РІВЕНЬ ЛАКТАТУ ТА 1Н ЯМР МЕТАБОЛІЧНЕ СПІВВІДНОШЕННЯ ЛАКТАТ/КРЕАТИН У ТКАНИНІ РАКУ ШЛУНКА ЛЮДИНИ І ПРОГНОЗ ПЕРЕБІГУ ЗАХВОРЮВАННЯ

Посилений аеробний гліколіз у пухлинній тка­ нині являє собою унікальне явище, відоме ще з ран­ ніх робіт O. Warburg [1]. При високому рівні гліколі­ зу природно очікувати утворення у пухлині великої кількості лактату, який буде затримуватись у її тка­ нині або виходити у кровоносне русло. Підвищення рівня лактатемії у онкологічних хворих та експери­ ментальних тварин з різними пухлинами вказує на вихід лактату з пухлини у кров [2, 3]. Водночас відо­ мо, що судинний простір пухлини у 3 рази менший, ніж, наприклад, печінки, і в різних пухлинах швид­ кість кровообігу знижена у багато разів порівняно з нормальними тканинами [4]. Завдяки цьому вміст лактату у пухлині буде істотно зростати, що вперше було описано в експериментах С. Cori і G. Cori [5] та M. Reiss і A. Hochwald [6].

У роботах останніх років було показано, що в первинних пухлинах шийки матки [7], голови та шиї [8], колоректальних карциномах [9] різко зрос­ тає вміст лактату. Було встановлено, що у високо­ агресивних пухлинах лактат накопичується швидше порівняно з менш злоякісними пухлинами, причо­ му вже на ранніх стадіях розвитку процесу. Збіль­ шене накопичення лактату, що зумовлює позаклі­ тинне зниження рН, може зменшувати адгезивні властивості пухлинних клітин у межах злоякісної тканини і таким чином посилювати їх розповсю­ дження у віддалені органи. Показано, що високий вміст лактату корелює з вищою частотою утворен­ ня як віддалених метастазів, так і невисокими по­ казниками виживаності хворих уже на ранніх ста­ діях розвитку пухлинного процесу [10]. Висловлено припущення, що вміст лактату у первинній пухлині може бути основою нової метаболічної класифіка­ ції пухлин, яка буде сприяти підвищенню ефектив­ ності лікування онкологічних хворих [11].

На шляху до реалізації цієї ідеї необхідним є роз­ ширення спектра пухлин людини, які були б дослі­ джені з позиції встановлення клінічного значення вмісту лактату у пухлині та його зв’язку з перебігом захворювання. Слід також зауважити, що визначен­ ня вмісту лактату у пухлині не тільки біохімічним методом, але і за допомогою ЯМР­спектроскопії, яка дозволяє визначати різні важливі для життєді­ яльності пухлинних клітин метаболіти, зокрема во­ деньвмісні, розширює можливості та підсилює клі­ нічну значущість такого дослідження.

У цій роботі була зроблена спроба здійснити по­ рівняльний аналіз методів визначення вмісту лак­ тату у пухлині біохімічним методом і за допомогою 1Н ЯМР­спектроскопії та оцінити його можливе ви­ користання у якості прогностичного маркеру.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Операційний матеріал (пухлинна тканина та ото­ чуюча її нормальна слизова оболонка шлунка) був отриманий від 104 хворих, які підлягали хірургічному втручанню, з діагнозом первинний рак шлунка (РШ). Передопераційної терапії хворі, операційний матеріал яких було використано для досліджень, не отримува­ ли. Матеріал був наданий Київською міською онко­ логічною лікарнею. Усі хворі були проінформовані про обстеження та надали згоду на використання хі­ рургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Kлінічні характеристики наведені у таблиці. Пухлинну та нор­ мальну (за межами обов’язкового оперативного вида­ лення) тканиниотримувалив процесіїхоперативного вилучення і миттєво занурювали в рідкий азот. Оцін­ ку вмісту лактату проводили за допомогою біохіміч­ ного методу та 1Н ЯМР­спектроскопії в перхлорних екстрактах (ПХЕ) тканин (тканина РШ, нормальна слизова оболонка шлунка).

