ФОТОАКТИВНІ КОН’ЮГАТИ ДЛЯ СПРЯМОВАНОЇ ПРОТИПУХЛИННОЇ ФОТОДИНАМІЧНОЇ ТЕРАПІЇ

Останніми роками в онкологічну практику увійшов малотравматичний метод лікування при злоякісних новоутвореннях — фотодинамічна терапія (ФДТ). Метод полягає у введенні в організм з пухлиною фотосенсибілізаторів, які можуть накопичуватися в злоякісних клітинах, робити їх світлочутливими, зумовлюючи цим самим і вибіркове руйнування малігнізованих клітин при наступному опроміненні. Запропонований спосіб терапії дозволяє очікувати значно більшої вибірковості пошкодження пухлин порівняно з радіота хіміотерапією; це пояснюється, перш за все, тим, що фотосенсибілізатор здатний більше накопичуватися та довше затримуватися в пухлині порівняно з нормальними тканинами. Однак, значною мірою накопичення багатьох із таких сполук виявляли і в нормальних тканинах. Відсутність високоефективної селективності в накопиченні фотосенсибілізаторів пухлинами спонукала дослідників до пошуку нових підходіву ФДТ, які б забезпечували якщо не селективне накопичення пухлинами фотосенсибілізуючиха гентів, то ефективну їх «досилку» до пухлинних тканин.

Поштовхом до розробок таких підходів стала

в 1980 р. робота D. Mew і співавторів [1]. Було показано, що гематопорфірин у вигляді кон’югату зі специфічними до поверхневих антигенів пухлинних клітин антитілами накопичується в пухлинах у значно вищій мірі порівняно з вихідним фотосенсибілізатором. Ця робота в подальшому відкрила шлях, власне, до розвитку так званої цілеспрямованої (таргетної) фотодинамічної терапії, де в якості провідників до відповідних мішеней можуть використовуватися не тільки антитіла, але й цитокіни, фактори росту, їх рецептори тощо.

Останніми роками активно проводять дослідження, спрямовані саме на вивчення різноманітних аспектів цілеспрямованої ФДТ. Ці дослідження сконцентровані не тільки на пошуках нових класів фотосенсибілізуючих агентів, мішенями яких виступали б пухлинні клітини, але й на розробці методів цілеспрямованої доставки фотосенсибілізаторів власне до пухлин. Одним із перспективних способів такої

цілеспрямованої доставки до пухлин є селективна

«досилка» фотосенсибілізуючих агентів у вигляді їх кон’югатів з біологічно активними речовинами, як то: ростові фактори, цитокіни, «homing» — пептиди, поліклональні та моноклональні антитіла (МкАТ) до специфічних поверхневих антигенних детермінант пухлинних маркерів (карциноембріональний антиген тощо), до рецепторів ростових факторів, білків адгезії і т. п.

Кон’югати фотосенсибілізаторів з антитілами. Гематопорфірин (Гп) – найпоширеніший фотосенсибілізатор, який знайшов широке застосування у фотодинамічній терапії пухлин. Був одним із перших фотосенсибілізаторів, який кон’югували з біологічно активними речовинами [1]. Максимум поглинання знаходиться в межах 620–640 нм. При поглинанні хвилі даної довжини цей сенсибілізатор спроможний викликати біологічні ефекти в тканині пухлини на глибині 5 мм. Гп має здатність накопичуватися лише на поверхні клітини та у екстроцелюлярному матриксі. Але щоб покращити ефективність фотодинамічної терапії виникає необхідність у застосуванні препаратів, що забезпечують інтерналізацію Гп через клітинну мембрану. Цього ефекту можна досягти в разі використання кон’югованих МкАТ до пухлинних антигенів з означеними фотосенсибілізаторами. Такзцієюметоюбули синтезовані фотоімунокон’югати з МкАТ I-cMabU36, I-mMab425 та I-mMabE48. Було виявлено, що в синтезованих фотоімунокон’югатах Гп зберігає свої фізикохімічні властивості, максимум поглинання та здатність до утворення синглетного кисню. Цейжесинтезований фотоімунокон’югат виявився стабільним в сироватці крові, мав оптимальну імунореактивність навіть в тих випадках, коли співвідношення фотосенсибілізатора та МкАТ складало лише <3. Напроти, кон’югати з більш високим молекулярним співвідношенням МкАТ — фотосенсибілізатор частково втрачали розчинністьвводно-сольовихсередовищах. Удослідах in vitro відзначали інтерналізацію клітинами лінії А431 Гп, кон’югованого з антитілами І-МаbU36 та І-Маb425, та її відсутність у випадку використан-

