ОЦІНКА ПРОТИПУХЛИННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЛЕКТИНУ B. SUBTILIS IMB B-7724 В ДОСЛІДЖЕННЯХ IN VIVO

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-24-1-2022-g.10306
Висока захворюваність та смертність при зло­якісних новоутвореннях залишаються однією з основних проблем сучасної медицини, незважаючи на останні досягнення в їх діагностиці та лікуванні. Продовжується пошук засобів (зокрема речовин природного походження), що можуть бути використані в якості нових протипухлинних препаратів. До таких речовин належать лектини — глікопротеїни неімунної природи, які характеризуються здатністю специфічно розпізнавати та оборотно зв’язуватися з вуглеводами та глікокон’югатами. Лектини широко представлені в складі живих організмів, включаючи рослини, тварин та мікроорганізми. Широкий спектр біологічних властивостей лектинів зумовлений високоспецифічною спорідненістю до певних олігосахаридів клітинної поверхні. Продемонстровані противірусні, антибактеріальні, фунгіцидні, імуномодулювальні та протипухлинні властивості ряду лектинів [1–4].

Відомо, що пухлинні клітини експресують та/або секретують глікокон’югати з аберрантною структурою глікану. Вуглеводні детермінанти на поверхні злоякісно трансформованих клітин більш сіалізовані і менш сульфатовані; містять Т-антиген та Тn-антигени у сіалізованій формі порівняно з нормальними клітинами; часто спостерігають укорочення та розгалуження мембранних вуглеводних структур [5–7]. Аберантні глікани можуть бути задіяні в процесах міжклітинної взаємодії та передачі сигналів, дисоціації та інвазії пухлинних клітин, пухлинному ангіогенезі, метастазуванні, модуляції імунної відповіді. Показано, що такі молекулярні структури є раково-асоційованими, можуть бути мішенями для цитотоксичного впливу лектинів, а також мають діагностичне і прогностичне значення при виявленні пухлин [8, 9]. Властивість лектинів зв’язувати специфічні вуглеводні групи зумовлює їх використання в якості засобів для диференційної діагностики доброякісних та злоякісних захворювань, прогнозування інвазивності пухлин та ефективності їх лікування.

Протипухлинна активність лектинів може бути реалізована шляхом прямої (безпосередньо щодо пухлинних клітин) або опосередкованої (через модулювання імунних протипухлинних реакцій) цито­токсичної дії. Прямий цитотоксичний вплив зумовлений зв’язуванням лектину з цукровмісним рецептором на клітинній поверхні та індукцією каскаду внутрішньоклітинних процесів, наслідком яких є апоптоз, аутофагія, блокування клітинного циклу та інгібування проліферації пухлинних клітин. Широко визнано, що рослинні лектини впливають як на апоптоз, так і на аутофагію, модулюючи сигнальні шляхи, до яких залучені різні фактори: білки родини Bcl-2, каспази, p53, PI3K/Akt, ERK, BNIP3, Ras-Raf та ATG [10–12]. Ґрунтовно дослідженими та описаними в науковій літературі є механізми прямої цитотоксичної дії лектинів рослинного походження, зокрема, конканаваліну А (ConA) (Canavalia ensiformis), рицину (Ricinus communis), лектину омели білої (Viscum album L.). На сьогодні найбільш вивченим з точки зору протипухлинних та імуномодулюючих ефектів є лектин омели. Продемонстровано, що його антипроліферативна ефективність щодо пухлинних клітин людини різного генезу (лейкемії, меланоми, раку молочної залози, печінки, легені) зумовлена індукцією процесу апоптозу в цих клітинах [13, 14].

Набагато менше в науковій літературі представлено даних щодо властивостей та можливості застосування в якості речовин з протипухлинною активністю лектинів мікробного походження. На сьогодні вже продемонстровані протипухлинні властивості лектинів, які продукуються сапрофітними бактеріями родини Bacillus: B. polymyxa 102, B. subtilis 316M, B. subtilis 7025 та ін. [15, 16]. Показано, що більшість бактеріальних лектинів — термостабільні, металонезалежні глікопротеїни, стійкі до зміни рН, зберігають активність та специфічність протягом тривалого часу. Позаклітинним лектинам сапрофітних штамів бацил притаманна рідкісна вуглеводна специфічність до сіалових кислот або їх похідних. Враховуючи те, що злоякісно трансформовані клітини характеризуються надлишковою експресією сіалових кислот в структурі поверхневих глікокон’югатів, сіалоспецифічні лектини можна розглядати в якості потенційних протипухлинних агентів. Тому цікавим і перспективним у цьому напрямку є дослідження протипухлинної дії оригінального позаклітинного лектину, отриманого з мікроорганізмів іншого штаму родини Bacillus — B. subtilis ІМВ В-7724. У дослідженнях in vitro охарактеризовано його фізико-хімічні, біологічні властивості та показана цитотоксична активність щодо пухлинних клітин, що може свідчити про перспективність його використання в якості засобу протипухлинної терапії [17, 18]. Для подальшого вивчення протипухлинних властивостей лектину B. subtilis ІМВ В-7724 необхідним є проведення експериментальних досліджень у системі in vivo з використанням модельних пухлин різного ступеню злоякісності.

