ЕКСПРЕСІЯ ХЕМОКІНОВОГО РЕЦЕПТОРА CXCR4І ЩІЛЬНІСТЬ МІКРОСУДИН У ЗЛОЯКІСНИХ НОВОУТВОРЕННЯХ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ХВОРИХ З ОЗНАКАМИ МЕТАБОЛІЧНОГО СИНДРОМУ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-22-1-2020-g.8612

На сьогодні існують переконливі епідеміологічні дані щодо зв’язку метаболічного синдрому (МС), зокрема такої його складової, як ожиріння, з виникненням і прогресією багатьох пухлин, у тому числі і раку молочної залози (РМЗ) [1–3].

Відомо, що жирова тканина є джерелом естрогенів, які відіграють значну роль у контролі проліферації та диференціювання нормальних і злоякісно трансформованих епітеліальних клітин. Водночас показано існування позитивного зв’язку між високою експресією естрогенових рецепторів (ER) у пухлинах і концентрацією у сироватці периферичної крові (СПК) хворих на РМЗ гормону жирової тканини лептину, що зумовлено здатністю останнього транскрипційно активувати ER через MAPК-шлях, навіть за відсутності його природного ліганду — 17-β-естрадіолу. Автори вказують на можливість коекспресії ER і лептинового рецептора у пухлинних клітинах молочної залози (МЗ) хворих з ожирінням [4].

У проведених нами попередніх дослідженнях визначено, що у хворих на РМЗ такі ознаки агресивності пухлинного процесу, як базальний молекулярний підтип, низький ступінь диференціювання і високий проліферативний потенціал новоутворення асоціюються зі зниженням співвідношення адипонектину до лептину в СПК та ожирінням [5].

Слід зазначити, що ендокринно-метаболічні порушення в організмі хворих позначаються на біологічних особливостях гормонозалежних пухлин, причому одним із факторів, що забезпечує цей вплив, є пухлинне мікрооточення [6, 7]. Зокрема відомо, що пухлиноасоційовані фібробласти і міофібробласти секретують різноманітні цитокіни та фактори росту, формуючи специфічне мікросередовище, яке стимулює ріст, рухливість і метастазування пухлинних клітин. Показано, що хемокін CXCL12, який є одним із медіаторів ефекту естрогенів, зв’язуючись зі своїми рецепторами CXCR4 та CXCR7 на пухлинних клітинах, може впливати на ряд сигнальних каскадів (зокрема MAPK, PI3K/AKT/mTOR і Jak/STAT3) і таким чином модулювати біологію гормонозалежних пухлин [7]. Зокрема, активований у результаті цього впливу білок АКТ підвищує транскрипційну активність маркера проліферації пухлинних клітин Сyclin D1 і ангіо­генного фактора росту ендотелію судин (VEGF), який бере участь у підтримці судинної мережі, протистоїть апоптозу незрілих ендотеліоцитів, що у кінцевому результаті стимулює у пухлинах неоангіогенез і характеризується підвищенням щільності мікросудин (ЩМС) [8, 9]. Останнє свідчить про зв’язок CXCR4 з васкуляризацією новоутворення. Відомо, що активація експресії хемокінового рецептора CXCR4 може відбуватися не тільки шляхом CXCL12/CXCR4, а і в результаті впливу інших цитокінів, ростових і транс­крипційних факторів, у тому числі NFAT3, NRF-1, NF-kB, HiF-1ά тощо [10, 11]. На сьогодні показано, що підвищення експресії CXCR4 у пухлинних клітинах передміхурової залози асоціюється з гіперекспресією мітохондріального рибосомального білка S18-2 і зміною експресії маркерів епітеліально-мезенхімального переходу: активацією білка TWIST та інгібуванням експресії Е-кадгерину [12].

У проведених нами попередніх дослідженнях визначено, що кількість клітин з експресією S18-2 у високопроліферуючих пухлинах люмінального А і базального підтипів РМЗ була значно більшою, ніж у пухлинах із низьким проліферативним потенціалом. Тобто встановлено, що висока експресія білка S18-2 корелює з агресивними підтипами цієї форми раку [13].