ня кон’югату з МкАТ I-mMabE48. Інтерналізація відбувалась шляхом ендоцитозу після з’єднання фотоімунокон’югату з відповідним рецептором. В результаті руйнації ензимами лізосом утвореного молекулярного комплексу фотоімунокон’югату з рецепторами вивільнений фотосенсибілізатор розподілявся в зоні мітохондрій, а вже після опромінювання активований фотосенсибілізатор був здатний утворювати вільні радикали кисню, які і пошкоджували мембрану мітохондрій [2]. У результаті пошкодження мітохондріальних мембран у цитоплазму потрапляє цитохром С, який сприяє формуванню апоптосом з подальшою активацією проапоптозного каспазного каскаду. Таким чином, клітина комітується на апоптоз, що виявляється більш ефективним у загибелі пухлинної клітини, ніж пошкодження плазмалеми. Крім того, ці кон’югати виявилися токсичними для клітин А431,утой час як вільний Гп мав значно меншу фототоксичність. Відсутність інтерналізації кон’югованого Гп з МкАТ I-mMabE48 пояснюється відсутністю на поверхні клітин антигену, відповідного до МкАТ I-MabE48 [3]. Такимчином, застосуваннякон’югованогоз МкАТГп значно збільшує ефективність ФДТ.

Слід відзначити, що на даний момент активно вивчається можливість застосування кон’югатів МкАТ з фотосенсибілізатором бензопорфірином (Бпф) [4]. Так в експериментах на моделі перещепленої сингенним мишам сквамозної карциноми людини (лінія А549), де використовувалися імунокон’югати на основі МкАТ 5Е8 специфічних до антигену на клітинах А549, а також неспецифічних до цього антигену МкАТ Т48 з міченим ізотопом вуглецю С14 Бпф, було показано чітку відмінність у накопиченні кон’югатів та вільного Бпф пухлинними тканинами. Вищий рівень накопичення сенсибілізатора, кон’югованого з МкАТ специфічними до антигену цієї пухлини, відзначали у тканині карциноми порівняно з вільним Бпф [5].

У цій же роботі в досліді на хом’яках з цією ж карциномою порівнювали ефективність ФДТ із застосуванням Бпф та фотофрину, похідного Гп. Тварини, які отримували вільний Бпф, демонстрували рівень накопичення фотосенсибілізатора в пухлині по відношенню до нормальної тканини в співвідношенні — 2 : 1, у той час як тварини, які отримували фотоімунокон’югат цього ж сенсибілізатора з МкАТ до рецептора EGFR, демонстрували значно більший рівень накопичення фотосенсибілізатора по відношенню до нормальної тканини, а саме — 26 : 1 (р < 0,005). При аналізі рівня виживаності тварин після ФДТ відзначали таку картину: при застосуванні фотофрину місячна виживаність складала 27%, вільного Бпф — 67% (р = 0,03), а Бпф, кон’югованого з МкАТ до рецептора EGFR — 80%. Отже, Бпф виявився більш ефективним, ніж фотофрин, а його селективність в накопиченні в пухлині може бути збільшена шляхом його кон’югації з МкАТ до рецептора EGFR [5].

Хлорин е-6 відноситься до фотосенсибілізаторів нового покоління. Порівняно з порфіринами хлоринові фотосенсибілізатори характеризуються рядом переваг: вони мають високі значення квантового виходу синглетного кисню (0,4–0,8), максимум їх поглинання знаходиться в діапазоні 650–800 нм, завдяки трьом кислотним залишкам в мають непогану розчинність у воді. Ось чому при застосуванні хлоринів можна досягти доволі значної глибини проникнення опромінення в пухлинну тканину — біологічні ефекти можуть здійснюватися на глибині 10–13 мм [6]. Застосування хлорину е-6, як і інших фотосенсибілізаторів хлоринового ряду (наприклад, бактеріохлорину) в якості фотосенсибілізатора при ФДТ пухлинних процесів є досить ефективним [7, 8]. Так, хлорин е-6 знайшов широке застосування фотодинамічній таргетній терапії в метастазах колоректального раку в печінці [9–11]. Відомо, що колоректальний рак метастазує в печінку з великою частотою.