Виходячи з викладеного, метою роботи стало експериментальне дослідження протипухлинної ефективності лектину B. subtilis ІМВ В-7724 на моделях аденокарциноми Ерліха (АКЕ) та карциноми легені Льюїс (КЛЛ).

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведено на мишах ліній С57Bl/6J (самці, n = 20) та Balb/c (самки, n = 20), які були одержані з розплідника віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Вік тварин становив 2,0–2,5 міс, маса тіла — 19,0–22,0 г. Тварини перебували в стандартних умовах віварію з природним режимом освітлення на повноцінному раціоні харчування. Утримання мишей та робота з ними здійснювалися відповідно до стандартних міжнародних правил з біологічної етики та Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях [19, 20].

Моделі пухлинного росту. У роботі використано 2 експериментальні моделі: АКЕ та КЛЛ. Пухлинні клітини обох штамів одержували з Банку клітинних ліній з тканин людини та тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

КЛЛ виникла спонтанно як карцинома легені у миші лінії С57Bl/6J у 1951 р. Метастазує гематогенно в легені практично в 100% випадків [21]. Для пере­щеплення пухлин клітини КЛЛ вводили мишам лінії С57Bl/6J внутрішньом’язево у стегно в кількості 4•105 клітин/мишу.

АКЕ виникла спонтанно у миші-самиці в 1905 р. як аденокарцинома молочної залози [22]. За звичайних умов пухлина не метастазує. Для перещеплення пухлин клітини АКЕ вводили мишам лінії Balb/c внутрішньом’язево у стегно в кількості 5•105 клітин/мишу.

Бактеріальний лектин. Продуцентом лектину є спороутворювальні грампозитивні сапрофітні бактерії штаму B. subtilis ІMB В-7724 (задепонований у колекції Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ) [23]. Лектин отримували з культуральної рідини мікроорганізму, як описано [24]. Отримана речовина підлягала ліофілізації в діапазоні температур від -32 до +24 °С. Бактеріальний лектин зберігається у вигляді аморфного порошку за -20 °С протягом тривалого часу, стійкий до зміни рН середовища, має високу термостабільність, добре розчиняється у воді та буферних розчинах (зокрема у фізіологічному розчині NaCl).

Схеми експерименту. Схеми проведення експерименту були аналогічними для обох моделей пухлинного росту. Після перещеплення пухлинних клітин (АКЕ або КЛЛ) експериментальних тварин розділяли на 2 групи: «Контроль пухлинного росту (КПР)» (n = 10) — неліковані миші з пухлинами; «Лектин» (n = 10) — миші з пухлинами, яким, починаючи з 2-ї доби після трансплантації пухлинних клітин, вводили лектин В. subtilis ІМВ В-7724 (підшкірно, у дозі 1 мг/кг маси, через день, загальний курс — 10 введень).

Оцінка протипухлинного ефекту. Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками [21]: латентний період появи пухлини, частота виникнення пухлин (%), розміри пухлинного вузла (об’єм в міліметрах кубічних) на 14-, 21-, 28-, 35-ту доби росту пухлин, середню тривалість житття тварин з пухлинами. Об’єм пухлини (V, мм3) розраховували за формулою:

де d — діаметр пухлини, мм.

Протипухлинний ефект оцінювали за розрахованими індексами гальмування росту пухлини (ІГРП) та збільшення тривалості життя (ІЗТЖ) тварин в експерименті.

де Vконтр — середній об’єм пухлини в контрольній групі, Vдосл — середній об’єм пухлини в дослідній групі.

де СТЖдослід — середня тривалість життя в дослідній групі, СТЖконтр — середня тривалість життя в контрольній групі.

