ОСОБЛИВОСТІ ЕКСПРЕСІЇ БІЛКІВ P53, BCL-2 ТА РЕЦЕПТОРНИХ ТИРОЗИНКІНАЗ У ПУХЛИНАХ ХВОРИХ НА РАК ШЛУНКА

ВСТУП

Розвиток молекулярної біології і генетики сприяв більш глибокому розумінню механізмів малігнізації клітини та виникнення неоплазій [1]. Протягом останніх років досягнуто значного прогресу в ідентифікації генів, порушення яких призводять до розвитку новоутворень. Важливу роль у виникненні та подальшому рості пухлин відіграють порушення контролю клітинного циклу, регуляції процесів апоптозу та активація шляхів внутрішньоклітинної передачі мітогенного сигналу [2]. Проапоптотичний білок р53 активується у відповідь на численні несприятливі впливи, які можуть призводити до різних генетичних порушень (поява розривів у ланцюгах ДНК, нестача нуклеотидів, руйнування мікротрубочок, відсутність сегрегації хромосом під час мітозу, тощо) [3]. р53 в свою чергу активує білок р21Waf1/Cip1 (інгібітор циклінзалежної кінази cdk2 і відповідно її комплексів з циклінами Е, А, В), який спричиняє зупинку клітинного циклу у фазі G1, блокуючи перехід у S-фазу [1]. р21 може також взаємодіяти з білками, які приймають участь у синтезі та репарації ДНК (PCNA, GADD45), а також з рецепторами апоптогенних чинників і регуляторами апоптозу (Fas, Bcl-2, Bax) [4]. Внаслідок мутацій у гені p53 кодований ним білок втрачає здатність нормально виконувати свої функції, що призводить до неконтрольованого росту пухлин [5]. Bcl-2 (білок з родини регуляторів апоптозу Bcl-2) володіє сильною антиапоптотичною дією, оскільки має здатність зв’язувати принаймні п’ять інших білків цієї родини, які виконують проапоптотичні функції. Запуск цього механізму призводить до порушення формування мітохондріальних пор та блокує вихід з мітохондрій цитохрому С та APAF-1, які активують каспазу-9 і запускають процеси власне апоптозу [6–9]. Така активність Bcl-2 зумовлює виживання пухлинних клітин при застосуванні протипухлинних препаратів, дія яких спрямована на активацію апоптозу [10], а також за інших умов, що зумовлюють

такі процеси (оксидативний стрес, вірусні інфекції, активація р53 тощо) [11].

Серед рецепторів, які активують внутрішньоклітинні сигнальні шляхи, важливе місце посідають рецепторні тирозинкінази родини ErbB, а саме рецептор епідермального фактору росту (EGFR) та Her-2/neu [12–14]. Сигнал з активованих рецепторів передається на мітоген-активовані протеїнкінази (МАРК), фосфатиділінозитол-3-кіназу (РІ3К) та фосфоліпазу С, що призводить до різноманітних змін у процесах апоптозу, поділу, рухливості, диференціювання клітин, секреції білків [15].

У доступній нам літературі існують поодинокі повідомлення щодо важливості визначення білківрегуляторів апоптозу та тирозинкіназних рецепторів у злоякісних новоутвореннях шлунка. Поряд з цим дані щодо особливостей зв’язку між наявністю цих білків у пухлинних клітинах та клінічними прогностичними факторами, а також виживаністю хворих досить суперечливі, або фокусуються навколо характеристик, які відображають лише один із параметрів, пов’язаних з біологічною активністю раку шлунка (РШ) [14, 16–18]. Мета дослідження — вивчити особливості експресії пухлинними клітинами білківрегуляторів апоптозу (р53 та Bcl-2) і рецепторних тирозинкіназ (EGFR і Her-2/neu), оцінити їх зв’язок з клініко-морфологічними характеристиками та показниками виживаності у хворих на РШ II–IV стадії.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Використані зразки пухлин 150 хворих на РШ II–IV стадії, які перебували на стаціонарному лікуванні у ДУ

«Національний інститут раку» МОЗ України у період з 1998 по 2004 р. Парафінові блоки пухлин було отримано з архіву цієї медичної установи. За стадіями хвороби пацієнти розподілені за класифікацією TNM [19]: ІІ — 39 (26%), ІІІ — 54 (36%) та IV — 57 (38%). Залеж-

но від гістологічного типу за Lauren [20] 117 (78%) хворих мали кишковий тип РШ, 33 (22%) — дифузний. Розподіл хворих на РШ залежно від Т-критерію, сту-

пеня ураження регіонарних лімфатичних вузлів (ЛВ) та наявності віддалених метастазів наведено у табл. 1.