Виникла проблема, пов’язана з високим накопиченням фотосенсибілізаторів не тільки в пухлинній тканині печінки. Більшість фотосенсибілізаторів, у тому числі і хлорини, виявляють доволі високий рівень акумуляції і в нормальній тканині печінки [12–15]. В зв’язку з цією обставиною стає актуальним використання цілеспрямованої ФДТ із застосуванням хлоринуе-6, кон’югованогозМкАТ,специфічними доантигенів пухлинних клітин. Було показано, що використання хлоринуе-6,кон’югованогозМкАТMab17.1А,якізв’язуються зантигенамиколоректальногораку EpCAM, дозволяєв деякій мірі вирішити проблему селективного накопичення фотосенсибілізатора саме у пухлинній тканині печінки і таким чином мінімізувати побічні ефекти та збільшити ефективність власне ФДТ [16]. До того ж при синтезіданого фотоімунокон’югату не відбувається погіршення фізико-хімічних властивостей хлоринуе-6, зокрема його спектральних характеристик. У дослідах на щурах з перещепленими в печінку клітинами пухлини НТ 29 (аденокарциноми людини) була виявлена значна ефективність імунокон’югату хлорин е-6 — антитіло 17.1А. Крім того, методом флюоресценції було показано, що даний фотоімунокон’югат має значно більшу селективність у накопиченні в пухлинній тканині порівняно із вихідним фотосенсибілізатором хлорином е-6. Більше того, застосування вільного вихідного фотосенсибілізатора призводить до системної токсичності та загибелі піддослідних тварин за рахунок масштабних уражень нормальних тканин. Однак при застосуванні фотоімунокон’югату ця системна токсичність виявляється мінімізованою. Поряд з цим визначалось суттєве скорочення ваги пухлини, середній показник виживання збільшився з 62,5 до 102 днів. Таким чином, в експериментах було показано ефективність використання цілеспрямованої ФДТ завдяки використанню хлорину е-6, кон’югованого з МкАТ [9, 10]. Крім того, кон’югати хлорину з МкАТ крім терапевтичних цілей можна використовувати і в діагностиці злоякісних пухлин та передпухлинних хвороб з метою окреслення контурів пухлин для подаль-

шого хірургічного втручання або проведення оцінки ефективності застосування лікувальних заходів.

Останнім часом при створенні фотосенсибілі- зуючих кон’югованих сполук увагу дослідників привертають фталоціанінові сполуки. Для фталоціанінів притаманний максимум поглинання в межах 670–700 нм. Це дозволяє після опромінювання ініціювати біологічні ефекти в тканині на глибині 10 мм [17]. Взагалі фталоціаніни є гідрофобними сполуками. Крім того, введення в молекулу цих фотосенсибілізаторів сульфогруп призводить до набуття фотосенсибілізаторами властивостей гідрофільної сполуки з покращенням їх розчинності, а відтак і полегшенням доставки до пухлини [18]. Найбільш вивченими являються саме сульфіровані фталоціаніни, які можуть відрізнятися центральним атомом металу та кількістю сульфогруп. Відомо, що при збільшенні кількості сульфогруп збільшується і розчинність цих фотосенсибілізаторів [19]. Тетрасульфонат алюміній(ІІІ)-фталоціанін, саме і являється таким модифікованим гідрофільним фотосенсибілізатором. Але на відміну від гідрофобних фотосенсибілізаторів цієї групи, гідрофільний тетрасульфонат алюміній(ІІІ)-фталоціанін не здатний проникати через мембрану клітин, а відтак не досягає внутрішньоклітинних структур, що значно зменшує ефективність ФДТ [19]. У зв’язку з цим виникає доцільність у кон’югуванні цього фотосенсибілізатора з МкАТ, які можуть покращити інтерналізацію його до клітини. В досліді на клітинах сквамозної карциноми А431 із застосуванням тетрасульфонату алюміній(ІІІ)-фталоціаніну, кон’югованого через тетрагліциновий мостик з химерними МкАТсMabU36 та МкАТ mMabЕ48 та mMabЕ425, відзначали збереження кон’югованими антитілами притаманних їм властивостей та стабільність у сироватці крові. Розчинність цих сполук, як виявилося, порівняно з вихідним сенсибілізатором дещо погіршилася. Було показано, що найбільшу фототоксичність до клітин проявляє тетрасульфонат алюміній(ІІІ)-фталоціанін, кон’югований з МкАТ mMabЕ425. З’ясували, що він у 7500 разів токсичніший порівняно з вихідним фотосенсибілізатором. Кон’югати з химерними МкАТ сMabU36 та МкАТ mMabЕ48, на відміну від кон’югатів з mMabЕ425, засвоювалися пухлинними клітинами гірше через відсутність специфічних для них антигенів [20].