Відомо, що CXCR4 напряму пов’язаний із такою ознакою МС, як ожиріння, і є єдиним хемокіновим рецептором, який контролює окисно-відновний баланс жирової тканини. Оскільки CXCR4, експресуючись на жирових клітинах, запобігає надмірному надходженню запальних лейкоцитів у жирову тканину і тим самим обмежує ожиріння [14]. Однак досі не відомо, чи асоціюються зміни експресії CXCR4 у пухлинних клітинах з наявністю у хворих МС, чи залежить експресія цього рецептора у клітинах пухлини МЗ від особливостей молекулярного фенотипу новоутворення і яким чином вона пов’язана з показниками прогресії РМЗ.

Враховуючи зазначене, мета роботи полягала у проведенні порівняльного дослідження експресії CXCR4, S18-2 і щільності мікросудин (ЩМС) у злоякісних новоутвореннях молочної залози різних молекулярних підтипів залежно від наявності у хворих таких ознак метаболічного синдрому (МС), як ожиріння і артеріальна гіпертензія (АГ).

ОБ’ЄКТ і МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктом дослідження були зразки операційного матеріалу та кров 65 хворих на РМЗ різних молекулярних підтипів (середній вік — 58,0 ± 1,9 року) І–ІІ стадії захворювання, які перебували на стаціо­нарному лікуванні у Київському міському клінічному онкологічному центрі. Усі дослідження проводили відповідно до міжнародних етичних засад. Верифікацію морфологічного діагнозу РМЗ виконували на препаратах, забарвлених гематоксиліном і еозином, згідно з рекомендаціями ВООЗ [15]. Індекс маси тіла (ІМТ) хворих (за даними про зріст і масу) визначали за формулою Кетле: ІМТ = маса тіла (кг)/зріст² (м²). Ознаками МС вважали наявність у хворої ожиріння ІІ–ІІІ ступеня (ІМТ ≥30,0 кг/м²) і АГ, яку встановлювали при артеріальному тиску >140/90 мм рт. ст.

Імуногістохімічне (ІГХ) виявлення білків здійснювали на депарафінованих зрізах пухлин молочної залози, з використанням полі- та моноклональних антитіл: до CXCR4, клон NP PA3-305 (Thermo Fisher Scientific, США); S18-2, клон NP 054756 та CD31, клон ЕР78 («Diagnostic BioSystems», Нідерланди). Для візуалізації зазначених білків використовували систему детекції PolyVue («DakoCytomation», Данія). Результати ІГХ реакції оцінювали напівкількісним методом, шляхом підрахунку кількості забарвлених клітин у пухлинній тканині — індекс мітки (ІМ, %).

Для визначення ЩМС у пухлинах МЗ підраховували кількість судин у 10 полях зору мікроскопа (окуляр х10, об’єктив х10), розмір одного поля зору обме­жувався вимірювальною квадратною сіткою з подальшим визначенням кількості судин на 1 мм² за формулою: ЩМС = n/1,56 мм², де (n) — кількість судин на 1 поле зору; 1,56 мм² — площа сітки.

Концентрацію лептину і адипонектину у СПК визначали за допомогою імуноферментного аналізу. Кров для дослідження отримували з ліктьової вени. Вміст гормонів жирової тканини встановлювали з використанням набору реактивів Leрtin ELISA Kit (DBC, Канада) та Adiponectin ELISA E09 (Mediagnost, Німеччина). Дані про концентрацію гормонів визначали на автоматичному аналізаторі GBG ChemWellR із програмним забезпеченням у нг/мл.