Таблиця 1

Клінічна характеристика хворих на РШ

При аналізі впливу стадії хвороби на експресію досліджених білків визначено, що максимальна експресія р53 (75,4%) має місце у хворих на РШ IV стадії, тоді як експресію антиапоптотичного онкопротеїну Bcl-2 визначали переважно (72,4%) у хворих на РШ ранніх стадій (табл. 2).

Для виявлення досліджуваних білків імуногістохімічним (ІГХ) методом застосовані МкАТ («Dako Cytomation», Denmark) специфічні до р53, Bcl-2 (клони DO-7 та 124 відповідно) та EGFR і Her-2/neu (клони 3B5, E30 відповідно). Для візуалізації реакції у препаратах використовували набір реактивів Envision+ та 3,3-диамінобензидин («Dako Cytomation», Denmark), після чого зрізи забарвлювали гематоксиліном [21]. Пухлини вважали р53-позитивними, якщо кількість клітин, у ядрах яких виявляли білок р53, була більшою за 5%, і позитивними за іншими дослідженими маркерами, якщо цитоплазматична реакція була присутня більше, ніж у 20% клітин [22]. Статистична обробка результатів проведена за допомогою програми STATISTICA 6.0, кореляційний аналіз виконано з використанням коефіцієнта асоціації Пірсона з урахуванням поправки Йєтса (rA) та коефіцієнта взаємної спряженості Чупрова (К). Значимість коефіцієнтів оцінена за допомогою критерію хі-квадрат (χ2), виживаність хворих — за допомогою теста Каплана — Майєра. Порівняння кривих виживаності хворих проведено за допомогою U-тесту Уілкоксона [23].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз результатів ІГХ-визначення досліджених маркерів у загальній групі хворих на РШ показав, що позитивну реакцію з МкАТ, специфічними до р53, спостерігали в ядрах пухлинних клітин 48,0% хворих. Bcl-2 було виявлено в цитоплазмі пухлинних клітин у 30,0% випадків. Експресію рецепторних тирозинкіназ також спостерігали у цитоплазмі пухлинних клітин: EGFR — у 31,3%, Her-2/neu — у 33,3% випадків.

Відомо, що білки р53 та Bcl-2 відіграють важливу роль у регуляції апоптозу [24]. Ген р53 постійно транскрибується і транслюється, однак його білок швидко деградує у протеосомах і у більшості тканин не визначається [25]. Мутантна форма р53 не виконує функцій нормального («дикого») білка. Згідно з даними літератури мутації у цьому гені можуть ініціювати канцерогенез (синдром Лі-Фраумені) [5], а також виникати під час росту пухлини, спричиняючи появу її нових агресивних властивостей. Мутантний p53 має тривалий період напіврозпаду (до 24 год) [26]. Вважають, що позитивна ІГХ-реакція з МкАТ, специфічними до цього білка (зокрема з МкАТ клону DO-7), повністю залежить від наявності мутантного типу р53 [27].

Таблиця 2

Експресія білків-регуляторів апоптозу у пухлинах хворих на РШ залежно від розповсюдженості процесу та гістологічного типу пухлин

У табл. 2 і 3: *р < 0,01. 1Значення коефіцієнта взаємної спряженості Чупрова між наявністю дослідженого маркера та наявністю метастатичного ураження ЛВ за класифікацією TNM. 2Значення коефіцієнта асоціації Пірсона з урахуванням поправки Йєтса між наявністю дослідженого маркера та ступенем ураження ЛВ.

