ВПЛИВ ІНСУЛІНУ НА ПРОЛІФЕРАТИВНУ АКТИВНІСТЬ КЛІТИН РАКУ МОЛОЧНОЇ ТА ПЕРЕДМІХУРОВОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ РІЗНОГО СТУПЕНЯ ЗЛОЯКІСНОСТІ IN VITRO

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-3-2021-g.9559

Відомо, що інсулін є головним анаболічним гормоном, який сприяє проліферації пухлинних клітин. До мітогенних відносять довгострокові ефекти гормону, які реалізуються на генетичному рівні за рахунок індукції експресії ряду специфічних генів, стимуляції синтезу ДНК і білків, що призводять до посилення клітинного росту [1]. Окрім того, інсулін здатний посилювати дію деяких факторів росту. Мітогенна дія інсуліну реалізується через складний ланцюг сигнальних подій: активацію протеїнкінази, залежної від циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ), фосфорилювання і активування фактора транскрипції в ядрі, індукцію експресії цАМФ-залежних генів, що в підсумку призводить до стимуляції клітинної проліферації [2].

Проліферативна активність злоякісно трансформованих клітин — одна з ключових характеристик біологічних властивостей пухлин, що зумовлює активний пошук маркерів, які можуть бути використані для об’єктивізації проліферативного потенціалу клітин. Для цих цілей в онкології широко застосовуються моноклональні антитіла (МкАт) Ki-67 і MIB-1, які виявляють різні епітопи одного антигену — Ki-67. Ki-67 широко використовується як маркер проліферації клітин і його експресію визначають у злоякісно трансформованих клітинах майже всіх локалізацій та при деяких гематологічних злоякісних новоутвореннях [3, 4]. Оскільки Ki-67 експресований в клітинах на всіх стадіях клітинного циклу, окрім G₀ та ранньої G₁, позитивна реакція на цей антиген, як правило, корелює з агресивністю пухлин. Ki-67 розглядається як потенційний прогностичний маркер для пухлин молочної залози [5], раку передміхурової залози [6], нирки [7], сечового міхура [8], легені [9], а також для астроцитом [10], лімфом з клітин мантійної зони [11], та багатьох інших злоякісних новоутворень. Ядерний антиген проліферуючих клітин ІРО-38 експресується в клітинах, що перебувають на тих же стадіях клітинного циклу, що і Кі-67 та, крім того, в ранній G₁-фазі клітинного циклу [12]. Наразі доведено значимість цього маркера не тільки для оцінки відсотка проліферуючих клітин, але і його прогностичну цінність при злоякісних лімфопроліферативних захворюваннях, злоякісних пухлинах молочної залози та раку шлунка [13–15].

Дослідження щодо залучення інсуліну до регуляції проліферативної активності пухлинних клітин були розпочаті у 70-х роках минулого століття на модельних системах in vivo. Ці дослідження показали, що фізіологічні концентрації інсуліну стимулюють проліферацію клітин раку молочної залози (РМЗ), а його депривація призводить до її інгібування [16]. У більш пізніх дослідженнях було доведено, що клітини лінії MCF-7 за умов дефіциту інсуліну не індукують ріст пухлини in vivo [17]. Сучасний стан проблеми щодо вирішення участі інсуліну в регуляції проліферативного потенціалу зло­якісних клітин включає обов’язкове розуміння їх біологічних характеристик. Тому метою роботи було з’ясування впливу інсуліну на проліферативну активність клітин ліній РМЗ та раку передміхурової залози (РПЗ) людини різного ступеня зло­якісності в експериментальній системі in vitro.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідженнях використані клітини ліній РПЗ — LNCap, Du-145, PC-3 — та РМЗ людини (РМЗ) — T47D, MDA-MB-231, які внесені у реєстр Міжнародного банку клітинних ліній АТСС (American Type Culture Collection). Також об’єктами дослідження були клітини нових ліній РМЗ людини — ВСС/Р і BC/ML, отримані і охарактеризовані в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького Національної академії наук (НАН) України, а згодом паспортизовані та депоновані в банку клітинних ліній з тканин людини та тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Загальна характеристика зазначених клітинних ліній представлена в табл. 1. Усі клітинні лінії культивували у середовищі ІMDM (BioWest, France) з 20% ембріональної сироватки телят (FВS) (BioWest, France) та 100 мкг/мл суміші антибіотиків (пеніцилін/стрептоміцин) (BioWest, France) за 37 °С в атмосфері 5% СО₂.

