ВИЗНАЧЕННЯ ВПЛИВУ ТА ОПТИМІЗАЦІЯ ПАРАМЕТРІВ ПРОВЕДЕННЯ ФОТОБІОМОДУЛЯЦІЇ ТА ФОТОДИНАМІЧНОЇ ТЕРАПІЇ ДЛЯ КУЛЬТУР КЛІТИН РАКУ ПЕРЕДМІХУРОВОЇ ТА МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ РІЗНОГО СТУПЕНЯ ЗЛОЯКІСНОСТІ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-4-2021-g.9946

Лазерне випромінювання може бути самостійним напрямком у лікуванні пацієнтів зі злоякісними новоутвореннями із застосуванням таких методів, як лазерна термодеструкція, фотодинамічна терапія (ФДТ), а також поєднуватися з іншими відомими способами лікування з метою підсилення їх ефективності [1–3]. Зокрема, низькоінтенсивне лазерне випромінювання при використанні методу фотобіомодуляції (ФБМ) може зіграти синергетичну роль поруч із хіміотерапією за рахунок підвищення накопичення в малігнізованих тканинах цитостатичних препаратів та підсилення токсичності останніх. Фотобіомодуляційна терапія (ФБМТ) — метод застосування світла для зміни експресії або активності фоторецепторів ендогенних ферментів, ініціювання сигнальних шляхів, які модулюють клітинний та тканинний метаболізм, проліферацію клітин та запальну реакцію [4]. ФБМТ знайшла широке застосування в медицині для відновлення тканин, регенерації м’язів, зменшення вираженості болю під час лікування ран, зниження запалення. Джерелом світла зазвичай є лазери малої потужності (500 мВт) або світлодіоди в червоній та ближній інфрачервоній (ІЧ) ділянці спектру (600–850 нм), що забезпечує ефективне проникнення світла, відсутність канцерогенних чи мутагенних ефектів та мінімальний тепловий вплив [5, 6]. У ФБМ беруть участь активні форми кисню (АФК), у невеликих кількостях вони виступають посередниками та ініціюють каскад клітинних процесів. Іншими молекулами, які задіяні у механізмах ФБМ, є аденозинтрифосфат, Са²⁺ та NO. Зміни редокс-потенціалу, викликані ФБМ, активують редокс-чутливі фактори транскрипції, що призводить до проліферації фібробластів, синтезу колагену, модуляції запалення та антиоксидантних реакцій, посилення ангіогенезу, оксигенації та відновлення тканин. З іншого боку, лазерне випромінювання використовують і для проведення ФДТ — це метод лікування пацієнтів з онкологічними захворюваннями, заснований на взаємодії фотосенсибілізатора (ФС) зі світлом та молекулярним киснем, що виробляє в токсичній кількості АФК у тканинах-мішенях [7, 8]. Для реалізації фотодинамічного ефекту необхідна одночасна наявність трьох факторів: молекул нетоксичного барвника-ФС, лазерного світла з довжиною хвилі, що поглинається ФС, та молекулярного кисню. Молекула ФС, поглинувши квант лазерного світла, переходить у збуджений стан. Ця енергія збудження в біологічній тканині витрачається в фотореакціях двох типів. У реакціях першого типу відбувається утворення вільних радикалів, другого типу — утворення синглетного кисню. Ці АФК — синглетний кисень та вільні радикали — і є основними пошкоджувальними факторами при ФДТ [9, 10].

На сьогодні існує безліч методик проведення лазерного опромінення пухлин як з використанням ФБМ, так і для проведення ФДТ, однак, відсутні чіткий опис параметрів та залежності результату опромінення від різного морфологічного типу пухлин та ступеня їх злоякісності [11]. Окрім того, слід розглянути застосування ФБМ для підсилення ефективності хіміотерапії з використанням лазерного випромінювання з довжиною хвиль, що співпадають з вікном прозорості біологічних тканин, однак без непотрібного збудження фотохімічних агентів. Використання низькоінтенсивного лазерного опромінення (з визначеною дозою, часом опромінення і щільністю потужності з урахуванням типу пухлин та ступеня їх злоякісності) у поєднанні із хіміотерапією дозволить підвищити її ефективність і отримати прогнозовані результати лікування.

