ІМУНОЦИТОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВОРСИНЧАСТИХ ЛІМФОЦИТІВ ПРИ В-КЛІТИННИХ ЛІМФОПРОЛІФЕРАТИВНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-3-2019-g.8014

У новій класифікації ВООЗ (перегляд 2016 р.) пухлин лімфоїдної тканини наведені критерії виділення окремих форм В-клітинних новоутворень на основі цитоморфологічних, імунофенотипових та молекулярно-генетичних досліджень [1, 2]. У категорію лімфопроліферативних захворювань, що виникають зі зрілих В-лімфоцитів, на рівні з хронічним лімфолейкозом (В-ХЛЛ), В-клітинним пролімфоцитарним лейкозом (В-ПЛЛ) та деякими неходжкінськими лімфомами (НХЛ), входять захворювання, які характеризуються спленомегалією, наявністю в кістковому мозку та периферичній крові неопластичних лімфоїдних клітин із ворсинчастими відростками цитоплазми. До цієї групи відносяться волосковоклітинний лейкоз (ВКЛ), лімфома маргінальної зони селезінки (ЛМЗС), дифузна лімфома червоної пульпи селезінки з малих лімфоцитів (ЛЧПС) та варіантний волосковоклітинний лейкоз (В-ВКЛ) [3–6].

Мета дослідження — на основі порівняння морфологічних та імуноцитохімічних ознак встановити ймовірну природу неопластичних субстратних клітин при зазначених захворюваннях.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У роботі наведені результати 10-річних досліджень співробітників Референтної лабораторії відділу онкогематології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Вивчали лімфоїдні клітини периферичної крові та кісткового мозку хворих на ВКЛ, ЛМЗС, ЛЧПС та В-ВКЛ, отримані до початку лікування.

За допомогою імерсійної системи (х 1000) здійснювали цитоморфологічне дослідження мазків крові та кісткового мозку, забарвлених за Паппенгеймом. Проводили цитохімічне визначення внутрішньоклітинної локалізації та активності тартратрезистентної кислої фосфатази (ТРКФ) (КФ 3.1.3.2) за методом Goldberg, Barka [7]. При імуноцитохімічному дослідженні антигенів поверхневих мембран клітин за допомогою панелі моноклональних антитіл (МкАт) (Dako Cytomation, Данія) застосовували лужно-фосфатазний стрептавідин-біотиновий метод (LSAB-AP) і метод проточної цитометрії з використанням цитометру Beckman Coulter EPICS XL (США).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Волосковоклітинний лейкоз (ВКЛ) виявлено у 137 осіб віком від 26 до 70 років. Майже в усіх випадках була наявна спленомегалія. Ознаки гіпер­плазії лімфатичних вузлів у черевній порожнині та середостінні за допомогою комп’ютерної томографії виявлено у небагатьох пацієнтів. Інколи вогнища ураження спостерігалися в печінці та кістках скелета, вкрай рідко виявляли наявність ексудату в грудній або черевній порожнині. При виконанні загального аналізу крові у більшості хворих виявлена анемія (вміст гемоглобіну <100 г/л), тромбоцитопенія (кількість тромбоцитів <100⋅10⁹/л), у більшості хворих була виражена лейкопенія (0,7–1,5⋅10⁹/л). В окремих пацієнтів вміст лейкоцитів у периферичній крові був достатньо високим (20–30⋅10⁹/л). У лейкограмі в більшості випадків спостерігали відносне переважання Т-лімфоцитів, а також зазвичай відзначали виражену моноцитопенію. Субстратні клітини з ворсинчастими відростками становили від 5 до 10%, іноді більше, особливо у разі з помірним збільшенням загальної кількості лейкоцитів.

Клітинний склад мієлограм у хворих на ВКЛ також був неоднаковим. В окремих випадках спостерігалася картина вираженої гіпоплазії з поодинокими субстратними клітинами, в інших — переважали лімфоїдні клітини з характерними цитоморфологічними ознаками. У більшості випадків це були лімфоїдні клітини середнього розміру, дещо більші, ніж при В-ХЛЛ, з помірно широкою світло-блакитною цитоплазмою з поліморфними ворсинчастими відростками. Ядра клітин округлої, овальної чи бобовидної форми, в окремих випадках розміщені ексцентрично. Структура ядерного хроматину була помірно щільною, ядерця нечітко контурувались або взагалі не виявлялися.