Встановлена наявність вірогідних кореляційних зв’язків середньої сили між присутністю у зразках пухлин р53 (К = 0,34), Bcl-2 (К = 0,32) та стадією хвороби. Загалом, у групі хворих на РШ спостерігали достовірний кореляційний зв’язок середньої сили (r = 0,32) між наявністю у пухлинах експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 та відсутністю експресії р53. Вірогідно, що у пухлинній клітині блокування процесів апоптозу відбувається на одному з двох етапів росту пухлини за різними механізмами: на ранніх стадіях активується антиапоптотичний Bcl-2, на пізніх стадіях виникають мутації у гені р53, що призводить до втрати функціональних властивостей білка, який він кодує. Це відповідає даним літератури щодо зміни апоптотичних індексів на пізніх стадіях РШ порівняно з ранніми [28]. Дослідження впливу клініко-морфологічних факторів, на яких базується класифікація TNM, показало тенденцію щодо збільшення відсотка Bcl-2-позитивних пухлин при ураженнях м’язевого шару стінки шлунка (T4) (до 39,66%). Крім цього, відзначали тенденцію до збільшення експресії мутантної форми р53 при зростанні ступеня метастатичного ураження регіонарних ЛВ (з 41,27% при N0 до 50,00 % при N2). Водночас, ми не отримали достовірних результатів щодо впливу віддалених метастазів на експресію цих білків, що, вірогідно, можна пояснити недостатнім розміром вибірки.

Аналіз експресії рецепторних тирозинкіназ родини

ErbB (EGFR та Her-2/neu) демонструє (табл. 3), що для

пухлин хворих на РШ ІІ стадії характерною є негативна реакція з МкАТ, специфічними до Her-2/neu.

Таблиця 3 Експресія рецепторних тирозинкіназ у пухлинах хворих на РШ залежно від розповсюдженості процесу та гістологічного типу

пухлин

ному типі РШ [32, 33]. Експресія ж Bcl-2 достовірно не відрізнялась у зразках пухлин дифузного (54,55%) і кишкового (46,15%) гістотипів (див. табл. 2). При аналізі експресії рецепторних тирозинкіназ залежно від гістологічного типу пухлин ми встановили, що для РШ кишкового типу, який вважається більш чутливим до лікування, характерна наявність обох рецепторів (69,70% для EGFR і 72,73% для Her-2/neu). Аналіз кореляційних зв’язків між наявністю досліджених маркерів та гістологічним типом пухлин підтвердив

ці дані (rA = 0,42 для EGFR, rA = 0,50 для Her-2/neu).

Натомість пухлинні клітини хворих на РШ IV стадії характеризуються підвищеною експресією Her-2/neu. Присутність Her-2/neu на пізніх стадіях РШ може бути пов’язана з тим, що у цей період відбувається ампліфікація гену c-erbB2, який кодує досліджений рецептор [29]. Існують також дані, що Her-2/neu виявляють переважно на пізніх стадіях захворювання, для яких характерною є наявність значних метастатичних уражень ЛВ за рахунок здатності Her-2/neu здійснювати фосфорилювання білка адгезії β-катеніну [30]. Ми виявили достовірні слабкі кореляційні зв’язки між експресією Her-2/neu та стадією хвороби (К = 0,25). Відзначали зростання експресії цього білка з 28,57% за відсутності ураження ЛВ (N0) до 40,48% при N2, що узгоджується з наведеними вище результатами щодо зв’язку між експресією досліджених маркерів та стадією хвороби. Тенденцію до зниження експресії EGFR до 18,97%, за отриманими нами даними, відзначали при дифузному ураженні стінки шлунка (у тих випадках, коли мало місце ураження суміжних анатомічних структур). Не знайдено кореляційної залежності між ступенем ураження стінки шлунка (Т), ураженням регіонарних ЛВ (N) та експресією EGFR та Her-2/neu. Вірогідно, такий результат може бути пов’язаний з тим, що ці білки безпосередньо не залучені до процесів інвазії та розвитку метастазів [29, 31].

Ще одним із клінічних факторів прогнозу у хворих на РШ є гістологічний тип пухлини. У клінічній практиці широко застосовується гістологічна класифікація РШ за Laurén, згідно з якою виділяють два основних гістологічних типи РШ: дифузний та кишковий. У нашому дослідженні наявність мутантного р53 була характерною для РШ дифузного типу (r = 0,48), що співпадає з даними літератури щодо зниження активності процесів апоптозу при дифуз-

При РШ дифузного типу експресія обох маркерів була відсутньою або вкрай низькою. Отже, можна зробити висновок, що для РШ кишкового типу характерне посилення експресії рецепторів ростових факторів; це узгоджується з клінічними спостереженнями, що пухлини цього гістологічного типу активно діляться і є чутливими до дії протипухлинних препаратів [34].

