КІЛЬКІСТЬ МІКРОЯДЕР І ОСОБЛИВОСТІ СТРУКТУРИ ХРОМАТИНУ В КЛІТИНАХ БУКАЛЬНОГО ЕПІТЕЛІЮ ТА РІВЕНЬ ГОМОЦИСТЕЇНУ У ПЛАЗМІ КРОВІ ЖІНОК З ПУХЛИНАМИ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ

В останні роки у багатьох наукових дослідженнях підкреслюється вагома роль гіпометилювання ДНК у виникненні та прогресії раку молочної залози (РМЗ) [10, 12]. Встановлено, що порушення метилування ДНК відзначають в усіх типах клітин, навіть у тих, які значно віддалені від основного місця локалізації пухлини [21]. Показано також, що кількість мікроядер (МЯ) та ступінь гетерохроматизації прямо корелюють із гіпометилуванням ДНК [15]. Водночас ефекти результуючого продукту порушення процесів метилування — гомоцистеїну (ГЦ) при формуванні злоякісного фенотипу клітин досліджено недостатньо[12, 13]. Встановлено, що ГЦ індукує in vitro гіперпроліферацію клітин колоректального раку [9], експресію макрофагами мРНК білків — прозапальних цитокінів [20], виявляє потенційно модулюючу дію на протеолітичний баланс, зокрема утворює тіолові сполуки, що інгібують металопротеінази 2 і 9 [11]. Є дані, що ГЦ виявляє ангіогенну активність та впливає на ключові позиції в процесах ангіогенезу і пухлинної інвазії[13] іщо ГЦінгібуєангіогенез та інвазію пухлин. Доведено, що із гіпометилуванням ДНК прямо корелює кількість МЯ та ступінь гетерохроматизації інтерфазних ядер; порядзцимпоказано тісний зв’язок між гіпометилуванням ДНК та розладами у метаболізмі ГЦ [15, 19].

Оцінкакількості МЯ може бутивикористана як непрямий спосіб визначення гіпометилювання геному, оскільки гіпометилювання сателітів 2 і 3 геномної ДНК призводить до втрати хромосом 1, 9 і 16 у вигляді МЯ, а кількість МЯ прямо корелює з гіпометилюванням геномної ДНК [15]. Гіпометилювання ДНК у свою чергу впливає на експресію генів, наслідком чого є зміна конформації хроматину та фенотипу клітин [15, 19].

Мета роботи — оцінка стабільності геному клітин букального епітелію (БЕ) шляхом дослідження кількості МЯ та структури хроматину ядер у зіставленні з вмістом гомоцистеїну у плазмі крові хворих з пухлинними процесами молочної залози (МЗ).

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом дослідження були зскребки БЕ 11 хворих на РМЗ I–II стадії (за класифікацією TNM) і 9 пацієнтів з фіброаденомою (ФАД) МЗ. Вік хворих коливався від 23 до 75 років, середній вік становив 50,2 ± 3,1 року. До обстеження хворим не проводили неоад’ювантну терапію та оперативне втручання.

Зскребки проміжного шару клітин БЕ наносили на чисті знежирені предметні скельця, підсушували їх при кімнатній температурі, забарвлювали за Папенгеймом та 1% розчином ацетоорсеїну за стандартними протоколами [3, 18]. Підрахунок кількості МЯ та вмісту гетерохроматинових гранул (ГГ) проводили за допомогою світлооптичного мікроскопу Micros MC 300 (Австрія) при збільшенні х 1000 (масляна імерсія). Для кількісної оцінки МЯ у кожному препараті підраховували 1000 клітин, результати виражали у ‰. Клітини з ознаками каріопікнозу, каріорексісу, каріолізісу, зфрагментованими ядрами, двоядерні клітини у підрахунок не включали. Ідентифікацію МЯ проводили, користуючись описаними у літературі критеріями [14]. Конденсацію інтерфазного хроматину у ядрах клітин БЕ вираховували на підставі вмісту ГГ. У кожному препараті підраховували ГГ у ядрах 30 клітин, результати виражали у % [18].

Концентрацію ГЦ у плазмі крові визначали іму­

ноферментним методом, використовуючи набори

«DIAZYME» та «AXIS–SHIELD» (США) згідно з про­

токоламифірм­виробників,іякантикоагулянт—ЕДТА. Забор крові для аналізу проводили у лежачому положенні вранці до сніданку, до прийому лікарських засобів.

