижений рівень експресії PKD1/2-кіназ (табл. 2). Це може свідчити про можливу участь PKD-кіназ у процесах злоякісної трансформації клітин шлунка у низькодиференційованих АКШ.

У 2008 р. з’явилися перші дані літератури щодо експресії PKD1 у первинних пухлинах шлунка (РШ) та різних клітинних лініях РШ. Автори встановили, що 72,7% досліджених клітинних ліній РШ мають знижений рівень експресії PKD1, асоційований з CpG-гіперметилуванням у ділянці промотору PKD1. Було показано також, що 59,0% проаналізованих випадків первинного РШ мали вдвічі нижчу експресію PKD1 порівняно з умовнонормальними тканинами, що також корелювало зі зменшенням метилування [37]. У той же час ав-

Таблиця 1

Рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 у хворих на АКШ (імуногістохімічні бали)

*У табл. 1, 2: В/3 — верхня третина, Ср/3 – середня третина, Н/3 – нижня третина шлунка.

Таблиця 2

Рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 у АКШ порівняно з тканинами умовного контролю (імуногістохімічні бали)

1п – пухлинна тканина; 2к – тканини умовного контролю.

тори не враховували рівень диференціаціювання РШ. Можливо, виявлений нами знижений рівень експресії PKD1 при низькодиференційованих АКШ порівняно з умовно-нормальними тканинами обумовлений гіперметилуванням промотору PKD1.

PKD1 відіграє важливу роль у регуляції рухливості клітин, їх міграції та інвазії. Ця кіназа впливає на процес міграції клітин через залучення αvβ3- інтегрину [38]. PKD1 експресована при раку простати і асоційована зі змінами клітинної агрегації і рухливості клітин in vitro. При раку молочної залози PKD1 формує комплекс з актинзв’язуючим білком кортактином, а також паксиліном [39], що свідчить про участь PKD1 у контролі здатності пухлинних клітин проникати у міжклітинний матрикс та утворювати метастази. При дрібноклітинному раку легені та раку прямої кишки також відзначають гіперекспресію PKD, а існування каскаду PKC/PKD у цих клітинах вказує на важливе значення РKD у їх аутокринно-опосередкованій проліферації [40]. Тому вважаємо за доцільне проаналізувати результати власних досліджень, щоб з’ясувати, яким чином виявлена гетерогенність показників експресії та аутофосфорилювання PKD може бути пов’язана з проліферативною активністю пухлинних клітин, розповсюдженістю процесу у хворих на РШ, наявністю метастазів тощо. У наших дослідженнях найвищий рівень експресії PKD1/2 при високому рівні рPKD1/2 у клітинах виявлений при виразці шлунка; при хронічному запальному процесі по типу псевдолімфоматозу шлунка рівень експресії PKD1/2 у цитоплазмі та в ядрі також був високим, що може свідчити про важливе значення кінази у запальному процесі (див. рис. 2, 3). При АКШ рPKD1/2 виявлено залежно від ступеня диференціювання як в ядрі, так і в цитоплазмі (більші за розміром клітини мали сильнішу ядерну реакцію). При помірнодиференційованій АКШ відзначали високий рівень експресії та фосфорилювання PKD1/2 як у ядрі, так і в цитоплазмі. При низькодиференційованній АКШ визначали низький рівень експресії та фосфорилювання PKD1/2, виключно в цитоплазмі клітин. Оскільки PKD1/2 виконують різні функції у цитоплазмі та ядрі, можливо, присутність їх у ядрі пухлинних клітин при помірнодиференційованих АКШ пов’язана з

епігенетичним контролем роботи генів.

Нами були виявлені кореляції між рівнем експресії PKD1/2 і рPKD1/2 та кількістю проліферуючих пухлинних клітин залежно від рівня диференціювання АКШ. Як правило, низькодиференційовані АКШ характеризувалися помірним рівнем проліферуючих клітин і низьким рівнем експресії та аутофосфорилювання PKD1/2. Навпаки, у помірнодиференційованих АКШ був значно вищий рівень експресії IPO-38 і високий рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2; існує пряма кореляція між рівнем експресії IPO-38 та PKD1/2 у ядрі пухлинних клітин (r = 0,52, p < 0,05).

Виявлена обернена кореляція між місцем локалізації пухлини і рівнем експресії рPKD1/2

у ядрі клітин (r = –0,46, p < 0,05) — чим нижче розташована пухлина, тим вищим був рівень аутофосфорилювання досліджуваних кіназ. Існує також обернена кореляція між місцем локалізації пухлини і рівнем експресії IPO-38 у ядрі пухлинних клітин (r = –0,67, p < 0,05). Можливо, зазначені особливості пов’язані зі зниженим рівнем pH у тілі шлунка та його пілоричному відділі, особливостями гістологічної будови відділів шлунка або наявністю мікроорганізмів, антигени яких можуть активувати епітеліальні клітини шлунка, що призводить до аутофосфорилювання PKD1/2.