Кон’югати фотосенсибілізаторів з іншими біологічно активними речовинами. Відомо, що білки сироватки крові відіграють велику роль у транспортуванні різноманітних речовин, у тому числі і фармацевтичних препаратів. Білки сироватки крові (власне альбумін та ліпопротеїди) також відіграють надзвичайно велику роль у транспортуванні молекул фотосенсибілізатора [21].

Альбумін володіє унікальною властивістю зворотно зв’язуватися з великою кількістю ендогенних або екзогенних лігандів. Здатність зв’язуватися з таким широким спектром лігандів пояснюється тим,

що цей білок має доволі гнучку просторову структуру, яка зазнає перебудов у залежності від структури ліганда, з яким він зв’язується [22]. Саме ці властивості альбуміну спонукали дослідників до використання його в цілеспрямованій ФДТ. Цінність застосування альбуміну в цілеспрямованій ФДТ пояснюється ще й тим, що цей білок являється важливим джерелом амінокислот для пухлинних клітин. Власне завдяки високій інтенсивності метаболізму альбуміну в пухлині і відбувається своєрідне накопичення його в екстрацелюлярномуматриксі пухлинної тканини. Наприклад, в експериментах на мишах з перещепленою пухлиною — карциномою людини Т380 використовували кон’югат альбуміну з фталоціаніном. Показано, що регресія пухлин відзначалася вже при дозах препарату 0,5 та 0,2 мМ/ кг при проведенні ФДТ через 24 год після введення кон’югату [21]. До речі слід сказати, що кон’югат отримували з альбуміну бичачої сироватки.

В іншому експерименті досліджували альбумін, кон’югований з хлорином е-6 [23–25]. У дослідах іn vitro на макрофагоподібних клітинах лінії J774 та раку яєчника людини методом флюоресценції виявили, що кон’югат краще накопичується макрофагоподібними клітинами J774 порівняно з клітинами лінії OVCAR-5. Пояснюється це тим, що у макрофагоподібних клітин краще виражені скавенджер-рецептори. Відповідно і ефективність фотодинамічної дії була кращою на цих клітинах [21]. Ймовірно, після сполучення кон’югату з скавенджер-рецепторами, він шляхом ендоцитозу потрапляє до клітини, перш за все до лізосом, де під дією ензимів вивільнюється хлорин е-6. Далі цей фотосенсибілізатор може перерозподілятися по клітині, потрапляючи до так званих критичних субклітинних структур, наприклад мітохондрій. У випадку пошкодження мембрани мітохондрій клітина швидко комітується на шлях апоптозу, іншими словами, запускається проапоптозний каспазний каскад. Таким чином, чим більше виражені на поверхні клітини скавенджер-рецептори, тим краще сполучається кон’югат з клітиною, а найголовніше, він краще інтерналізується в клітину шляхом ендоцитозу. Як результат, підвищується ефективність терапії із застосуванням кон’югату фотосенсибілізаторальбумін бичачої сироватки.

Деякі автори стверджують, що для ефективності цілеспрямованої ФТД недостатньо тільки селективності в накопиченні фотосенсибілізаторів тканинами пухлин. Виявляється, що для підвищення ефективності ФДТ необхідно не тільки забезпечити досилку фотосенсибілізатора до цитоплазми клітини, а й забезпечити його розподіл по критичним зонам клітини [25].