Клінічні діагнози у всіх пацієнток верифіковані при гістологічному дослідженні видалених пухлин. За морфологічними особливостями злоякісні пухлини відпові­дали інфільтруючому протоковому РМЗ, доброякісні– ФАД МЗ з гіперплазією епітелію протоків.

Статистичні розрахунки проводили, використовуючи критерій Ст’юдента та кореляційний аналіз [4].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Якісний аналіз цитологічних препаратів, виготовлених із зскребків БЕ, дозволив ідентифікувати МЯ з діаметром меншим, ніж ⅓ діаметра основного ядра клітини. Вони розташовувались у цитоплазмі, чітко простежувались у тому ж фокусі мікроскопу, що і ядро, та мали подібний до останнього колір і текстуру хроматину. За формою МЯ округлі або овальні та чітко відокремлювалися від ядра (рис. 1). Структуру інтерфазного хроматину у ядрах визначали на підставі вмісту ГГ, що мали більш інтенсивне забарвлення та чітко відокремлювалися від загальної текстури хроматину (рис. 2).

Рис. 1. МЯ у цитоплазмі однієї з клітин проміжного прошарку БЕ. Забарвлення за Папенгеймом. Зб. × 1000

Результати дослідження кількості МЯ та вмісту ГГ у клітинах БЕ хворих на РМЗ і ФАД МЗ та концентрацій ГЦ у плазмі крові наведені у табл. 1.

Таблиця 1 Результати цитологічних та імуноферментних досліджень

у хворих на РМЗ і ФАД МЗ

В табл. 1, 2, 3 – *чисельник – середні значення (М ± m), знаменник – коливання показників min–max.

Отримані результати свідчать про достовірне збільшення (р < 0,05) кількості МЯ у БЕ хворих на РМЗ відносно значень пацієнток з ФАД МЗ. Не встановлено достовірної різниці між групами за вмістом ГГ. Відомо, що рівень ГЦ у плазмі крові здорових людей становить 5–15 мкмоль/л, що і вважали орієнтиром для оцінки власних досліджень [8]. Порівняльний аналіз концентрації ГЦ у плазмі крові хворих на РМЗ та ФАД не виявив достовірної різниці між групами за цим показником. Слід відзначити значні індивідуальні коливання концентрації ГЦ. Тому за рівнем концентрації ГЦ у плазмі крові кожну з груп розподі­ лили на підгрупи. У 1­шу підгрупу увійшли хворі з доброякісними або злоякісними новоутвореннями МЗ з рівнем концентрації ГЦ у плазмі від 5,1 до 15,0 мкмоль/л. У пацієнток 2­ї підгрупи рівень ГЦ коливався від 15,1 до 32,0 мкмоль/л. Середні дані щодо кількості МЯ та вмісту ГГ та індивідуальних коливань цих показників у клітинах БЕ хворих на РМЗ та ФАД із різною концентрацією ГЦ у плазмі крові наведені у табл. 2 та 3. Порівняльний аналіз кількості МЯ у БЕ хворих на РМЗ залежно від рівня ГЦ у плазмі крові виявив тенденцію до її збільшення по мірі зростання концентрації ГЦ; в обох підгрупах визначено пряму кореляційну залежність між цими показниками: відповідно r = 0,50 та r = 0,52. Одночасно в обох підгрупах відзначали тенденцію до зниження вмісту ГГ із підвищенням концентрації ГЦ у плазмі крові (див. табл. 2). Виявлено сильну кореляційну залежність між кількістю МЯ у БЕ і концентрацією ГЦ у плазмі крові хворих обох підгруп: відповідно r = –0,65 та r = –0,72.

Таблиця 2

Кількість МЯ та вміст ГГ у клітинах БЕ пацієнтів з РМЗ залежно від концентрації ГЦ у плазмі крові

Рис. 2. Інтерфазне ядро БЕ з ознаками гетерохроматизації.

Забарвлення за Папенгеймом. Зб. × 1000

У БЕ хворих з ФАД МЗ відзначено тенденцію до збільшення кількості МЯ та достовірне зниження (р < 0,05) вмісту ГГ із підвищенням концентрації ГЦ у плазмі крові (див. табл. 3). Виявлено пряму кореляційну залежність між кількістю МЯ та рівнем ГЦ (r = 0,52) і сильну зворотню кореляцій­

ну залежність між ГГ і рівнем ГЦ для хворих як 1­ї (r = –0,98), так і 2­ї (r = –0,50) підгрупи.