Розподіл хворих на РШ

Таблиця

ного користування НАН України на базі Інституту металофізики НАН України.

Вміст лактату (µмоль/г) в тканині РШ та оточую­ чій пухлину «нормальній» слизовій оболонці визна­ чали ферментативним методом за H. Hohorst [12] з використанням лактатдегідрогенази.

Проводили відповідну статистичну обробку отриманих результатів: кореляційний аналіз про­ водили з використанням коефіцієнтів кореляції Pearson (r) та Spearman (rho). Прогностичне зна­ чення показників оцінювали за допомогою про­ порційної моделі Cox з використанням χ2 тесту та коефіцієнту ризику (hazard ratio). Виживаність хво­ рих визначали за методом Kaplan — Meier, розбіж­ ності між кривими виживаності аналізували за до­ помогою тесту log­rank. Статистична значимість прийнята при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При первинному діагнозі хворого на РШ ви­ значити рівень того чи іншого метаболіту в пухли­ ні, який може бути маркером перебігу захворюван­ ня, без отримання принаймні біопсійного матері­ алу неможливо. Новітні методи діагностики, такі як ЯМР­спектроскопія in vivo (NMR imaging — ЯМР­зображення), дозволяють це зробити. Для того, щоб пересвідчитися, чи може 1Н ЯМР­метаболічний показник відображати вміст лактату в пухлині і бути

Для отримання ПХЕ тканину розтирали в рід­ кому азоті до порошковидного стану, давали тро­ хи відтанути та інкубували на льоду при постійно­ му помішуванні. Подалі проводили екстракцію за допомогою охолодженого 1,2 н розчину HClO4. Хо­ лодну деіонізовану воду додавали в певному обся­ зі та центрифугували (9000 об./хв, 40 хв) для вида­

лення клітинного дебрісу. Потім рН ПХЕ доводили

до 7,6–8,0 за допомогою 5 н розчину КОН, центри­ фугували (9000 об./хв, 20 хв) для видалення преци­ пітату КСІО4. Дівалентні іони видаляли за допомо­ гою Chelex (10 мг/5 мл надосадової рідини) (Sigma, США). Зразки фільтрували, ліофілізували та збері­ гали при –20 °С. Перед реєстрацією ЯМР­спектрів ліофілізовані зразки розчиняли в 1,0 мл D2O, цент­ рифугували і переносили в ЯМР­пробірки для по­ дальшого ЯМР­аналізу.

1Н ЯМР­спектри реєстрували на спектромет­

рі Bruker 400 MHz (Widebore Ultrashield, AV­400 electronics, Німеччина), використовуючи 5 мм кю­ вети. 1Н ЯМР­спектри ПХЕ тканин вимірювали при 400,13 MHz зі спектральною шириною в 8250 Hz та 90° шириною імпульсу, затримкою в 20 с. Натрієва сіль 3­(триметилсіліл)пропіонової кислоти (0,75%

розчин у D2О) слугувала за внутрішній стандарт (0,0 ppm). За таких умов резонансні сигнали лакта­ ту (Lac) та креатину (Cr) на 1Н ЯМР­спектрах реє­ струються на 1,3 ррm та 3,06 ppm відповідно. Облас­ ті спектральних сигналів на спектрах вимірювали­ ся інтегральним способом, які обчислював прилад. 1Н ЯМР­спектри були отримані в Центрі колектив­

надійним в оцінці того, які пухлини слід розглядати як пухлини з високим рівнем лактату, а які ні, була

проведена 1Н ЯМР­спектроскопія ПХЕ тканин РШ і слизової оболонки шлунка. Метод є дуже чутли­ вим і надає повний хімічний склад речовин на мо­ мент фіксації тканини. На рис. 1 представлені ти­ пові 1Н ЯМР­спектри тканин РШ і оточуючої сли­ зової оболонки.