Знайдено відмінності між експресією дослі- джуваних молекулярних маркерів та виживаністю хворих на РШ (табл. 4).

Таблиця 4 Розподіл пухлин із позитивною експресією досліджених

маркерів залежно від тривалості життя хворих на РШ

*Коефіцієнт взаємної спряженості Чупрова.

Зокрема, встановлено, що у хворих, які прожили

< 1 року, переважно виявляли мутантний p53 і Bcl-2, тоді як у хворих, які прожили > 3 років, експресія цих білків була відсутньою; це підтверджується розрахунками відповідних коефіцієнтів кореляції (К = 0,34 для р53; К = 0,30 для Bcl-2). У пухлинних клітинах хворих на РШ, які прожили < 1 року, виявляли експресію переважно обох типів рецепторів (EGFR — 40,26% та Her-2/neu — 41,56%), що співпадає з даними [35, 36]. Але кореляційні зв’язки між присутністю цих білків та тривалістю життя були слабкими і недостовірними (К = 0,15 для Her-2/neu, К = 0,17 для EGFR). Аналіз кривих виживаності, побудованих за методом Каплана — Майєра, також не показав достовірних відмінностей між групами хворих, які відрізняються за наявністю у пухлинах досліджених маркерів.

ВИСНОВКИ

1. На підставі клінічних даних та ІГХ-дослідження встановлено, що відсутність експресії в пухлинних клітинах РШ білків апоптозу-регуляторів р53 і Bcl-2 є сприятливою прогностичною ознакою.
2. Несприятливою прогностичною ознакою ранніх стадій РШ є підвищений рівень експресії Bcl-2.
3. Присутність у пухлинах шлунка обох дослі- джених рецепторних тирозинкіназ (EGFR та Her-2/neu), за отриманими нами даними, вказує на несприятливий клінічний прогноз перебігу РШ.

ЛІТЕРАТУРА

1. Scartozzi M, et al. Molecular biology of sporadic gastric cancer: prognostic indicators and novel therapeutic approaches. Cancer Treatment Rev 2004; 30 (5): 451–9.

2. Yasui W, et al. Molecular-pathological prognostic factors of gastric cancer: a review. Gastric Cancer 2005; 8: 86–94.

3. Hasegawa S, et al. Genome-Wide Analysis of Gene Expression in Intestinal-Type Gastric Cancers Using a Complementary DNA Microarray Representing 23,040 Genes. Cancer Res 2002; 62: 7012–7.

4. Harris CC. Structure and Function of the p53 Tumor Suppressor Gene: Clues for Rational Cancer Therapeutic Strategies. J National Cancer Ins 1996; 88 (20): 1442–55.

5. Xi Y-G, et al. p53 polymorphism and p21WAF1/CIP1 haplotype in the intestinal gastric cancer and the precancerous lesions. Carcinogenesis 2004; 25 (11): 2201–6.

6. Soini Y, et al. Histopathological Evaluation of Apoptosis in Cancer. Am J Pathol 1998; 153: 1041–53.

7. Thomenius MJ, Distelhorst CW. Bcl-2 on the endoplasmic reticulum: protecting the mitochondria from a distance. J Cell Science 2003; 116: 4493–9.

8. Michael C, et al. Mitochondria primed by death signals determines cellular addiction to antiapoptotic Bcl-2 family members. Cancer Cell 2006; 9 (5): 351–65.

9. Yang J, et al.Prevention of apoptosis by bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 1997; 275: 1129–32.

10. Nagashima F, et al. Biological Markers as a Predictor for Response and Prognosis of Unresectable Gastric Cancer Patients Treated with Irinotecan and Cisplatin. Japan J Clin Oncol 2005; 35 (12): 714–9.