Таблиця 3 Кількість МЯ та ГГ у клітинах БЕ хворих з ФАД МЗ залежно від

концентрації ГЦ у плазмі крові

Порівняльний аналіз кількості МЯ та вмісту ГГ у БЕ хворих зі злоякісними та доброякісними новоутвореннями виявив достовірні відмінності цих показників. У хворих на РМЗ, що увійшли у 1­шу підгрупу, кількість МЯ становила 5,77‰, у пацієнтів з ФАД – 2,86‰ (р < 0,05); достовірних змін вмісту ГГ у БЕ не виявлено. У хворих на РМЗ, що увійшли у 2­гу підгрупу, кількість МЯ становила 6,68‰, а з ФАД — 3,53‰ (р < 0,05); достовірних змін вмісту ГГ у хворих даної підгрупи також не виявлено, проте відзначено пряму кореляційну залежність між рівнем ГЦ та кількістю МЯ (r = 0,56) та зворотню — між рівнем ГЦ та вмістом ГГ (r = –0,72). Отже, у БЕ хворих на РМЗ встановлена збільшена кількість МЯ, що свідчить про значніше порушення генетичної стабільності клітин, ніж у хворих ФАД.

Відомо, що розвиток і прогресія злоякісного росту пов’язані із появою стійкої нестабільності геному у клітинах організму. Такі зміни відзначають не тільки у пухлинних клітиннах, але і у соматичних немалігнізованих клітинах [1, 21]. Загальновизнаним, швидким та інформативним тестом для оцінки хромосомних пошкоджень, у тому числі втрати хромосом у клітинах, є мікроядерний тест, що широко використовують як показник нестабільності геному у медико­біологічній практиці [6, 7, 16]. Але деякі аспекти цієї проблеми, зокрема формування МЯ, залишаються ще дискусійними. Вважається, що формування малих за розміром МЯ пов’язане із відставанням ацентричних фрагментів, а втрата цілих хромосом призводить до утворення великих за розміром МЯ [2]. Існує точка зору про походження МЯ, незалежно від каріокінезу, шляхом «інтерфазної демінуції хроматину» [5]. Дані літератури підтверджують подібний механізм утворення МЯ у лімфоцитах крові людини, стимульованих фітогемаглютині­ ном після опромінення in vitro [5]. Встановлено збільшення кількості МЯ порівняно з показниками здорових осіб у БЕ пацієнтів зі шлунково­кишковими захворюваннями та при гіпотоксичному пошкодженні щитовидної залози [6, 7]. Також існують дані літератури про збільшення кількості МЯ у БЕ людей, які працюють із токсичними речовинами [17].

Результати порівняння результатів власних досліджень із даними літератури свідчать, що кількість МЯ у БЕ хворих зі злоякісними та доброякісними новоутвореннями МЗ вища, ніж у

пацієнтів із соматичними не пухлинними захворюваннями [6, 7, 16]. Зміна структури інтерфазного хроматину ядер БЕ пацієнтів з гіпергомоцистеїнемією, яка супроводжується тенденцією до деконденсації хроматину, ймовірно, пов’язана із деметилуванням 5­метилцитозину та послабленням зв’язку між комплементарними парами основ гуаніну та цитозину. Поряд з цим встановлено зниження вмісту ГГ у інтефазних ядрах БЕ хворих на РМЗ та ФАД МЗ [15, 19]. Проте є дані, що структура хроматину інтерфазних ядер у жі­ нок зі злоякісними новоутвореннями МЗ має зовсім інший характер змін, ніж у пацієнтів із доброякісними пухлинами [1]. Як показано нами, кількість МЯ та вміст ГГ у БЕ хворих зі злоякісними та доброякісними новоутвореннями МЗ достовірно корелює з рівнем ГЦ у плазмі крові, що у свою чергу може слугувати свідченням гіпометилювання ДНК [15, 19]. Існують дані експериментальних досліджень на клітинних лініях раку кишечнику TC71­MA та раку легені SCLC6, що доводять взаємозв’язок гіпометилювання ДНК та гіпергомоцистеінемії [17]. Отже, отримані результати можуть бути використані як показники нестабільності геному соматичних немалігнізованих клі­ тин у хворих з патологією МЗ.

ВИСНОВКИ

1. У БЕ хворих на РМЗ порівняно з пацієнтками з ФАД МЗ виявлено достовірне збільшення кількості МЯ, яка у середньому становила 6,4 ± 0,9‰. Поряд з цим визначено тенденцію до зміни структури хроматину інтерфазних ядер, що проявляється у зниженні вмісту ГГ.

2. Уперше встановлено пряму кореляційну залежність між кількістю МЯ та концентрацією ГЦ у плазмі крові хворих на РМЗ та ФАД МЗ і відзначено зворотню кореляційну залежність між вмістом ГГ та рівнем ГЦ.