Так, на клітинах гепатоми людини лінії PLC/ PRF/ 5 продемонстрували збільшення фоточутливості клітин у результаті застосування кон’югованого інсуліну з хлорином е-6. Дія цього кон’югату спрямовувалася, перш за все, на рецептор інсуліну ЕС50. У досліді порівнювали ефективність застосування вільного хлорину е-6

та кон’югованого з інсуліном [26]. Кон’югат виявився більш ефективним, ніж вільний хлорин е-6. Крім того, актуальним є вивчення доставки фотосенсибілізаторів до ядра пухлинної клітини. На даний момент проводяться спроби для здійснення інтерналізації фотосенсибілізатора в клітину з подальшою його локалізацією в ядрі. Так був отриманий кон’югат на основі бичачого альбуміну (для збільшення аплікації молекул фотосенсибілізатора на молекулі ліганду, здатного до інтерналізації через клітинну мембрану), інсуліну (інтерналізуючий ліганд) з фотосенсибілізатором хлорином е-6. Встановлено, що інтерналізація цього кон’югату відбувається шляхом ендоцитозу [27]. Локалізацію фотосенсибілізатора в клітині та спроможність його продукувати синглетний кисень встановлювали за допомогою 2′,7′-дихлорфлюорисцин діацетату, який здатний перетворюватися на флюоресцентну похідну 2′,7′-дихлорфлюорисцина при реакції з активними різновидами кисню. Після 4 год інкубації з кон’югатом альбумін-інсулін-хлорин е-6 з подальшим опромінюванням відзначали збільшення флюоресценції якраз у зоні клітинного ядра, що вказує на продукцію активного кисню. Також виявили, що фотодинамічний ефект відзначали як при низьких концентраціях рецептора ЕС50s, що було достатнім для вивільнення хлорину е-6, так і при низьких дозах опромінювання [26].

Відомо, що переважна більшість пухлинних клітин продукує на своїй поверхні рецептор епідермального фактора росту (EGFR) у значно вищій концентрації порівняно з нормальними клітинами. EGFR контролює багато клітинних функцій: клітинний поділ, диференціацію, виживанняклітин, їхрухливість. Усі ці функції реалізуються через відповідні шляхи сигнального каскаду. Зазначають, що фактично >30% клітин раку яєчника мають підвищений рівень експресії EGFR [28–32]. У багатьох випадках підвищений рівень концентрації EGFR корелює з несприятливим прогнозом. Тобто підвищений рівень експресії EGFR являється своєрідним маркером пухлини, який можна використовувати у цілеспрямованій терапії. Епідермальний фактор росту (EGF) являється лігандом до цього рецептора, а відтак він може транспортувати фотосенсибілізатор в зону підвищеної концентрації рецептора, тобто безпосередньо до тканини пухлини. Таким чином, виникає доцільність у створенні кон’югатів на основі цитокіну EGF та фотосенсибілізатора. EGF — невеликий поліпептид масою 6 кДа. EGF, зв’язавшись з рецептором EGFR на поверхні клітини, активує кіназний каскад сигнальної трансдукції, відповідальний за проліферативну активність епідермальних та епітеліальних клітин. Після сполучення з EGF рецептор виявляє тирозинкіназну активність. Крім того, EGF виконує важливу функцію у неоангіогенезі [33]. В експериментах порівнювали цитостатичну ефективність вільних фотосенсибілізаторів дисульфонату алюміній-фталоціаніну та дисульфонату кобальт-

фталоціаніну та їх кон’югатів з EGF. На клітинах карциноми молочної залози лінії MCF-7 було показано, що кон’югат дисульфонату алюміній-фталоціаніну проявляв значно більшу цитостатичну активність, ніж вільний алюміній-фталоціанін. Кон’югат на основі дисульфонату фталоціаніну кобальту виявився в 100 разів ефективніший по цитотоксичній дії, ніж сам вільний фотосенсибілізатор. Слід відзначити, що і в дослідах in vivo на моделі з меланомою В16, де використовували кон’юговані фотосенсибілізатори, виявили більш ефективну дію кон’югатів у пригніченні росту пухлини порівняно з вільними фотосенсибілізаторами [34].