Статистичне оброблення даних проводили за допомогою пакета програм Statistica 8.0 (StatSoft, Inc.) з використанням непараметричних критеріїв Mann-Whitney U Test і кореляційного аналізу за Спірменом. Достовірними вважали відмінності при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На підґрунті аналізу клінічних характеристик хворих встановлено, що індивідуальні показники ІМТ у пацієнтів із РМЗ коливались у межах 17,9–45,0 та у середньому становили 28,4 ± 1,8 кг/м². За ІМТ [1] хворі розподілилися таким чином: нормальну масу тіла (ІМТ ≤ 24,9 кг/м²) виявлено у 19 (29,2%) хворих, ожиріння І ступеня (ІМТ 25,0–29,9 кг/м²) — у 22 (33,9%) і ожиріння ІІ–ІІІ ступеня (ІМТ ≥30,0 кг/м²) — у 24 (36,9%) хворих. АГ виявлено у 24 (36,9%) хворих.

Визначено, що досліджені пухлини МЗ були різних молекулярних підтипів: люмінальний А (41 пухлина), люмінальний В (14 пухлин) та базальний (10 пухлин). У 14 (21,5%) хворих виявлено метастази у регіонарних лімфатичних вузлах.

При ІГХ-дослідженні визначено, що експресія хемокінового рецептора CXCR4 спостерігалася в усіх пухлинах МЗ з індивідуальними коливаннями експресії цього показника у діапазоні 6,8–98,4%. Середня кількість клітин із позитивною експресією CXCR4 становила 49,3 ± 1,9%. Васкуляризація у вигляді дрібних капілярів і невеликих судин у проаналізованих пухлинах була варіабельною і коливалась від 0,3–20,8 судин/мм², що у середньому становило 6,5 ± 1,9 судин/мм². Позитивними за експресією білка S18-2 були 60,7% проаналізованих пухлин, кількість клітин, що експресують S18-2, коливалася від 2,4 до 33,7% (у середньому — 6,6 ± 0,9%) (рис. 1).

Найвищу експресію хемокінового рецептора CXCR4 і ЩМС спостерігали у пухлинах МЗ люмінального В молекулярного підтипу (51,6 ± 14,2% і 13,5 ± 2,3 судин/мм² відповідно). При люмінальному А та базальному підтипах експресія CXCR4 і ЩМС була нижча, ніж у люмінальному В підтипі, і становила відповідно 49,9 ± 2,8 та 41,4 ± 4,0% і 5,7 ± 1,3 та 8,0 ± 1,7 судин/мм² (табл. 1).

*р < 0,05 порівняно з показником РМЗ молекулярного підтипу люмінальний А.

Враховуючи, що серед досліджених пухлин МЗ група з молекулярним підтипом люмінальний А була найбільшою, порівняльне дослідження щодо наявності у хворих ознак МС було проведено у пухлинах хворих саме цієї групи.

У результаті проведеного дослідження встановлено, що у тканині РМЗ люмінального А підтипу хворих з ознаками МС (ожиріння ІІ–ІІІ ступеня та АГ) виявлено тенденцію до зростання експресії CXCR4 (55,8 ± 2,9%) та вірогідно вищу ЩМС (8,6 ± 1,9 судин/мм²) порівняно з такими показниками у пухлинах пацієнток без ознак МС (відповідно 48,7 ± 2,4%; та 5,4 ± 1,7 судин/мм²; р < 0,05). Аналогічно змінювалась експресія білка S18-2 у карциномах МЗ, яка у хворих з ожирінням ІІ–ІІІ ступеня та АГ достовірно збільшувалася (10,1 ± 1,1%) на відміну від експресії цього маркера у хворих без ознак МС (5,2 ± 0,9%; р < 0,05) (рис. 2).

Зазначимо, що хворі на РМЗ з пухлинами люмінального А підтипу і наявністю ознак МС характеризувалися ще деякими клінічними особливостями. Вони були значно старшого віку (середній вік — 65,7 ± 3,2 року), ніж пацієнтки з аналогічними пухлинами без ознак МС (у середньому 48,7 ± 2,0 року; р < 0,05). У СПК хворих з ознаками МС виявлено виражений дисбаланс гормонів жирової тканини, пов’язаний із підвищеним вмістом лептину і зниженим — адипонектину, що характеризувалося значним (у 20,8 раза) зниженням адипонектин/лептинового співвідношення (0,12) порівняно з цим показником у хворих без ознак МС (2,5).