Для з’ясування можливого впливу інсуліну на експресію ядерного антигена проліферуючих клітин ІРО-38 клітини ліній РПЗ та РМЗ, за винятком ВСС/Р і BC/ML, інкубували з інсуліном (Lilly, France) у концентрації 0,02 та 2,0 мкг/мл. Для клітин ВСС/Р і BC/ML використовували наступні концентрації інсуліну — 0,02, 0,5 та 5,0 мкг/мл. Попередньо клітини в концентрації 0,4•10⁶/лунку висаджували у лунки 6-лункового планшета в 5 мл поживного середовища, після 24 год культивування середовище заміщували на 5 мл ІMDM з 1% FВS та 100 мкг/мл суміші антибіотиків (пеніцилін/стрептоміцин), до якого додавали необхідну кількість інсуліну. Після 72 год культивування проводили цитофлуориметричне дослідження експресії ІРО-38.

Для визначення експресії ІРО-38, а також ядерного антигену проліферуючих клітин Кі-67 клітини попередньо фіксували 2% розчином параформальдегіду з наступною пермеабілізацією клітин 0,2% Tween-20%. Експресію ІРО-38 визначали з використанням первинних мишачих МкАт анти-ІРО-38 (Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України) та F(ab)2-фрагментів імуноглобулінів кози проти імуноглобулінів миші, мічених FITC (DAKOCytomation, USA). Експресію Кі-67 — за допомогою первинних МкАт кроля анти-Кі-67 (клон SP-6, BioSystem, Spain) та імуноглобулінів віслюка, мічених Alexa Fluor 488, проти імуноглобулінів кроля (TermoFisher, USA).

Рівень експресії та кількість клітин, що експресують IPO-38 та Кі-67, визначали на проточному цито­флуориметрі Beckman Coulter DxFLEX з наступною обробкою результатів за допомогою програми CytExpert for DxFLEX. Рівні експресії IPO-38 та Кі-67 оцінювали за показником індексу GeoMFI — співвідношення середньої геометричної інтенсивності флуоресценції клітин (GeoMean), що взаємодіяли з антитілами до антигену із GeoMean флуоресценції клітин ізотипового контролю. Достовірність відмінностей оцінювали на підставі критерію Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Враховуючи, що експресія ІРО-38, на відміну від Кі-67, виявляється в клітинах, що знаходяться в ранній G₁-фазі клітинного циклу, ми вважали за необхідне порівняти показники експресії цих маркерів в клітинах ліній РМЗ та РПЗ з урахуванням ступеня злоякісності досліджуваних клітин, який було визначено в попередніх дослідженнях [18–20].

Аналіз показників експресії ІРО-38 в клітинах ліній РМЗ показав, що як рівень експресії, так і кількість ІРО-38⁺-клітин були достовірно вищими у клітинах базального молекулярного підтипу — ВСС/Р, BC/ML та MDA-MB-231 порівняно з таким у клітинах люмінального А підтипу — T49D (р <0,05) (табл. 2). Щодо Кі-67, то, подібно ІРО-38, така закономірність також відслідковувалася, тобто у клітинах низького ступеня злоякісності рівень експресії та кількість Кі-67⁺-клітин були достовірно меншими, ніж у клітинах високого ступеня злоякісності (р <0,05).

Серед досліджуваних клітин РПЗ найвищі показники експресії як ІРО-38, так і Кі-67 виявлено у клітинах Du-145. Найменший проліферативний потенціал за показниками ІРО-38 і Кі-67 виявлено у клітинах РС-3. Загалом, як у клітинах ліній РМЗ, так і РПЗ кількість ІРО-38⁺-клітин та рівень експресії ІРО-38 були вищими за показники Кі-67. Слід зазначити, що у клітинах BCC/P, BC/ML та Du-145 досліджувані показники експресії ІРО-38 вдвічі перевищували такі Кі-67, тоді як у інших клітинних лініях різниця була не на стільки вираженою (табл. 2). Таким чином, дослідження експресії ІРО-38 дозволяє більш об’єктивно визначити пул проліферуючих клітин і тому наші дослідження щодо впливу інсуліну на проліферативну активність клітин надалі були зосереджені на оцінці показників ІРО-38.

Згідно з отриманими результатами, клітини ліній РПЗ відрізнялися за характером проліферативної відповіді як на фізіологічну концентрацію інсуліну (0,02 мкг/мл), так і концентрацію, яка відповідає стану гіперінсулінемії (2,0 мкг/мл). Найбільш чутливими до модуляції проліферативної активності інсуліном виявилися клітини лінії LNCap низького ступеня злоякісності. Уже за концентрації інсуліну 0,02 мкг/мл рівень експресії ІРО-38 зростав у 2,6 разу (р<0,05) у порівнянні з контролем. Зауважимо, що це значення експресії ІРО-38 є вищим, ніж відповідне за умов гіперінсулінемії (4,9 та 4,6 відповідно) (рис. 1).