Для метастатичної пухлини (КЛЛ) додатково визначали кількість мишей в групі, які мали метастази в легені, середню кількість метастазів на одну тварину та розраховували індекс інгібування метастазування (ІІМ) за формулою:

де Ак і А — кількість тварин з метастазами в контрольній і дослідній групах відповідно; Вк і В — середня кількість метастазів у легенях тварин конт­рольної та дослідної груп відповідно.

Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики з використанням GraphPad Prism 8.0.1 (Graphpad Software Inc., США) [25]. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними групами оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними показниками за p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Застосування лектину B. subtilis IMB B-7724 не впливало на частоту прищеплення пухлин незалежно від експериментальної моделі пухлинного росту: після трансплантації пухлини виникли у всіх мишей груп «КПР» і «Лектин». Проте аналіз показників, що характеризують подальший перебіг пухлинного процесу, свідчив про певні відмінності в ефективності застосування лектину B. subtilis IMB B-7724 у мишей з АКЕ та КЛЛ. Латентний період виникнення пухлин у мишей з АКЕ, яким вводили бактеріальний лектин, перевищував показник групи «КПР» в 1,4 разу (відповідно, 7,4 ± 0,2 і 5,4 ± 0,1 діб, р <0,05). Після перещеплення клітин КЛЛ термін виникнення пухлин у тварин, яким вводили бактеріальний лектин, і нелікованих мишей групи «КПР» був практично однаковим і становив 9,5 ± 1,3 і 9,3 ± 1,2 діб відповідно.

У подальшому динаміка росту пухлин у дослідних мишей з АКЕ та КЛЛ також суттєво відрізнялася. Проведення курсу лікування з використанням лектину B. subtilis IMB B-7724 мишам з аденокарциномою супроводжувалося суттєвим гальмуванням росту первинної пухлини (рис. 1а). Введення лектину мишам з КЛЛ було менш ефективним. Хоча протягом усього терміну експерименту швидкість росту пухлин у мишей групи «Лектин» мала тенденцію до уповільнення порівняно з нелікованими тваринами, не було зареєстровано статистично достовірних відмінностей між цими показниками через їх значну гетерогенізацію (рис. 1б). Показники ІГРП становили відповідно 53,2 ± 1,4 (АКЕ) та 18,2 ± 1,8% (КЛЛ). Тобто, лектин B. subtilis IMB B-7724 виявився більш ефективним на моделі АКЕ.
аб

Потрібно відмітити, що у мишей з КЛЛ за умови введення бактеріального лектину відмічена тенденція до уповільнення процесу метастазування порівняно з нелікованими тваринами — ІІМ становив 36,0 ± 4,5%. Тобто, у мишей з КЛЛ лектин B. subtilis IMB B-7724 практично не впливав на ріст первинної пухлини, проте мав певний антимета­статичний ефект.

Іншими інформативними показниками експериментальної оцінки протипухлинної ефективності засобів терапії є виживаність та середня тривалість життя дослідних тварин (рис. 2). Результатом 10-кратного введення мишам Balb/c з АКЕ бактеріального лектину було статистично достовірне підвищення показника середньої тривалості життя — в 1,8 разу порівняно з нелікованими, р <0,05. Якщо на 42-гу добу пухлинного процесу в групі «КПР» не залишилося жодної тварини, застосування лектину дозволило збільшити тривалість життя частини мишей до 63–73 діб з моменту перещеплення пухлинних клітин (див. рис. 2а). Розрахований для цієї моделі пухлинного росту ІЗТЖ становив 78,0%. Загальноприйнятими критеріями для оцінки ефективності речовин з протипухлинною активністю при проведенні експериментальних досліджень вважають показники гальмування росту пухлини та збільшення тривалості життя тварин понад 50,0% [21].

Отже, на моделі АКЕ лектин продемонстрував високу протипухлинну активність. На моделі КЛЛ позитивний вплив лектину B. subtilis IMB B-7724 на показники тривалості життя тварин з пухлинами був виражений значно меншою мірою (див. рис. 2б), у цих тварин ІЗТЖ становив 33,0%.
аб