Окрім цього, у 63,6% хворих на РМЗ із пухлинами молекулярного підтипу люмінальний А і ожирінням ІІ–ІІІ ступеня визначалися метастази. Серед хворих без ожиріння метастази виявлені лише у 21,4% пацієнток. При цьому пухлини хворих на РМЗ із метастазами характеризувалися підвищенням експресії хемокінового рецептора CXCR4 (51,6 ± 2,8%) та білка S18-2 (11,9 ± 1,2%) і зростанням ЩМС (7,4 ± 2,0 судин/мм²) порівняно зі значеннями цих показників у пухлинах хворих без метастазів: 43,4 ± 2,3%; 4,6 ± 0,8% (р<0,05) і 5,3 ± 1,8 судин/мм² відповідно (рис. 3).
аб

Отримані результати дозволили припустити наявність певних зв’язків між експресією хемокінового рецептора CXCR4 і мітохондріального рибосомного білка S18-2 у пухлині, а також такими патогенетичними факторами як вміст адипонектину та лептину у СПК хворих на РМЗ. Враховуючи це, нами оцінено кореляційні зв’язки між експресією досліджених біомолекулярних маркерів у пухлинах хворих з люмінальним А та базальним молекулярними підтипами і у хворих з люмінальним А підтипом залежно від наявності у них ознак МС (табл. 2).

Як видно з представлених даних, у пухлинах люмінального А і базального молекулярних підтипів хворих на РМЗ спостерігався високий кореляційний зв’язок між експресією CXCR4 та S18-2 (r = 0,73 і р = 0,60 відповідно). Крім цього, виявлено високий кореляційний зв’язок між експресією CXCR4 у пухлинних клітинах МЗ і концентрацією адипонектину і лептину у СПК (r = 0,89 і r = –0,91 відповідно) у хворих з люмінальним А підтипом без ознак МС. Водночас у хворих з ознаками МС кореляційні зв’язки між експресією CXCR4 у пухлинних клітинах МЗ люмінального А підтипу і вмістом гормонів жирової тканини у СПК були відсутні, що може бути зумовлено дисбалансом цих гормонів у таких пацієнток.

Таким чином, результати проведеного дослідження свідчать, що у клітинах злоякісних новоутворень МЗ спостерігається варіабельність експресії хемокінового рецептора CXCR4, мітохондріального рибосомального білка S18-2 і ЩМС, яка асоціюється з певними молекулярними підтипами РМЗ і наявністю ознак МС у хворих.

Висока експресія CXCR4 у клітинах РМЗ люмінального А і В молекулярних підтипів може бути зумовлена високою експресією рецепторів стероїдних гормонів — ЕR та РR, що дозволяє реалізувати дію естрогенів таким чином: естрадіол/ЕR/CXCL12/CXCR4 [6]. Наявність у клітинах РМЗ люмінального В підтипу експресії Her2/neu може бути ще одним фактором, що спричиняє підвищення експресії CXCR4 [16, 17]. Не виключено, що зростання експресії CXCR4 у хворих з МС може бути зумовлене підвищенням вмісту у СПК лептину, який активує ряд транскрипційних факторів.

На сьогодні існує все більше доказів того, що адипонектин і лептин, що виділяються перитуморальною жировою тканиною, є важливими факторами патогенезу ряду гормонозалежних пухлин, включаючи РМЗ. Ці адипокіни виконують альтернативні функції. Адипонектин опосередковує інгібування декількох сигнальних шляхів, здійснюючи антипроліферативні та проапоптичні ефекти [18], лептин виступає в ролі фактора, що спричиняє прогресування пухлинного процесу [19, 20]. Саме лептин шляхом підсилення експресії ароматази і синтезу естрадіолу стимулює клітинну проліферацію і може зумовлювати розвиток хіміорезистентності у пухлинах хворих з ожирінням. Окрім цього, продемонстровано, що при ожирінні секреція CXCL12 пухлиноасоційованими фібробластами може збільшуватись і спричиняти підвищення експресії CXCR4 [14]. У проведеному нами дослідженні експресія CXCR4 зростає у пухлинах хворих з ознаками МС, що, напевно, пов’язано саме з підвищенням вмісту лептину і, відповідно, естрадіолу у СПК і пухлинній тканині цих хворих.