ВИСНОВКИ

1. Найвищий рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 виявлено при виразці шлунка, високий рівень експресії PKD1/2 — при хронічному запальному процесі по типу псевдолімфоматозу шлунка.

2. Рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 корелював з рівнем диференціювання АКШ. На фоні високого рівня експресії IРО-38 при помірнодиференційованих АКШ відзначали високий рівень експресії PKD1/2 та рPKD1/2 у ядрі та цитоплазмі, а для низькодиференційованих АКШ був характерний низький рівень експресії та аутофосфорилювання PKD1/2 у цитоплазмі при низькому рівні експресії IРО-38.

3. При помірнодиференційованих АКШ рівень експресії PKD1/2 та рPKD1/2 у пухлинних і умовнонормальних тканинах був практично однаковий. У той же час у клітинах низькодиференційованих АКШ визначений нижчий рівень експресії цих кіназ порівняно з умовно-нормальними тканинами.

ЛІТЕРАТУРА

1. Bild AH, Yao G, Chang JT, et al. Oncogenic pathway signatures in human cancers as a guide to targeted therapies. Nature 2006; 439: 353–7.

2. Dicken BJ, Bigam DL, Cass C, et al. Gastric Adenocarcinoma. Review and Considerations for Future Directions. Ann Surg 2005; 241 (1): 27–39.

3. Manning G, Whyte DB, Martinez R, et al. The protein kinase complement of the human genome. Science 2002; 298: 1912–34.

4. Abedi H, Rozengurt E, Zachary I. Rapid activation of the novel serine/ threonine protein kinase, protein kinase D by phorbol esters, angiotensin II and PDGF-BB in vascular smooth muscle cells. FEBS Lett 1998; 427: 209–12.

5. Zhukova E, Sinnett-Smith J, Rozengurt E. Protein kinase D potentiates DNA synthesis and cell proliferation induced by bombesin, vasopressin or phorbol esters in Swiss 3T3 cell. J Biol Chem 2001; 276 (43): 40298–305.

6. Matthews SA, Pettit GR, Rozengurt E. Bryostatin 1 induces biphasic activation of protein kinase D in intact cells. J Biol Chem 1997; 272: 20245–50.

7. Storz P, Toker A. NF-kB signaling an alternate pathway for oxidative stress responses. Cell Cycle 2003; 2: 9–10.

8. Waldron RT, Rozengurt E. Oxidative stress induces protein kinase D activation in intact cells. Involvement of Src and dependence on protein kinase C. J Biol Chem 2000; 275: 17114–21.

9. Van Lint J, Ni Y, Valius M, et al. Platelet-derived growth factor stimulates protein kinase D through the activation of

   phospholipase C and protein kinase C. J Biol Chem 1998; 273: 7038–43.

10. Johannes FJ, Horn J, Link G, et al. Protein kinase Cμ downregulation of tumor-necrosis-factor-induced apoptosis correlates with enhanced expression of NF-kB-dependent protective genes. Eur J Biochem 1998; 257: 47–54.

11. Sturany S, Van Lint J, Gilchrist A, et al. Mechanism of activation of protein kinase D2 (PKD2) by the CCKB/gastrin receptor. J Biol Chem 2002; 277 (33): 29431–6.

12. Storz P, Doppler H, Toker A. Activation loop phosphorylation controls protein kinase D-dependent activation of NF-kB. Mol Pharmacol 2004; 66: 870–9.

13. Storz P, Doppler H, Johannes FJ, Toker A. Tyrosine phosphorylation of protein kinase D in the pleckstrin homology domain leads to activation. J Biol Chem 2003; 278: 17969–76.

14. Storz P, Toker A. Protein kinase D mediates a stress- induced NF-kB activation and survival pathway. Embo J 2003; 22: 109–20.

15. Van Lint J, Rykх A, Maeda Y. Protein kinase D: an intracellular traffic regulator on the move. Trends Cell Biol 2002; 12 (4): 193–200.

16. Vertommen D, Rider M, Ni Y, et al. Regulation of protein kinase D by multisite phosphorylation. Identification of phosphorylation sites by mass spectrometry and characterization by site-directed mutagenesis. J Biol Chem 2000; 275: 19567–76.