Проводили експерименти з використанням більш складного за структурою кон’югату, що був синтезований на основі хлорину, а саме комплексу хлорине-6-олово, який в свою чергу з’єднувався з EGF через декстрин, полівініловий спирт або альбумін [35, 36]. Виявили, що хлорин е-6-олово, кон’югований з EGF через декстран, зв’язувався в 100 разів більш споріднено з рецептором, ніж його природний ліганд — некон’югований EGF. Кон’югат на основі проміжного зв’язку через альбумін теж мав високу спорідненість до рецептора, однак гірше конкурував з вільним EGF. У той же час кон’югат на основі проміжного зв’язку через полівініловий спирт не зв’язувався з рецептором взагалі. Також вивчали фотоцитотоксичність цих кон’югатів на клітинних лініях MDA-MB-468 та А431. Ці лінії клітин характеризуються високим рівнем експресії EGFR. Значний рівень фотоцитотоксичності при дозі опромінювання 27 кДж/м2 виявився при застосуванні сенсибілізатора, кон’югованого з EGF через альбуміновий місток [36]. Незважаючи на відсутність спорідненості до рецептора, найвищий рівень фотоцитотоксичності продемонстрував кон’югат із містком з полівінілового спирту. Однак він виявився значно токсичнішим порівняно з кон’югатом із застосуванням декстрану. Проте фототоксичність кон’югату з декстраном дорівнювала фототоксичності простого кон’югату хлорин е-6- EGF. Можливо, в даному випадку більше значення мають транспортні властивості полівінілового спирту, ніж здатність ліганду зв’язуватися з рецептором. Пояснюючи менший рівень фототоксичності кон’югату з альбуміном порівняно з кон’югатом із полівініловим спиртом, припускають, що в даному випадку відіграє вирішальну роль саме ступінь спорідненості цього кон’югату. Фототоксичність була б значно кращою, якщо б цей кон’югат краще конкурував з вільним EGF за рецептори [35, 36].

Цілеспрямована антиангіогенна фотодинамічна терапія. Ангіогенез — процес, який є вкрай необхідним для пухлинного росту [37–39], може слугувати надзвичайно важливою мішенню для ФДТ пухлин. При використанні такого варіанту ФДТ, де її дія буде спрямована на блокаду тих чи інших ланок неангіоенезу, застосовують, як правило, МкАТ до рецепторів фактора росту ендотеліоцитів або безпосередньо до самого ліганду цих рецепторів — фактора VEGF. При цьому з МкАТ хімічно зв’язується

фотосенсибілізатор, який власне і викликає фотохімічну реакцію [40].

Слід сказати, що робіт, проведених у галузі цілеспрямованої ФДТ, скерованої безпосередньо на блокаду процесів ангіогенезу пухлин, небагато, хоча стратегія боротьби зі злоякісними пухлинами, яка базується на антиангіогенній терапії, має доволі широку історію. Це порівняно новий альтернативний напрямок антиангіогенної терапії пухлин. На відміну відонкології, цей метод лікування в офтальмологічній практиці застосовується протягом порівняно тривалого проміжку часу. Слід зауважити, що шляхи цілеспрямованої антиангіогенної ФДТ споріднені як при лікуванні офтальмологічних захворювань, асоційованих з патологічним неоангіогенезом, так і при блокуванні неоваскуляризації злоякісних пухлин. Взагалі вирізняють два напрямки блокування процесів ангіогенезу при цілеспрямованій ФДТ. В одному випадку дія імунокон’югатів скеровується на ліганди, які здатні стимулювати ангіогенез (фактори ангіогенезу), в другому — на рецептори ендотеліоцитів, які відповідальні за активацію кіназного каскаду, що обумовлює їх проліферацію. При скеровуванні дії імунокон’югату на ліганд досягається накопичення кон’югованих антитіл в екстрацелюлярному матриксі і фотодинамічна дія буде спрямована перш за все на плазмалему ендотеліоцитів. У цьому випадку ефективність антиангіогенної ФДТ буде дещо знижена. При дії фотоімунокон’югату на рецептори ендотеліоцитів з’являється можливість інтерналізації фотосенсибілізатора всередину клітини. В цьому випадку ендотеліальна клітина з більшою вірогідністю буде підлягати апоптозу, а відтак ефективність терапії буде вищою. Треба зазначити, що в якості носіїв фотосенсибілізатора для цілеспрямованої антиангіогенної ФДТ найчастіше використовують антитіла та ліпосоми.