Рис. 1. Типовий 1Н ЯМР­спектр тканини РШ (а) та оточуючої її слизової оболонки (б). На рисун­ ку представлені копії спектрів з оригінального запису спектрів хворого З.А.А.

Щоб мати можливість проаналізувати рівні пев­ них речовин в однотипових зразках на усіх спектрах та співставити поміж собою, в ЯМР­спектроскопії біологічних об’єктів користуються так званими ме­ таболічними співвідношеннями, а саме співвідно­ шеннями інтегралів резонансних сигналів речовин, що відображають взаємозв’язок цих речовин у зразку

тканини. Оскільки нас цікавив рівень лактату в тка­ нині, було використано 1Н ЯМР­співвідношення Lac/Cr. Креатин, як відомо, належить до енерге­ тичної складової метаболізму клітини, яка в будь­ яких умовах намагається підтримувати пул креати­ ну на відносно постійному рівні. Тому метаболічне співвідношення Lac/Cr є більш стабільним показ­ ником, який співвідноситься із загальним метабо­ лічним станом клітини. Нами було проведено спів­ ставлення 1Н ЯМР­спектрів метаболічних співвід­ ношень Lac/Cr для тканини РШ і слизової оболонки з вмістом лактату в тих самих тканинних зразках, що визначався ферментативним методом.

Так як у клінічних дослідженнях користуються медіаною як відправною точкою для розподілу хво­ рих за групами, була знайдена медіана рівня лакта­ ту, визначеного кожним окремим методом. Медіана метаболічного співвідношення Lac/Cr для тканини РШ дорівнювала 4,6 (1,4–32,5), тоді як для слизової оболонки, розміщеної на певній відстані від пухли­ ни, — 1,5 (0,6–4,4) (рис. 2а). Медіана вмісту лактату, визначеного ферментативним методом, для тканин РШ дорівнювала 18,7 µмоль/г (8,3–49,9), для слизо­ вої оболонки — 9,5 µмоль/г (3,3–22,1) (рис. 2б).

но медіани усі пухлини умовно поділяються на такі, що мають низький рівень лактату (< 4,6 для співвід­ ношення Lac/Cr або < 18,7 µмоль/г при визначенні ферментативним методом) або високий, — більше значення медіани. Як видно з розкиду, рівень лак­ тату в тканині РШ дуже варіює: вміст лактату в пух­ лині може бути як відносно низьким, так і виключ­ но високим. У середньому рівень лактату в пухлин­ ній тканині згідно зі значеннями метаболічного співвідношення Lac/Cr приблизно в 3 рази вищий (р = 0,039), а згідно з визначеним ферментативним методом у 2 рази вищий (р = 0,027) порівняно з та­ ким у нормальній слизовій оболонці шлунка.

Проведений порівняльний аналіз як значень ме­ таболічного показника Lac/Cr, так і вмісту лакта­ ту, визначеного ферментативним методом, з основ­ ними клініко­патологічними характеристиками РШ. Не було виявлено кореляції ні співвідношен­ ня Lac/Cr, ні вмісту лактату з гістологічним ти­ пом чи ступенем диференціювання пухлини, але спостерігалася статистично достовірна кореля­ ція співвідношення Lac/Cr (р = 0,0413) зі стадією розвитку процесу (рис. 3а). Аналогічна кореляція (р = 0,029) була встановлена і для вмісту лактату у тканині РШ, визначеного ферментативним ме­ тодом (рис. 3б).