Таким чином, на основі оцінки стандартних показників пухлинного росту застосування лектину B. subtilis IMB B-7724 виявилося більш ефективним на моделі неметастатичної солідної АКЕ. У тварин з метастатичною КЛЛ не спостерігали вираженого протипухлинного ефекту на тлі росту пухлини, проте був зареєстрований певний анти­метастатичний ефект. Ймовірно, гальмування мета­статичного процесу сприяло збільшенню середньої тривалості життя у мишей, яким вводили лектин. Такі особливості впливу бактеріального лектину можуть бути зумовлені відмінностями в глікозилюванні мембран пухлинних клітин різного генезу [26, 27]. Відомо, що поширеною формою аберантного глікозилювання пухлинних клітин людини є збільшення кількості гліканів, які містять сіалові кислоти: N-гліколілнейрамінову (Neu5Gc) або N-ацетилнейрамінову (Neu5Ac). Показано, що підвищення рівня Neu5Gc та Neu5Ac асоційоване з раком молочної залози, яєчника, передміхурової залози, товстої кишки, легені [28, 29, 30]. Враховуючи високу спорідненість лектину B. subtilis IMB B-7724 до сіалових кислот, можна припустити, що відмінність у ефективності застосування лектину на різних моделях пухлинного росту може бути зумовлена різними рівнями експресії Neu5Gc та Neu5Ac на клітинах АКЕ та КЛЛ. Як було показано в попередніх дослідженнях на моделі КЛЛ, застосування засобів імунотерапії є найбільш ефективним після хірургічного видалення первинної пухлини [31]. Тому доцільним видається подальше дослідження на цій моделі пухлинного росту антиметастатичної ефективності лектину B. subtilis IMB B-7724 за умови його застосування в ад’ювантному режимі.

ВИСНОВКИ

1. Продемонстровано протипухлинну ефективність лектину B. subtilis IMB B-7724 у тварин з модельним пухлинним процесом.

2. На моделі АКЕ лектин виявив високу протипухлинну активність, що проявилася в інгібуванні росту пухлини (на 53,2%) та збільшенні середньої тривалості життя тварин з пухлинами (на 78,0%).