Головний діагностичний критерій у хворих на ВКЛ при ензимоцитохімічному дослідженні — визначення наявності високої активності кислої фосфатази у вигляді інтенсивного забарвлення цитоплазми клітин із ворсинчастими відростками (рис. 1). Інтенсивність забарвлення цитоплазми клітин не змінювалася при додаванні в інкубаційне середовище інгібітора — 0,05М виннокислого калію-натрію (тартрату). Наявність ТРКФ (ізоферменту 5), як відомо, є досить надійною ознакою, яка дозволяє проводити диференційну діагностику ВКЛ з іншими лімфопроліферативними захворюваннями.

Рис. 1. Клітини кісткового мозку при ВКЛ: а — забарвлення за Паппенгеймом; б — реакція на ТРКФ. х 1000

Неопластичні клітини, які виявляли у хворих на ВКЛ в кістковому мозку та периферичній крові, мали імунофенотип відносно зрілих В-клітин. На їх поверхневих мембранах визначали експресію асоційованих із В-лімфоцитами антигенів CD19, CD20, CD22, CD79а, яка була особливо вираженою при виявленні останніх двох маркерів. Помірна чи виражена реакція спостерігалася при виявленні на поверхневих мембранах клітин IgM. Зазвичай негативні результати отримували при визначенні антигенів CD5, CD10, CD23 і CD43. Позитивною була реакція при виявленні антигену CD25 (α-ланцюга рецептора інтерлейкіну-2), який є маркером активованих В- і Т-клітин. Позитивну експресію, більш виражену, ніж при інших лімфопроліферативних захворюваннях, відзначали при реакції з МкАт до антигену CD11с. На поверхневих мембранах клітин при ВКЛ, на відміну від В-ХЛЛ та нечисленних випадків фолікулярних лімфом і лімфом із клітин мантійної зони, виявляли експресію антигену CD103. Вираженою була експресія антигену CD200. В ⅓ випадків виявлена слабка експресія цикліну D1.

Лімфому маргінальної зони селезінки (ЛМЗС), яка також називалася лімфомою селезінки з циркулюючими у крові ворсинчастими лімфоцитами, раніше діагностували як один із цитологічних варіантів В-ХЛЛ. Діагноз ЛМЗС встановлено нами у 266 пацієнтів, серед яких переважали особи віком старше 60 років. Для більшості хворих характерна наявність спленомегалії, що поєднувалась з анемією та аутоімунною тромбоцитопенією. В патологічний процес у певної категорії хворих були залучені лімфатичні вузли біля воріт селезінки, печінка та кістковий мозок. Практично не спостерігалось ураження периферичних лімфатичних вузлів. Кількість лейкоцитів у периферичній крові зазвичай була в межах норми чи дещо підвищеною. Тільки у 20% пацієнтів вона була > 25⋅10⁹/л. При дослідженні мазків периферичної крові визначалася варіююча кількість лімфоцитів із ворсинчастими відростками.

Лімфоцити периферичної крові були невеликого чи середнього розміру, інколи дещо більшими, ніж при В-ХЛЛ (рис. 2). Ядра клітин — округлої форми. Структура хроматину ядер дрібногранулярна. Розмір цитоплазми варіював, частіше вона була світло-­блакитною і значно вужчою, ніж при ВКЛ. Відповідно, ядерно-цитоплазматичне співвідношення було вищим, ніж при ВКЛ. У частини лімфоцитів спостерігалися короткі й нечисленні вирости в цитоплазмі.