Рис. 2. Розподіл індивідуальних значень та величин медіани: а — 1Н ЯМР­співвідношень Lac/Cr в тканині РШ та оточуючій її слизовій оболонці; б — вмісту лакта­ ту, визначеного ферментативним методом, у тканині РШ та оточуючій її слизовій оболонці

За обох методів визначення спостерігали досто­ вірну різницю між значеннями медіан для пухли­ ни і слизової оболонки шлунка (р < 0,001). Віднос­

Рис. 3. Рівень лактату в тканині РШ відповідно до стадій процесу за TNM: а — згідно з 1Н ЯМР метаболічним по­ казником Lac/Cr; б — при визначенні ферментативним методом

Слід також відзначити, що співвідношення Lac/Cr у пухлинах хворих з категорією рТ3 + рТ4 було дещо більшим (в 1,4 раза, р = 0,785) порівняно

з таким у хворих з категорією рТ1 + рТ2. (рис. 4а). Така ж тенденція була виявлена і при аналізі даних вмісту лактату, визначеного ферментативним мето­ дом (в 1,5 раза, р = 0,0652) (рис. 4б).

Рис. 4. Рівень лактату в тканині РШ відповідно до стадій процесу за TNM: а — згідно з 1Н ЯМР метаболічним по­ казником Lac/Cr; б — при визначенні ферментативним методом

Слід при цьому зазначити, що у хворих на РШ з категорію рТ4 не спостерігали суттєвого збільшен­ ня вмісту лактату у пухлині порівняно з такими при рТ3: 20,3 ± 1,0 µмоль/г при рТ3 і 22,9 ± 1,5 µмоль/г при рТ4. Пояснити це спостереження, яке співпа­ дає з літературними даними, може та обставина, що у великих пухлинах зони некрозу значно біль­ ші; лактат же, як відомо, продукується життєздат­ ними клітинами, які знаходяться у добре перфузо­ ваних ділянках пухлини [13]. Виходячи з цього, стає зрозумілим, чому вміст лактату в первинній пухли­ ні корелює зі злоякісною прогресією тільки на ран­ ніх стадіях процесу [10, 11].

При аналізі зв’язку вмісту лактату в тканині РШ з виживаністю хворих, яким було запроваджено тіль­ ки хірургічне втручання, виявилося, що при низь­ кому рівні лактату в пухлині (менше медіани), спо­ стерігається достовірно довша тривалість життя, ніж за умов, коли рівень лактату в пухлині був високим (вище медіани). Це положення дійсне у випадках, коли рівень лактату оцінювали як метаболічним співвідношенням Lac/Cr (χ2 = 3,876, р = 0,049), так і ферментативним методом (χ2 = 9,086, р = 0,026) (рис. 5а, б).

Рис. 5. Криві виживаності хворих на РШ за Капланом — Майєром (розподіл хворих: а — відповідно до медіани 1Н ЯМР метаболічного показника Lac/Cr у пухлині; б — відповідно до медіани вмісту лактату в пухлині, визначе­ ного ферментативним методом)

Несприятливий перебіг захворювання пацієнтів з пухлинами з високим вмістом лактату може бути пов’язаний з високим рівнем внутрішньопухлинної гіпоксії, яка, як відомо, є однією з основних харак­ терних особливостей злоякісної пухлини [14]. Аналіз отриманих даних показав, що спостерігається статис­ тично достовірний зворотний кореляційний зв’язок (р = 0,0487) між рівнями гіпоксії і лактату у ткани­ ні РШ за умов, коли пухлинна тканина є умовно гі­ поксичною. Водночас рівень лактату у пухлині може надати ще й додаткову інформацію щодо перебі­ гу захворювання. Зважаючи на той факт, що ткани­ на РШ відносно добре оксигенована (за оцінкою 31Р ЯМР­спектроскопії [15]), коли за таких умов, тобто за сприятливих для перебігу захворювання, спосте­ рігається високий вміст лактату (вище медіани), ри­ зик несприятливого перебігу захворювання зростає майже вдвічі (коефіцієнт ризику (hazard ratio) для співвідношення Lac/Cr і для вмісту лактату, визна­ ченого ферментативним методом, дорівнював 1,76; р = 0,0446 і 2,0; р = 0,0398, відповідно).