17. Rykx A, De Kimpe L, Mikhalap S, et al. Protein kinase D: а family affair. FEBS letters 2003; 546: 81–6.

18. Oancea E, Bezzerides VJ, Greka A, Clapham DE. Mechanism of persistent protein kinase D1 translocation and activation. Dev Cell 2003; 4: 561–74.

19. Waldron RT, Rozengurt E. Protein kinase C phosphorylates protein kinase D activation loop Ser744 and Ser748 and releases autoinhibition by the pleckstrin homology domain. J Biol Chem 2003; 278: 154–63.

20. Hausser A, Link G, Bamberg L, et al. Structural requirements for localization and activation of protein kinase Cμ (PKCμ) at the Golgi compartment. J Cell Biol 2002; 156: 65–74.

21. Jamora C, Yamanouye N, Van Lint J, et al. Gγ-mediated regulation of Golgi organization is through the direct activation of protein kinase D. Cell 1999; 98: 59–68.

22. Ponnambalam S, Baldwin SA. Constitutive protein secretion from the trans-Golgi network to the plasma membrane. Mol Membr Biol 2003; 20: 129–39.

23. Rey O, Rozengurt E. Protein kinase D interacts with Golgi via its cysteine-rich domain. Biochem Biophys Res Commun 2001; 287: 21–6.

24. Vantus T, Vertommen D, Saelens X, еt al. Doxorubicin- induced activation of protein kinase D1 through caspase-mediated proteolytic cleavage: identification of two cleavage sites by microsequencing. Cell Signal 2004; 16: 703–9.

25. Bankaitis VA. Cell biology. Slick recruitment to the Golgi. Science 2002; 295: 290–1.

26. Rey O, Yuan J, Young SH, Rozengurt E. Protein kinase Cη/protein kinase D3 nuclear localization, catalytic activation, and intracellular redistribution in response to G protein-coupled receptor agonists. J Biol Chem 2003; 278: 23773–85.

27. Rey O, Yuan J, Rozengurt E. Intracellular redistribution of protein kinase D2 in response to G-protein-coupled receptor agonists. Biochem Biophys Res Commun 2003; 302: 817–24.

28. Waldron R, Rey O, Iglesias T, et al. Activation loop Ser744 and Ser748 in protein kinase D are transphosphorylated in vivo. J Biol Chem 2001; 276 (35): 32606–15.

29. Verdin E, Dequiedt F, Kasler HG. Class II histone deacetylases: versatile regulators. Trends Genet 2003; 19: 286–93.

30. Yaffe MB. How do 14-3-3 proteins work? Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypotesis. FEBS Lett 2002; 513: 53–7.

31. Wang QJ. PKD at the crossroads of DAG and PKC signaling. Trends Pharmacol Sci 2006; 27: 317–23.

32. Нirose F, Watanabe H, Takeichi N, et al. Effect of experimental immune atrophic gastritis on the induction of gastric carcinoma by x-irradation in ICR mice. Gann 1976; 67: 355–64.

33. Райхлин НТ, Кветной ИМ, Осадчук МА. APUD- система (общепатологичесские и онкологические аспекты). Обнинск, 1993. 235 с.

34. Willems G, Gepts W, Bremer A. Endogenous hypergastrinemia and cell proliferation in the fundic mucosa in dogs. Amer J Dig Dis 1977; 22 (5): 419–23.

35. Tahara E, Haizuka S. Effect of gastroenteropancreatic enocrine hormones on the histogenesis of gastric cancer in rats induced by N-methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidine, with special reference to development of scirrhous gastric cancer. Gann 1975; 66: 421–6.

36. Упоров АВ, Семиглазов ВФ, Пожарисский КМ. Иммуногистохимическое изучение клеток рака молочной железы с использованием разных маркеров пролиферации. Арх патологии 2000; 62 (2): 26–30.

37. Kim M, Jang HR, Kim JH, et al. Epigenetic inactivation of protein kinase D1 in gastric cancer and its role in gastric cancer cell migration and invasion. Carcinogenesis 2008; 29 (3): 629–37.

38. Woods AJ, White DP, Caswell PT, Norman JC. PKD1/PKCμ promotes αvβ3 integrin recycling and delivery to nascent focal adhesions. EMBO J 2004; 23 (13): 2531–43.

39. Bowden ET, Barth M, Thomas D, et al. An invasion- related complex of cortactin, paxillin and PKCμ associates with invadopodia at sites of extracellular matrix degradation. Oncogene 1999; 18 (31): 4440–9.

40. Mihailovic T, Marx M, Auer A, et al. Protein kinase D2 mediates activation of NF-kB by Bcr-Abl in Bcr-Abl+ human myeloid leukaemia cells. Cancer Res 2004; 64 (24): 8939–44.