Крім зазначеного, не можна виключити, що зниження експресії хемокінового рецептора CXCR4 у пухлинах базального молекулярного підтипу може бути наслідком мутаційних змін гена CXCR4. Так, T. Sobolika та співавтори [8] зазначали, що у клітинній лінії РМЗ (MCF-7), яка містила CXCR4 дикого типу, спостерігали міцні міжклітинні контакти. Ця лінія зберігала епітеліальну морфологію і характеризувалася високою експресією E-кадгерину, який детектувався на клітинній мембрані зі збереженням зв’язку з β-катеніном. Проте двомірні культури клітин MCF-7 з аберантним CXCR4 демонстрували мезенхімальну морфологію із втратою міжклітинних контактів, що пов’язане зі зниженою експресією E-кадгерину, цитоплазматичною локалізацією β-катеніну і асоціювалося з підвищеною міграційною здатністю пухлинних клітин. Крім цього, у карциномах МЗ хворих з метастазами відзначали вірогідно вищу експресію потенційного маркера епітеліально-мезенхімального переходу — мітохондріального рибосомального протеїну S18-2 — порівняно з РМЗ у хворих без метастазів [13].

Можна припустити, що висока експресія S18‑2 у пухлинних клітинах РМЗ і підвищений вміст лептину у СПК спричиняло зростання ЩМС та асоціювалося з наявністю у хворих метастазів. При аналізі морфологічних характеристик пухлин МЗ хворих з метастазами виявлено збільшення кількості судин капілярного типу.

Таким чином, результати проведеного дослідження свідчать, що хемокіновий рецептор СXCR4 є перспективним маркером взаємодії пухлинних клітин і стромального мікрооточення РМЗ. Встановлено, що підвищення експресії хемокінового рецептора СXCR4, мітохондріального рибосомного білка S18-2 та збільшення ЩМС у пухлинних клітинах молочної залози пов’язане з наявністю у хворих ожиріння і АГ та асоціюється з виникненням метастазів, що може свідчити про прогностичне значення досліджених маркерів і наявності ознак МС для визначення групи пацієнтів з агресивнішим перебігом захворювання.

ВИСНОВКИ

1. Визначено, що наявність у хворих на РМЗ ожиріння і АГ асоціюється з вищою частотою виникнення метастазів і підвищенням у пухлинних клітинах експресії рибосомного білка S18-2 та збільшенням ЩМС порівняно з такими показниками у пухлинах хворих без ознак МС.

2. Встановлено, що експресія хемокінового рецептора CXCR4 у пухлинах МЗ залежить від молекулярного підтипу новоутворення і корелює з експресією S18-2.

3. Показано, що у пухлинах МЗ люмінального В молекулярного підтипу, який характеризується позитивною експресією рецепторів стероїдних гормонів (ER і PR) та онкобілка Her2/neu спостерігається висока експресія CXCR4 та зростає васкуляризація новоутворення.