ЛІТЕРАТУРА

1. Бородай НВ. Цитогенетичні пухлиноасоційовані змі­ ни букального епітелію при доброякісних процесах та раках молочної та щитовидної залоз. [Автореф дис … д­ра мед наук]. Київ, 2000. 37 с.

2. Ильинских НН, Новицкий ВВ, Ванчугова НН, Ильинских ИН. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск, 1992. 220 с.

3. Клінічна лабораторна діагностика: Нормативне виробничо­практичне видання. Київ: Медінформ, 2005: 408–9.

4. Лакін ГФ. Биометрия. Москва: Высшая школа, 1990. 352 с.

5. Манских ВН. К вопросу о механизмах образования микроядер в соматических клетках бесхвостых амфибий в норме и при действии N­нитрозо­N­метилкарбамида. БЭБМ 2006; 141 (2): 217–20.

6. Павлов АВ, Гансбургский МА, Гасбургский АН и др. Использование микроядерного теста для выявления гипотоксического повреждения щитовидной железы. БЭБМ 2006; 41 (1): 99–100.

7. Сокольник СН. Мікроядерний індекс у соматичних клітинах дітей, хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки. Ліки України 2004; (7–8): 101–4.

8. Шевченко ОП. Гомоцистеин — новый фактор атеросклероза и тромбоза. Клин лаб диагностика 2004; (10): 25–31.

9. . Akoglu B, Milovic V, Caspary WF, Faust D. Hyperproliferation of homocysteine­treated colon cancer cells is reversed by folate and 5­methyltetrahydrofolate. Eur J Nutr 2004; 43 (2): 93–9.

10. Beetstra S, Salisbury C, Turner J, et al. Lymphocytes of BRCA1 and BRCA2 germ­line mutation carriers, with or without breast cancer, are not abnormally sensitive to the chromosome damaging effect of moderate folate deficiency. Carcinogenesis 2006; 27 (3): 517–24.

11. Chavarria T, Rodriguez-Nieto S, Sanchez-Jimenez F, et al. Homocysteine is a potent inhibitor of human tumor cell gelatinases. Biochem Biophys Res Commun 2003; 303 (2): 572–5.

12. Kim YI. Nutritional epigenetics: impact of folate deficiency on DNA methylation and colon cancer susceptibility. J Nutr 2005; 135 (11): 2703–9.

13. Martinez-Poveda B, Chavarria T, Sanchez-Jimenez F, et al. An in vitro evaluation of the effects of homocysteine thiolactone on key steps of angiogenesis and tumor invasion. Biochem Biophys Res Commun 2003; 311 (3): 649–53.

14. Martino-Roth MG, Viegas J, Roth DM. Occupational genotoxity risk evaluation through the comet assay and the micronucleus test. Gen Mol Researh 2003; 2 (4): 410–7.

15. Michiyo Kimura, Keizo Umegaki, Mitsuru Higuchi, et al. Methylenetetrahydrofolate reductase C677C polymorphism, folic acid and riboflavin are impotant determinants of genome stability in cultured human lymphocytes. Am Society Nutr Sci 2004: 49–56.

16. Nersesyn AK, Adamyan RT. Micronuclei level in exfoliated buccal mucosa cells of patients with benign and malignant tumors of female reproductive organs and breast. Цитол и генет 2004; (3): 72–5.

17. Poirson-Bichat F, Goncaves RA, Miccoli I, et al. Methionine deplention enhances the antitumoral efficancy of cytotoxic agents in drug­resistant human tumor xenografts. Clin Cancer Res 2000; 6 (2): 643–53.

18. Shckorbatov YG, Lyubov A, Zhuravlova VV, et al. Chromatin structure and the state of human organism. Cell Biology Int 2005; 29: 77–81.

19. S Jill James, Melnyk S, Pogribna M, et al. Elevation in s­adenosylhomocysteine and DNA hypomethylation: potential epigenetic mechanism for homocysteine­related pathology. J Nutr 2002: 132 (8): 2361–6.

20. Su SJ, Huang LW, Pai LS, et al. Homocysteine at pathophysiologic concentrations activates human monocyte and induces cytokine expression and inhibits macrophage migration inhibitory factor expression. Nutrition 2005; 21 (10): 994– 1002.

21. Wojewodzka M, Kruszewski M, Iwanenko T, et al. Application of the comet assay for monitoring DNA damage in workers exposed to chronic low­dose irradiation. I Strand breakage. Mutat Res 1998: 416 (1–2): 21–35.