Рис. 2. В-лімфоцити в периферичній крові при лімфомі маргінальної зони селезінки у фазі лейкемізації. х 1000

При цитохімічному дослідженні клітин ЛМЗС активність кислої фосфатази визначали у вигляді слабкого чи помірного дифузно-гранулярного забарвлення цитоплазми. У переважної кількості пацієнтів реакція в більшості клітин крові та кісткового мозку повністю інгібувалася іонами тартрату, проте у 20% випадків вона зберігалась у вигляді значно слабшого забарвлення у 10–15% клітин. Дані імунофенотипування свідчили про належність клітин при ЛМЗС до категорії відносно зрілих клітинних елементів В-клітинного походження. На поверхневих мембранах неопластичних клітин встановлена наявність антигенів CD19, CD20, виражена експресія антигену CD22. У половині випадків визначали експресію CD11с, у 10% хворих спостерігали слабку експресію CD25 або CD5. Експресію антигену CD103 і цикліну D1 не визначали.

Лімфома червоної пульпи селезінки із малих лімфоцитів (ЛЧПС) у структурі НХЛ становить < 1%. Нарівні з селезінкою в патологічний процес при ЛЧПС залучені синуси кісткового мозку. Нами досліджено три випадки ЛЧПС (у чоловіків віком 58, 64 і 72 роки). До клініко-гематологічних ознак у цих пацієнтів слід віднести наявність вираженої спленомегалії, лейкопенії та тромбоцитопенії. При мікроскопічному дослідженні в мазках периферичної крові та кісткового мозку визначали круглі клітини невеликого та середнього розміру з рихлою структурою ядерного хроматину, вузькою цитоплазмою з ознаками певної базофілії. Відростки в цитоплазмі були дещо ширші та довші, ніж у хворих на ВКЛ та ЛМЗС (рис. 3).

Рис. 3. Клітини кісткового мозку при лімфомі червоної пульпи селезінки у фазі лейкемізації: а — забарвлення за Паппенгеймом; б — слабка активність ТРКФ в субстратних клітинах. х 1000

При цитохімічному дослідженні в неопластичних клітинах активність кислої фосфатази коливалася від слабкої до помірної та виявлялася в цитоплазмі клітин у вигляді гранул. У двох випадках реакція повністю інгібувалась іонами тартрату, а у клітинах одного хворого зберігалась у вигляді слабкого забарвлення. Клітини крові та кісткового мозку двох хворих на ЛЧПС мали характерний імунофенотиповий профіль: CD19⁺CD20⁺CD22⁺ (яскрава реакція) CD25^–CD103^–CD11с^–CD5^–циклін D1^–. Позитивну слабку реакцію при визначенні антигенів CD103 і CD11с відзначали в одного хворого.

Варіантний волосковоклітинний лейкоз (В-ВКЛ). Відповідно до переглянутої класифікації ВООЗ (2016), на рівні з ЛЧПС як попередню нозологічну форму включили В-ВКЛ у категорію «В-клітинна лімфома/лейкоз селезінки некласифікована». В-ВКЛ відрізняється від ВКЛ за наявністю специфічних гістологічних, імунофенотипових ознак та за рівнем чутливості хворого до хіміотерапії. В обстежених нами 5 хворих (віком старше 60 років) спостерігали ознаки спленомегалії при відсутності лімф­аденопатії. У всіх хворих відзначали ознаки анемії та тромбоцитопенії. Кількість лейкоцитів у периферичній крові коливалась у межах від 30 до 50⋅10⁹/л. Вміст моноцитів у крові, на відміну від класичного ВКЛ, був підвищеним. У мазках периферичної крові та кісткового мозку виявляли значну кількість лімфоїдних клітин із ворсинчастою цитоплазмою. В неопластичних клітинах відзначали вище, ніж при ВКЛ, ядерно-цитоплазматичне співвідношення. Цитоплазма клітин була вузькою і відзначалася слабкою базофілією. Вирости цитоплазми більш нагадували ті, що виявлялись у клітинах хворих на ЛЧПС. Ядра клітин — із конденсованою структурою хроматину та чітко вираженими ядерцями, подібними до тих, що спостерігалися у клітинах при В-ПЛЛ. Реакція на кислу фосфатазу була дрібно-­гранулярною від слабкої до помірної. При додаванні в інкубаційне середо­вище інгібітора іонів тартрату у двох випадках у частині клітин реакція зберігалася, проте була дуже слабкою. В інших хворих вона повністю інгібувалася. На поверхневих мембранах клітин периферичної крові та кісткового мозку виявляли експресію В-клітинних антигенів CD19 і CD20, а також слабку експресію антигенів CD22, CD103 та CD11с. Реакція при визначенні антигену CD25 і цикліну D1 була негативною.