У клітинах РПЗ лінії РС-3 високого ступеня злоякісності нам вдалося відстежити подібну тенденцію в зміні показників проліферативної активності, як і у клітинах LNCap, проте після культивування з інсуліном у концентрації 0,02 мкг/мл рівень експресії ІРО-38 в клітинах РС-3 зростав лише на 46%, відносно контролю, що у 5,7 разів менше за відповідний показник клітин LNCap (див. рис. 1). Високі концентрації інсуліну достовірно не впливали на зміну показника проліферативної активності клітин РС-3 порівняно з таким за фізіологічної концентрації інсуліну, проте прослідковувалася тенденція до зниження рівня експресії ІРО-38 (р >0,05).

Культивування клітин лінії Du-145 високого ступеня злоякісності з інсуліном у концентрації 0,02 мкг/мл не змінювало їх проліферативної активності. Лише за умов гіперінсулінемії рівень експресії ІРО-38 зростав на 12% у порівнянні з контролем.

У серії відповідних експериментів з клітинами ліній РМЗ вдалося встановити ряд закономірностей. За умов культивування клітинних ліній із фізіо­логічною концентрацією інсуліну рівень експресії ІРО-38 достовірно зростав лише в клітинах люмінального підтипу T49D (із 1,7 до 2,6), тоді як клітини базального підтипу достовірно не змінювали свій проліферативний потенціал (рис. 2, 3). У разі культивування клітин РМЗ за наявності інсуліну в концентраціях, які перевищують нормальні фізіологічні — 2,0 та 5,0 мкг/мл, виявлено тенденцію до зростання рівня експресії ІРО-38 у клітинах РМЗ найбільш високого ступеня злоякісності – ВСС/Р, BC/ML та MDA-MB-231 у порівнянні з контролем. Лише у клітинах люмінального підтипу T49D експресія ІРО-38 зменшувалася і становила 1,4 порівняно з 1,7 у контрольних клітинах.

Отже, за умови фізіологічного вмісту інсуліну в поживному середовищі достовірно зростає проліферативна активність клітин ліній РМЗ та РПЗ низького ступеня злоякісності, тоді як у клітинах високого ступеня злоякісності достовірних змін у проліферативному потенціалі клітин не виявлено. Проте при культивуванні клітин ліній РМЗ та РПЗ із інсуліном у концентраціях, які зумовлюють гіперінсулінемію, рівень експресії ІРО-38 статистично достовірно зростає у клітинах ліній і низького, і високого ступеня злоякісності РПЗ та має тенденцію до зростання у клітинах ліній РМЗ базального молекулярного підтипу, тоді як у клітинах люмінального А молекулярного підтипу відмічено зниження проліферативного потенціалу.

Таким чином, в експериментальних дослідженнях in vitro показано, що інсулін-опосередковані відмінності у проліферативній активності клітин ліній РПЗ та РМЗ різного ступеня злоякісності є дозозалежними. Отримані дані підтверджують, що баланс інсуліну є вкрай важливим для попередження розвитку і прогресії захворювання.

ВИСНОВКИ

1. У клітинах ліній РМЗ (T47D, MDA-MB-231, ВСС/Р та BC/ML) та РПЗ (LNCap, Du-145, PC-3) рівень експресії ІРО-38 вищий, ніж рівень експресії Кі-67, що може бути пояснено експресією ІРО-38 впродовж усіх стадій клітинного циклу, окрім G0, а також ранній G1-фазі клітинного циклу.

2. Встановлено відмінності у проліферативній активності клітин ліній РПЗ in vitro, опосередкованій інсуліном, за показником експресії ядерного антигену проліферуючих клітин ІРО-38. Найбільш чутливими до модуляції проліферативної активності під впливом фізіологічної концентрації інсуліну (0,02 мкг/мл) виявилися чутливі до дії андрогенів клітини лінії LNCap, у яких рівень експресії ІРО-38 зростав у 2,6 раза (р <0,05). У клітинах високого ступеня злоякісності лінії Du-145 не виявлено змін у експресії ІРО-38, а у клітинах РС-3 — підвищення даного показника лише на 46%. Висока концентрація інсуліну (2,0 мкг/мл) опосередковувала достовірне зростання показника проліферуючих клітин ІРО-38 лише у клітинах LNCap.