Мета роботи: дослідити особливості впливу лазерного випромінювання різної інтенсивності на клітини ліній раку передміхурової залози (РПЗ) та раку молочної залози (РМЗ), а також оцінити можливість поєднання світлової стимуляції (ФБМ) та лікування методами ФДТ та хіміотерапії для синергетичної дії на пухлинні клітини.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

В експериментальному дослідженні використано лінії клітин, отримані з клітинного банку ліній із тканин людини та тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького Національної академії наук України. Для проведення експериментальних робіт було обрано клітини РМЗ (лінія MCF-7) та РПЗ людини різного ступеня злоякісності (LNCaР — низький ступінь туморогенності, DU-145 — середній ступінь). Клітини вирощували в середовищі DMEM (Sigma, США) з додаванням рекомбінантного людського інсуліну (0,01 мг/мл) і 10% фетальної сироватки теляти (Biowest, Франція). Усі клітинні лінії культивували у зволоженій атмосфері з 5% СО₂, за температури 37 °С. Клітини пересівали двічі на тиждень зі щільністю посіву 2–4×10⁴ клітин на квадратний сантиметр поверхні.

Для оцінки показника виживаності клітин РПЗ та РМЗ людини після застосування різних режимів ФДТ використовували МТТ-тест. Клітини всіх досліджуваних ліній висаджували на лунки 96-лункових планшетів (SPL, Korea) в концентрації 1×10⁴ клітин/лунку в поживному середовищі DMEM з 10% фетальної сироватки теляти та 40 мкг/мл гентаміцину, інкубували протягом 24 год (у зволоженій атмосфері з 5% СО₂ за 37 °С), після чого проводили лазерне опромінення. Кількість живих клітин оцінювали за включенням МТТ (Sigma, США) (5 мг/мл фосфатно-сольового буферу). Для розчинення кристалів формазану у кожну лунку додавали 100 мкл диметилсульфоксиду (Serva, Німеччина). Величину оптичного поглинання розчину вимірювали за допомогою мультилункового спектрофотометра («STAT FAX 2100», США) за довжини хвилі 540 нм (ОП 540), визначали кількість живих клітин щодо контролю і проводили визначення життєздатності.

Під час проведення досліджень використовували випромінювання напівпровідникових лазерних приладів (Фотоніка Плюс, Україна) з довжинами хвиль 405, 445, 660, 635 та 810 нм. Потужність світлового випромінювання вимірювали за допомогою вимірювача оптичного випромінювання Ophir Optronics (CША).

При лазерному опроміненні клітин РПЗ (DU-145, LNCaР) у якості ФС використовували 5-амінолевуленову кислоту (5-ALA) (1 мМоль), при опроміненні клітин РМЗ (MCF-7) — до клітин додавали доксорубіцин (DOX) в концентрації 1 мкг/мл.

Для перевірки ефективності та оптимізації схем опромінення клітинних ліній РПЗ (DU-145, LNCaР) використовували лазерне випромінювання з довжинами хвиль 405 та 635 нм; час опромінення — 3, 7, 10, 12 хв та, відповідно, дози опромінення — 3,6; 8,4; 12; 14,4 Дж/cм², щільність потужності лазерного випромінювання становила 20 мВ/см2.

Для клітин ліній РМЗ в поєднанні з DOX використовували лазерне випромінювання 445 та 660 нм; щільність потужності становила 2 мВт/см² та 10 мВт/см² з часом опромінення 5 хв і 10 хв відповідними дозами 0,6 і 1,2 Дж/cм² та 3 і 6 Дж/cм².

Для порівняння ефекту ФБМ клітини лінії MCF-7 були опромінені ІЧ лазером зі щільністю потужності 50 мВ/см²; довжина хвиль — 810 нм, час опромінення — 1, 5, 10 хв, дози опромінення — 3, 15, 30 Дж/cм² відповідно.