Результати проведених нами лабораторних гематологічних досліджень та дані імунофенотипу клітин надзвичайно важливі для проведення диференційної діагностики ряду В-клітинних лімфопроліферативних захворювань (таблиця).

Отримані дані можуть бути використані також для ретроспективного підтвердження обґрунтованого виділення ВКЛ, ЛМЗС, ЛЧПС, В-ВКЛ як окремих нозологічних форм у новій класифікації лімфоїдних новоутворень ВООЗ (2016).

Таблиця. Цитохімічні та імунофенотипові ознаки ворсинчастих лімфоцитів при В-клітинних лімфопроліферативних захворюваннях

На сьогодні в ролі нормального клітинного аналога розвитку лімфопроліферативних захворювань, які розглянуто в зазначеному повідомленні, виділяється активована В-клітина на пізніх стадіях антигензалежного диференціювання [1]. Можна припустити, що поява нових даних внаслідок проведення цитогенетичних та молекулярно-генетичних досліджень, схожих на нещодавно виявлені мутації генів MAP2K1 і BRAF при ВКЛ [8], дасть можливість детальніше уточнити та охарактеризувати окремі клітинні елементи, із трансформацією яких пов’язане виникнення неопластичних процесів та поява в кістковому мозку і периферичній крові патологічних клітин із ворсинчастими відростками.

ВИСНОВКИ

1. Встановлені цитохімічні та імунофенотипові маркери ворсинчастих лімфоцитів при різних формах В-клітинних лімфопроліферативних захворювань.

2. Результати цитоморфологічного та імунофенотипового досліджень субстратних клітин периферичної крові та кісткового мозку можуть бути безпосередньо використані при встановленні діагнозу ЛМЗС, ЛЧПС, В-ВКЛ без вивчення гістологічних препаратів видаленої селезінки після оперативного втручання.

3. Особливе значення має диференціація ЛМЗС і ЛСЧП, від якої залежить вибір методу терапії та прогноз у окремих хворих.

CПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Swerdlow SH, Campo E, Pilery, et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood 2016; 127 (20): 2376–90.
• 2. Bain BJ. Leukemia diagnosis, 5^th ed. London: John Wiley & Sons, Inc, 2017. 498 p.
• 3. Vyhovska YI, Loginsky VY, Mazurok AA, et al. Splenic lymphoma from villous lymphocytes. Oncology 1999; 1 (3): 177–82. (in Ukrainian).
• 4. Behdad A, Bailey NG. Diagnosis of splenic B-cell lymphomas in the bone marrow: a review of histopathologic, immunophenotypic, and genetic findings. Arch Pathol Lab Med 2014; 138 (10): 1295–301.
• 5. Ponzoni M, Kenellis G, Poulion E, et al. Bone marrow histopathology in the diagnostic evaluation of splenic marginal-zone and splenic diffuse red pulp small B-cell lymphoma: a reliable substitute for spleen histopathology. Am J Surg Pathol 2012; 36 (11):1609–18.
• 6. Dong HY, Weisberger J, Liu Z, Tugulea S. Immunophenotypic analysis of CD103+ B-lymphoproliferative disorders: hairy cell leukemia and its mimics. Am J Clin Pathol 2009; 131 (4): 586–95.
• 7. Gluzman DF. Diagnostic cytochemistry of hematoblastoses. Kyiv: Nauk Dymka, 1978. 210 p. (in Russian).
• 8. Tiacci E, Trifonov V, Schiavoni G, et al. BRAF mutation in hairy-cell leukemia. N Engl J Med 2011; 364 (24): 2305–15.

Адреса для листування:
Скляренко Л.М.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології
і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
Е-mail: vals@onconet.kiev.ua

Одержано: 23.05.2019