Робота виконана за підтримки ВБФМБ Національної академії наук України 2017–2021 рр., у рамках НДР «Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин» (№ держреєстрації 01170U2034).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Kazan M, Karalti I. The association between obesity and cancer. Endocrinol Metab Syndr 2015; 4 (4): 196. doi: 10.4172/2161-1017.1000196.
2. Laurent V, Guérard A, Mazerolles C, et al. Periprostatic adipocytes act as a driving force for prostate cancer progression in obesity. Nat Commun 2016; 7: 10230.
3. Donohoe CL, Lysaght J, O’Sullivan J, Reynolds JV. Emerging concepts linking obesity with the hallmarks of cancer. Trends Endocrinol Metab 2017; 28 (1): 46–62.
4. Anido S, Barone I, Giordano C, et al. The multifaceted mechanism of leptin signaling within tumor microenvironment in driving breast cancer growth and progression. Front Oncol 2014; 4: 340. doi 103389/fonc.2014.00340.
5. Nesina IP, Zadvorny TV, Nespryad’ko SV, et al. Сontents of adiponectin and leptin in peripheral blood serum of brest and endometrial cancer patients with obesity. Oncology 2019; 21 (1): 17–22 (In Ukrainian).
6. Boudot A, Kerdivel G, Habauzit D, et al. Differential еstrogen-regulation of CXCL12 сhemokine receptors, CXCR4 and CXCR7, contributes to the growth еffect of еstrogens in breast cancer cells. PLoS ONE 2011; 6 (6): e20898.
7. Sahoo SS, Zhang XD, Hondermarck H, Tanwar PS. The Emerging role of the microenvironment in endometrial cancer. Cancers 2018; 10: 408.
8. Sobolika T, Wellsc S Y-jun, Ayersd GD, et al. CXCR4 drives the metastatic phenotype in breast cancer through induction of CXCR2 and activation of MEK and PI3K pathways. Molecular Biology Cell M BoC 2014; 25 (5): 566–70.
9. GhoneumA, Afify H, Salih Z, et al. Role of tumor microenvironment in ovarian cancer pathobiology. Oncotarget 2018; 9 (32): 22832–49.
10. Huang K, Kiefer C, Kamal A. Novel role for NFAT3 in ERK-mediated regulation of CXCR4. PLoS One 2014; 9 (12): e115249.
11. Wu N, Yang Yi, Yu N, et al. Tetramethylpyrazine downregulates transcription of the CXC receptor 4 (CXCR4) via nuclear respiratory factor‑1 (Nrf‑1) in WERI‑Rb1 retinoblastoma cells. Oncology Reports 2019; 42 (3): 1214–24
12. Mushtaq M, Jensen L, Davidsson S, et al. MRPS18-2 protein levels correlate with prostate tumor progression and it induces CXCR4-dependent migration of cancer cells. Sci Rep 2018; 8 (1): 2268.
13. Buchynska LG, Iurchenko NP, Kashuba EV, et al. Оverexpression of the mitochondrial ribosomal protein S18-2 in the invasive breast carcinomas. Exp Oncol 2018; 40 (4): 303–8.
14. Yao L, Heuser-Baker J, Barlic-Dicen J. Chemokine receptors on the defensive — the surprising role of CXCR4 in brown adipose tissue. Receptors Clinical Investigation 2015; 2: e397.
15. Kurman RJ, Carcangiu ML, Herrington CS, Young RH. WHO classification of tumours of the female reproductive organs (IARC WHO Classification of tumours). 4th Ed: IARC 2014. 307 p.
16. Ayala NС, Alsina А, Pescie MМG, et al. CXCR4/SDF-1 expression in HER2/neu breast cancer biopsies and its relation to adjuvant treatment. J Clin Oncol 2016; 34(15). doi: 10.1200/JCO.2016.34.15_suppl.e12090.
17. Lefort S, Thuleau A, Kieffer Y, et al. CXCR4 inhibitors could benefit to HER2 but not to triple-negative breast cancer patients. Oncogene 2017; 36: 1211–22.
18. Lang K, Ratke J. Leрptin and adiponectin: new players in the field of tumor cell and leukocyte migration. BMC 2009 (https://doi.org/10.1186/1478-811X-7-27).
19. Liu L, Wang L, Zheng J, Tang G. Leрptin promotes human endometrial carcinoma cell proliferation by enhancing aromatase (P450arom) expression and estradiol formation. E J Obstetrics Gynecoly Reproductive Biol 2013; 170 (1): 198–201.
20. Candelaria Pv, Rampoldi A, Harbuzariu A, Gonzalez-Perez RR. Leptin signaling and cancer chemoresistance: Perspectives. World J Clin Oncol 2017; 8 (2): 106–19.

Адреса для листування:
Несіна І.П.
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
E-mail: laboncogen@gmail.com

Одержано: 22.05.2020