Таким чином, отримані дані вказують на те, що співвідношення Lac/Cr є достовірним показни­ ком рівня лактату в тканині РШ, який може слугу­ вати фактором прогнозу перебігу захворювання та виживаності хворих. Слід зазначити, що це може бути особливо важливим при первинному діагно­ зі РШ за допомогою 1Н ЯМР­спектроскопії in vivo (ЯМР­зображення).

ВИСНОВКИ

1. Метаболічне співвідношення Lac/Cr є досто­ вірним показником рівня лактату в тканині РШ, що підтверджено даними, отриманими при визначенні вмісту лактату ферментативним методом.

2. Метаболічне співвідношення Lac/Cr може слу­ гувати маркером прогнозу несприятливого перебі­ гу захворювання.

3. 1Н ЯМР­спектроскопія перхлорних екстрак­ тів пухлинної тканини, отриманої під час оператив­ ного втручання, та 1Н ЯМР­спектроскопія in vivo (ЯМР­зображення) хворих на РШ може бути запро­ ваджена при первинній діагностиці та з метою про­ гнозування перебігу захворювання та індивідуаліза­ ції протипухлинної терапії.

ЛІТЕРАТУРА

1. Warburg O. The metabolism of tumors. London: Constable, 1930.

2. Jurga L, Klvana M, Matula P, et al. Importance of determinations of serum hexokinase, aldolase and lactate dehydrogenase activities and of the lactate/pyruvate quotient in the diagnosis of malignant tumors. Neoplasma 1978; 25: 95–106.

3. Осинский СП, Повжиткова МС. Новые данные о селек­ тивности закисления опухолевой ткани. Онкология вып 9. Киев: Наук думка, 1977: 38–40.

4. Gullino PM, Grantham FH. The vascular space of growing tumors. Cancer Res 1964; 24: 1727–32.

5. Cori CF, Cori GF. The carbohydrate metabolism of tumors. J Biol Chem 1925; 64: 11–22.

6. Reiss M, Hochwald A. Experimentelle Beeinflussung des Tumorstoffwechsels am lebenden Tier. Med Klin 1932; 28: 1391–5.

7. Walenta S, Wetterling M, Lehrke M, et al. High lactate levels predict likelihood of metastases, tumor recurrence, and

1. Hohorst Н. L­(+) lactate determination with lactic dehydrogenase and DPN. In: Methods of Enzymatic Analysis / Ed. H Bergmeyer / Acad Press, 1965: 266–70.

2. Carcia-Martin M-L, Herigault G, Remy C, et al. Mapping extracellular pH in rat brain gliomas in vivo by 1H Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging: comparison with maps of metabolites. Cancer Res 2001; 61: 6524–31.

3. Осинский СП, Глузман ДФ, Клифф Й и др. Молекуляр­ ная диагностика опухолей. Киев, 2007. 246 с.

4. Осинський СП, Бубновська ЛМ, Ковельська АВ та ін. Рівень гіпоксії у тканині раку шлунка та перебіг захворюван­ ня. Онкология 2009; 11 (1 (39)): 39–44.

restricted patient survival in human cervical cancers. Cancer Res

2000; 60: 916–21.

1. Brizel DM, Schroeder T, Scher RL, et al. Elevatedtumorlactate concentrations predict for an increased risk of metastases in head­and­ neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001; 51: 349–53.

2. Walenta S, Chau TV, Schroeder T, et al. Metabolic classification of human rectal adenocarcinomas: A novel guideline for clinical oncologists? J Cancer Res Clin Oncol 2003; 129: 321–6.

3. Walenta S, Mueller-Klieser WF. Lactate: mirror and motor of tumor malignancy. Semin Rad Oncol 2004; 14: 267–74.

4. Walenta S, Schroeder T, Mueller-Klieser WF. Lactate in solid malignant tumors: potential of metabolic classifition in clinical oncology. Curr Med Chem 2004; 11: 2195–204.