Статистичний аналіз результатів проводили з використанням пакету програмного забезпечення Statistiсa 6.0 (StatSoft Inc., США). Усі дані отримані у трьох повторах і представляли як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). Для оцінки значущості відмінностей між групами використовували тест Ст’юдента, критичний рівень статистичної значимості приймали рівним 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для клітинних ліній РПЗ людини (DU-145 та LNCaР) визначали цитотоксичний вплив лазерного випромінювання в поєднанні з 5-ALA. Відомо, що 5-ALA стимулює утворення в організмі протопорфірину, який є фототоксичним під впливом світла з подальшим утворенням синглетного кисню [12]. У цьому методі 5-ALA використовується в ролі ендогенного ФС для проведення ФДТ. До переваг ендогенних ФС можна віднести те, що вони не вводяться ззовні, а виробляються організмом за певних умов; мають низьку токсичність для здорових тканин та високу швидкість виведення з організму. Окрім того, передбачається, що проникнення молекул 5-ALA через мембрани клітин пухлини буде більшим, ніж для ФС з великими розмірами молекул. Нами було порівняно ефективність використання лазерів з довжинами хвиль, що співпадають з піками поглинання протопорфірину в короткохвильовій (405 нм) та довгохвильовій (635 нм) ділянках, з дозами опромінення 3,6; 8,4; 12; 14,4 Дж/cм². Доза лазерного випромінювання коригувалася відповідно до різного часу опромінення (3, 7, 10, 12 хв) із однаковою щільністю потужності лазера 20 мВ/см² та з однаковою концентрацією 5-ALA (1 mM).

У дослідженнях з використанням клітинних культур DU-145 та LNCaP встановлено, що найбільша фотодинамічна активність для клітин обох ліній отримана за дози опромінення 10 Дж/cм² із довжиною хвиль лазерного випромінювання 635 нм. За даних параметрів виживаність становила 65,0 та 73,0% для клітин DU-145 та LNCaP відповідно (рис. 1, 2).

Під час опромінювання клітин такою ж дозою, але з іншою довжиною хвилі — 405 нм, виживаність клітин для LNCaP та DU-145 становила 21,0 та 32,0% відповідно (рис. 3, 4). Вищий рівень виживаності DU-145 може бути пов’язаний з більшим ступенем злоякісності цих клітин [13, 14].

Дослідження ефективності ФДТ (у монорежимі або при поєднанні з DOX) щодо клітин РМЗ показало збільшення цитотоксичного впливу DOX на клітини лінії MCF-7 на 25,0% порівняно з контролем при використанні лазерного випромінювання з довжиною хвиль 445 нм (рис. 5), що співпадає з піком поглинання DOX (близько 450 нм). Однак найчастіше для збудження DOX використовується лазер з довжиною хвилі 660 нм, тому нами було порівняно ефективність застосування двох довжин хвиль для підбору оптимального опромінення DOX без додаткової токсичності для клітин. Виявлено, що виживаність клітин після опромінення лазером з довжиною хвилі 660 нм з DOX становила близько 80,0%, що підтверджує важливість правильного підбору параметрів лазерного випромінювання залежно від використаної в якості ФС речовини.

Проведено дослідження з використанням лазерного випромінювання ІЧ спектру для збільшення токсичної дії DOX шляхом попередньої ФБМ клітин через підвищення накопичення хіміопрепарату в клітинах. У порівнянні з традиційним методом опромінення клітин лазером з довжиною хвиль 660 нм ІЧ випромінювання з довжиною хвиль 810 нм може проникати глибше та дозволить створити синергічний ефект низькоінтенсивного лазерного впливу (ФБМ) та токсичного впливу DOX.

Нами було проведено дослідження щодо вивчення виживаності клітин лінії MCF-7 за умови впливу DOX з попереднім опроміненням ІЧ лазером зі щільністю потужності 50 мВ/см² або після такого опромінення. Час опромінення клітин становив 1, 5, 10 хв з відповідною дозою опромінення — 3, 15, 30 Дж/см² (рис. 6).