3. У мишей з КЛЛ вплив лектину полягав у пригніченні метастазування (на 36,0%) та збільшенні середньої тривалості життя (на 33,0%).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Hopper JTS, Ambrose S, Grant OC, et al. The tetrameric plant lectin banlec neutralizes HIV through bidentate binding to specific viral glycans. Structure 2017; 25 (5): 773–82.e5. doi: 10.1016/j.str.2017.03.015
2. Asaduzzaman AKM, Hasan I, Chakrabortty A, et al. Moringa oleifera seed lectin inhibits Ehrlich ascites carcinoma cell growth by inducing apoptosis through the regulation of Bak and NF-κB gene expression. Int J BiolMacromol 2018; 107 (Pt B): 1936–44. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.10.070
3. Mbae KM, Umesha S, Manukumar HM. The rapeutic pro­perties of lectins in herbal supplements. Phytochem Rev 2018; 17 (3): 627–43. doi:10.1007/s11101-018-9572-2
4. Singh RS, Walia AK. Microbial lectins and their prospective mitogenic potential. Crit Rev Microbiol 2013; 40 (4): 329–347. doi: 10.3109/1040841X.2012.733680
5. Reily C, Stewart TJ, Renfrow MB, Novak J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol 2019; 15 (6): 346–66. doi: 10.1038/s41581-019-0129-4
6. Pearce OMT. Cancer glycan epitopes: biosynthesis, structure and function. Glycobiology 2018; 28 (9): 670–96. doi: 10.1093/glycob/cwy023
7. Taniguchi N, Kizuka Y. Glycans and cancer: role of N-glycans in cancer biomarker, progression and metastasis, and therapeutics. Adv Cancer Res 2015; 126: 11–51. doi: 10.1016/bs.acr.2014.11.001
8. Mazalovska M, Kouokam JC. Plant-derived lectins as potential cancer therapeutics and diagnostic tools. Biomed Res Int 2020; 1631394. doi:10.1155/2020/1631394
9. Gupta A. Emerging applications of lectins in cancer detection and biomedicine. Materials Today: Proceedings 2020; 31 (2): 651–61. doi:10.1016/j.matpr.2020.05.810
10. Ryva B, Zhang K, Asthana A, et al. Wheat germ agglutininasa potential therapeutic agentfor leukemia. Front Oncol 2019; 9: 100. doi: 10.3389/fonc.2019.00100
11. Shi Z, Li WW, Tang Y, Cheng LJ. A novel molecular model of plant lectin-induced programmed cell death in cancer. Biol Pharm Bull 2017; 40 (10): 1625–29. doi: 10.1248/bpb.b17-00363
12. Cavada BS, Silva MTL, Osterne VJS, et al. Canavalia bonariensis lectin: molecular bases of glycoconjugates interaction and antiglioma potential. Int J Biol Macromol 2018; 106: 369–78. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.08.023
13. Fu LL, Zhou CC, Yao S, et al. Plant lectins: targeting programmed cell death pathways as antitumor agents. Int J Biochem Cell Biol 2011; 43: 1442–9. doi: 10.1016/j.biocel.2011.07.004
14. Marvibaigi M, Supriyanto E, Amini N, et al. Preclinical and clinical effects of mistletoe against breast cancer. Biomed Res Int 2014; 2014: 1–15. doi: 10.1155/2014/785479
15. Podgorskii VS, Kovalenko EA, Karpova IS, et al. Extracellular lectin from saprophytic strains of bacteria of the genus Bacillus. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia 2014; 50 (3): 256–63. (in Russian) https://doi.org/10.1134/S0003683814030120
16. Tanasienko OA, Rudyk MP, Pozur VV, Potebnya GP. Influence of bacterial lectins on some reactions of nonspecific immunity in sarcoma 37 transplanted mice. Exp oncol 2010; 32 (4): 254–7. https://exp-oncology.com.ua/wp/wp-content/uploads/magazine/880.pdf?upload=
17. Fedosova NI, Cheremshenko NL, Hetman KI, et al. Physicochemical and cytotoxicity properties of Bacillus subtilis ІМВВ-7724 extracellular lectin. Mikrobiol Z 2021; 83 (1): 39–48. https://doi.org/10.15407/microbiolj83.01.039
18. Chumak A, Shcherbina V, Fedosova N, Chekhun V. Polarization of macrophages of mice under the influence of lectin from Bacillus subtilis IMB B-7724. EUREKA: Life Sciences 2021; 3: 3–10. doi: 10.21303/2504-5695.2021.001878.
19. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes ETS 123. Protection of Vertebrate Animals, 18.III.1986. 48. https://norecopa.no/media/2iydns5h/ets-123-original.pdf
20. Kozhemyakin UM, Filonenko MA, Saifetdinova GA. Scientific and practical recommendations for keeping laboratory animals and working with them. Kyiv: Avitsena; 2002; 156p (in Ukrainian).
21. Stefanov OV. Doklinichni doslidzhennya likarskykh zasobiv [Preclinical studies of drugs]. Kyiv: Avitsena; 2001 (in Ukrainian).
22. Dunham LJ, Stewart HL. A survey of transplantable and transmissible animal tumors. J Natl Cancer Inst 1953; 13 (5): 1299–377. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/13035452/
23. Chekhun VF, Didenko GV, Cheremshenko NL, et al. Strain of bacteria Bacillus subtilis ІMB В-7724 — producer of cytotoxic substances with antitumor activity (Pat.№131824 UA). Publ. 25.01.2019. Bul 2. (in Ukrainian).
24. Podgorsky VS. The method for the obtainmen of bacterial lectin, specific to sialic acids. (Pat. № 1791 UA). Publ. 23.01.1991. (in Ukrainian).
25. Sidenko AB, Vishnyakov VV, Isaev SM. Theory of statistics. М: MAX-Press, 2011. 343 p. (in Russian)
26. Zheng C, Terreni M, Sollogoub M, Zhang Y. Ganglioside GM3 and its role in cancer. Curr Med Chem 2019; 26 (16): 2933–47. doi: 10.2174/0929867325666180129100619
27. Magalhães A, Duarte HO, Reis CA. Aberrant glycosylation in cancer: a novel molecular mechanism controlling metastasis. Cancer Cell 2017; 31 (6): 733–5. doi: 10.1016/j.ccell.2017.05.012
28. Day CJ, Paton AW, Higgins MA, et al. Structure aided design of a Neu5Gc specific lectin. Sci Rep 2017; 7 (1): 1495. doi: 10.1038/s41598-017-01522-9
29. Dobie C, Skropeta D. Insights into the role of sialylation in cancer progression and metastasis. Br J Cancer 2021; 124 (1), 76–90. https://doi.org/10.1038/s41416-020-01126-7
30. Li C, Chen J, Lu B, et al. Molecular switch role of Akt in Polygonatum odoratum lectin-induced apoptosis and autophagy in human non-small cell lung cancer A549 cells. PLoS One 2014; 9 (7): e101526. doi: 10.1371/journal.pone.0101526
31. Fedosova NI, Karaman OM, Voeykova IM, et al. Compa­rison of the efficacy of different regimens of application of xenogeneic cancer vaccine on models of metastatic tumor growth. Oncology 2017; 19 (2): 145–50. (in Ukrainian).

Адреса для листування:
Чумак А.В.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: immunomod@ukr.net
Одержано: 21.02.2022