3. Виявлено статистично достовірне підвищення рівня експресії ІРО-38 за умови фізіологічної концентрації інсуліну в клітинах РМЗ люмінального А молекулярного підтипу лінії T47D у 1,5 раза та відсутність достовірних змін у показниках експресії даного маркера у клітинах базального молекулярного підтипу — MDA-MB-231, BC/ML, BCC/P. Інсулін у концентраціях, які перевищують фізіологічні, достовірно не впливає на зміни рівня експресії ІРО-38 у клітинах найбільш злоякісних із досліджуваних ліній ВСС/Р, BC/ML та MDA-MB-231, тоді як у клітинах T47D відмічено тенденцію до зниження рівня експресії ІРО-38 по відношенню до даного показника у контрольних клітинах.

Робота виконувалася в рамках НДР «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» (0117U002034) за фінансової підтримки Цільової програми наукових досліджень Відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології НАН України «Молекулярно-генетичні і біо­хімічні механізми регуляції клітинних та системних взаємодій за фізіологічних та патологічних станів» (2017–2021).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Gupta ВВ. Mechanism of insulin action. Curr Science 1997; 73: 993–1003.
2. Wilcox G. Insulin and Insulin Resistance. Clin Biochem Rev 2005; 26 (2): 19–39.
3. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983; 31(1): 13–20.
4. Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol 2000; 182 (3): 311–22.
5. Menon SS, Guruvayoorappan C, Sakthivel KM, et al. Ki-67 protein as a tumour proliferation marker. Clin Chim Acta 2019; 491: 39–45.
6. Van der Kwast TH. Prognostic prostate tissue biomarkers of potential clinical use. Virchows Arch 2014; 464(3): 293–300.
7. Xie Y, Chen L, Ma X, et al. Prognostic and clinicopathological role of high Ki-67 expression in patients with renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep 2017; 7: 44281.
8. Tian Y, Ma Z, Chen Z, et al. Clinicopathological and prognostic value of Ki-67 Expression in bladder cancer: a systematic review and meta-analysis. PLoS One 2016; 11 (7): e0158891.
9. Yi ES, Lee GK. Updates on selected topics in lung cancers: air space invasion in adenocarcinoma and Ki-67 staining in carcinoid tumors. Arch Pathol Lab Med 2018; 142 (8): 947–951.
10. Chen YT, Tsai HP, Wu CC, et al. Нigh-level sp1 is associated with proliferation, invasion, and poor prognosis in astrocytoma. Pathol Oncol Res 2019; 25 (3): 1003–13.
11. Hartmann E, Ott G, Rosenwald A. Molecular outcome prediction in mantle cell lymphoma. Future Oncol 2009; 5 (1): 63–73.
12. Mikhalap SV, Lopes F, Shlapatskaya LN et al. Monoclonal antibody IPO-38 recognizes a novel nuclear antigen of proliferating cells. In: Leucocyte Typing VI. New York: Garland Publishing Inc. 1997: 609–610.
13. Mikhalap SV, Shlapatskaya LN, Berdova AG, et al. Monoclonal antibody IPO-38 in evaluation of proliferative activity of tumor cells. Exp Oncol 2000; 22 (2): 36–38.
14. Shlapatska LM, Zakharova IA, Mikhalap SV, et al. Expression of protein kinases D1 and D 2 in tumor cells of breast cancer. Oncology 2008; 10 (3): 316–21 (in Ukrainian).
15. Hao Y, Yu Y, Wang L, et al. IPO-38 is identified as a novel serum biomarker of gastric cancer based on clinical proteomics technology. J Proteome Res 2008; 7 (9): 3668–77.
16. Heuson JC, Legros N. Influence of insulin deprivation on growth of the 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinoma in rats subjected to alloxan diabetes and food restriction. Cancer Res 1972; 32 (2): 226–32.
17. Nandi S, Guzman RC, Yang J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. PNAS 1995; 92 (9): 3650
18. Zadvornyi TV, Lukianova NY, Borikun TV, et al. Effects of exogenous lactoferrin on phenotypic profile and invasiveness of human prostate cancer cells (DU-145 and LNCAP) in vitro. Exp Oncol 2018; 40 (3): 184–6.
19. Lukianova NY, Andriiv AV, Chekhun VF. Correlation of iodine symporter expression in highly and low malignant cell lines of human breast cancer differed in their sensitivity to doxorubicin. Exp Oncol 2016; 38 (3): 169–71.
20. Bezdieniezhnykh N, Lykhova A, Semesiuk N, et al. Establishment and characterization of new breast and ovarian cancer cell lines as a model for studying cellular plasticity in vitro. Exp Oncol 2016; 38 (2): 94–100.

Адреса для листування:
Шлапацька Л.М.
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
iм. Р.Є. Кавецького НАН України
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
E-mail: larisash70@ukr.net

Одержано: 27.09.2021