Додаткове використання лазерного випромінювання з довжиною хвилі 810 нм в якості ФБМ дозволило підвищити загальний токсичний вплив DOX на клітини MCF-7. Експериментальні дані показали, що виживаність клітин після лазерного опромінення дозою 15 Дж/см² зменшилася на 31,0% порівняно з неопроміненими клітинами. Оскільки лазер 810 нм максимально рознесений з піком поглинання DOX, можна стверджувати про додаткове підвищення токсичності з використанням лазерного випромінювання шляхом ФБМ клітин без збудження хіміопрепарату.

ВИСНОВКИ

1. На культурах клітин РПЗ (DU-145, LNCaР) встановлено оптимальні параметри опромінення для отримання найвищої фотодинамічної активності ФС 5-ALA. Найбільш ефективним для вибраних клітинних ліній є лазерне випромінювання з довжиною хвиль 405 нм, щільністю потужності 20 мВ/см², час опромінення — 10 хв.

2. Використання лазерного випромінювання з довжиною хвилі, що точно співпадає з піком поглинання препаратів хіміотерапії, дозволяє збільшити їх токсичний вплив без підвищення дози та часу опромінення.

3. Додаткове використання лазерного опромінення для ФБМ поряд із введенням DOX дозволяє підвищити його загальний токсичний вплив на клітини MCF-7. Планується подальше дослідження використання ФБМ у поєднанні з ФДТ для покращення результатів лікування пацієнтів зі злоякісними новоутвореннями.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Allison RR, Bagnato VS, Sibata CH. Future of oncologic photodynamic therapy. Future Oncol 2010; 6 (6): 929–40.
2. Lanzafame RJ. Photobiomodulation: an enlightened path emerges. Photomed Laser Surg 2013; 31 (7): 299–300.
3. Hasan T, Ortel B, Solban N, Pogue B. Photodynamic the­rapy of cancer. Cancer Med 2003: 7: 537–48.
4. Hamblin MR, Carroll JD, de Freitas LF, et al. Low-level light therapy: photobiomodulation. 2018
5. Wilson BC, Patterson MS, Lilge L. Implicit and explicit dosimetry in photodynamic therapy: a new paradigm. Lasers Med Sci 1997; 12 (3): 182–99.
6. Chepurna O, Shton I, Kholin V, et al. Photodynamic the­rapy with laser scanning mode of tumor irradiation. В: 16th Conference on optical fibers and their applications. International society for optics and photonics; 2015: 98161F-98161F.
7. Castano AP, Demidova TN, Hamblin MR. Mechanisms in photodynamic therapy: part one — photosensitizers, photochemistry and cellular localization. Photodiagnosis Photodyn Ther 2004; 1 (4): 279–93.
8. Marmur ES, Schmults CD, Goldberg DJ. A review of laser and photodynamic therapy for the treatment of nonmelanoma skin cancer. Dermatol Surg 2004; 30: 264–71.
9. Mitra S, Foster TH. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs photofrin. Photochem Photobiol 2005; 81 (4): 849–59.
10. Mitra S. Photodynamic therapy: biophysical mechanisms and molecular responses. PhD thesis. University of Rochester, Rochester, New York, 2004. 260 р.
11. de Faria CM, Costa CS, Bagnato VS. Photobiomodulation effects on photodynamic therapy in HNSCC cell lines. J Photochem Photobiol B: Biol 2021; 217: 112170. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2021.112170.
12. Hatakeyama T, Murayama Y, Komatsu S, et al. Efficacy of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy using light-emitting diodes in human colon cancer cells. Oncol Rep 2021; 29 (3): 911–6.
13. Kutsevol N, Naumenko A, Harahuts Y, et al. New hybrid composites for photodynamic therapy: synthesis, characterization and biological study. Appl Nanosci 2019; 9: 881–8.
14. Kutsevol N, Kuziv Y, Bezugla T, et al. Application of new multicomponent nanosystems for overcoming doxorubicin resistance in breast cancer therapy. Appl Nanosci 2021; 1–11.

Адреса для листування:
Чепурна О.М.
03022 Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: ok.chepurna@gmail.com

Одержано: 29.09.2021