11. Yang E, Korsmeyer SJ. Molecular thanatopsis: a discourse on the BCL2 family and cell death. Blood 1996; 88: 386–401.

12. Lin W, et al. Tyrosine kinases and gastric cancer. Oncogene 2000; 19 (49): 5680–9.

13. Arnold D, et al. Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitors: Present and Future Role in Gastrointestinal Cancer Treatment: A Review. The Oncologist 2006; 11 (6): 602–11.

14. Hirata A, et al. HER2 Overexpression Increases Sensitivity to Gefitinib, an Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor, through Inhibition of HER2/HER3 Heterodimer Formation in Lung Cancer Cells. Cancer Res 2005; 65: 4253–60.

15. Ross JS, McKenna BJ. The HER-2/neu Oncogene in Tumors of the Gastrointestinal Tract. Cancer Investigation 2001; 19 (5): 554–68.

16. Fondevila C, et al. p53 and VEGF expression are independent predictors of tumor recurrence and survival following curative resection of gastric cancer. Br J Cancer 2004; 90: 206–15.

17. Gamboa-Dominguez A, et al. Prognostic significance of p21WAF1/CIP1, p27Kip1, p53 and E-cadherin expression in gastric cancer. J Clin Pathol 2007; 60: 756–61.

18. Zhou YN, et al. Expression of E-cadherin and β-catenin in gastric carcinoma and its correlation with the clinicopathological features and patient survival. World J Gastroenterol 2002; 8: 987–93.

19. TNM classification of malignant tumours (5th ed) / Eds: LH Sobin, C Wittekind / New York, Chichester, Weinheim,

1. Рыжов СВ, Новиков ВВ. Молекулярные механизмы апоптотических процессов. Росс биотерапевт журн 2002; 1 (3): 27–33.

2. Hsieh L-L, et al. p53 mutations in gastric cancers from Taiwan. Cancer Lett 1996; 100 (1–2): 107–13.

3. Soong R, et al. Concordance between p53 protein overexpression and gene mutation in a large series of common human carcinomas. Human Pathol 1996; 27 (10): 1050–5.

4. Levesque AA, Eastman A. p53-based cancer therapies: is defective p53 the Achilles heel of the tumor? Carcinogenesis 2007; 28 (1): 13–20.

5. Kasagi N, et al. Apoptotic cell death in human gastric carcinoma: analysis by terminnal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP- biotin nick end labelling. J Cancer Res 1994; 85: 939–45.

6. García I, et al. Clinical Significance of the Epidermal Growth Factor Receptor and HER2 Receptor in Resectable Gastric Cancer. Ann Surg Oncol 2003; 10: 234–41.

7. Shankaran H, et al. Quantifying the effects of EGFR– HER2 co-expression on HER activation and trafficking. Biochem Biophys Res Communications 2008; 371 (2): 220–4.

8. Überall I, et al. The status and role of ErbB receptors in human cancer. Exp Mol Pathol 2008; 84 (2): 79–89.

9. Seruca R, et al. p53 alterations in gastric carcinoma: A study of 56 primary tumors and 204 nodal metastases. Cancer Gen Cytogen 1994; 75 (1): 45–50.

10. Stoicov C, et al. Molecular biology of gastric cancer: Helicobacter infection and gastric adenocarcinoma: bacterial and host factors responsible for altered growth signaling. Gene 2004; 341: 1–17.

11. Tanner M, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIα gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005; 16 (3): 273–8.

12. Funato T, et al. Increased Sensitivity to Cisplatin in Gastric Cancer by Antisense Inhibition of the HER-2/neu (c-erbB-2) Gene Chemother 2001; 47: 297–303.

13. Tanner M, et al. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 2000; 157: 1467–72.

Brisbane, Singapore, Toronto: Wiley–Liss, 1997. 285 p.

1. Laurén P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal-type carcinoma an attempt at a histo-clinical classification. Acta Pathol Microbiol Scand 1965; 64: 31–49.

2. Никулин МП, и др. Наследственный рак желудка: молекулярно-генетические и клинические аспекты. Современ онкол 2006; 8 (2): 48–55.

3. Lee KE, et al. Prognostic Significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in Gastric Cancer. Japan J Clin Oncol 2003; 33: 173–9.

4. Лакин ГФ. Биометрия: учебное пособие для биол спец вузов. Москва: Высшая школа, 1990. 352 с.