На даний момент отримано ряд МкАТ, специфічних до фактора VEGF або до його рецепторів. Деякі з них у вигляді кон’югатів з фотосенсибілізаторами добре зарекомендували себе в тій же офтальмології [42]. Є відомості щодо застосування ліпосом, кон’югованих з фотосенсибілізатором, в цілеспрямованій антиангіогенній ФДТ [42, 43]. Було виявлено, що після введення подібних препаратів через 15 хв вони спроможні пошкоджувати ендотелій. Досліджено, що ліпосоми, навантажені Бпф, доносяться до тканини пухлини пасивно. Слід сказати, що ліпосоми застосовуються для транспортування гідрофобних фотосенсибілізаторів, наприклад Бпф. При використанні цих структур, вірогідно, має значення фактор тропності фотосенсибілізатора до пухлини, чим можна пояснити селективне його накопичення в пухлині при транспортуванні ліпосомами. Однак є джерела, які стверджують, що подібні ліпосоми мають мінімальний клінічний ефект при застосуванні у ФДТ, хоча вони значно підвищують рівень накопичення фотосенсибілізатора в тканині пухлини вже через 3 год. Пояснюють це тим, що

після лазерного опромінювання синглетний кисень, продукований фотосенсибілізатором, не пошкоджував клітини, оскільки життя активного кисню нетривале. Радикалу кисню просто не вистачає часу для проходження відстані між внутрішньою частиною ліпосоми та клітиною. При цьому кон’югати ліпосом та фотосенсибілізаторів концентруються в екстрацелюлярному матриксі. При розгляданні цього досліду можна якраз пересвідчитися в тому, що при накопиченні препарату в екстрацелюлярному матриксі (внаслідок зв’язування з лігандом, або застосування ліпосом) ефективність терапії погіршується, що власне і зазначалося вище. Взагалі локалізація фотосенсибілізатора є важливим ключем, який і визначає ефективність ФДТ.

Крім того, виникає необхідність більш точної досилки фотосенсибілізатора безпосередньо до пухлинної клітини чи до ендотеліоциту. Так, для орієнтації цих кон’югатів на ендотеліоцити використовують пентамерний пептид Ala-Pro-Arg-Pro- Gly (APRPG). Ліпосоми, кон’юговані із вказаним пептидом, можна вибірково застосовувати саме в антиангіогенній терапії. Шляхом гістохімічного аналізу виявили, що накопичення таких кон’югатів у пухлині не відбувалося, натомість він виражено накопичувався в ендотелію [42]. Слід відзначити, що подібні ліпосомальні кон’югати для ФДТ можуть бути модифіковані з метою збільшення їх селективності. Модифікують їх також з метою збільшення рівня накопичення або в тканині пухлини, або в ендотелію. Більше того, виявили, що модифіковані ліпосомальні фотокон’югати мають більшу селективність порівняно з вільним фотосенсибілізатором [42, 43].

Досліди на мишах з перещепленою карциномою лінії Colоn 26 NL-17 та саркомою Meth-A показали, що ліпосоми, кон’юговані за схемою ліпосомабензопорфірин-APRPG-поліетіленгліколь, мають значно кращу селективність у накопиченні порівняно з ліпосомальним кон’югатом APRPG- поліетіленгліколь-ліпосома-бензопорфірин та кон’югатом поліетіленгліколь-ліпосомабензопорфірин, який власне не здатен орієнтуватися до клітин. Саме тому в цьому досліді відзначали гальмування росту пухлини, вважаючи, що ФДТ спрямовувалася в цьому випадку саме на ушкодження ендотеліальних клітин і виявилася більш ефективною, ніж цілеспрямована ФДТ на пухлинні клітини. Опромінювання проводили через 3 год, оскільки вважали, що за цей час кон’югати краще зв’яжуться з ендотеліоцитами, хоча деякі автори вказують на те, що кон’югат розподіляється по ендотелію вже через 15 хв [42]. Крім того, з’ясували, що через 3 год після ФДТ утворювалася закупорка судин, порушення в системі гемостазу [42, 43].

Суттєві результати одержані при блокуванні патологічного ангіогенезу в сітківці ока кон’югованим через полівініловий спирт та пептид ATWLPPR вертепорфіном — похідним Бпф. Цей кон’югат проде-

монстрував високу ступінь спорідненості до VEGFR2— рецептора фактора росту судинного ендотелію(VEGF). Співвідношення в кон’югаті вертепорфірину та пептиду складало 28 : 1, при цьому зберігалися всі фізикохімічні властивості сенсибілізатора. На гістологічних зрізах сітківки після ФДТ уже через годину виявили некротичні процеси в ендотелію [44]. Результати, отримані в офтальмології, засвідчують непоганий ефект в пошкодженні васкуляної системи, що дає привід для застосування подібного кон’югату при лікуванні злоякісних пухлин.

Так в досліді на моделі ангіогенезу ока кроля, де використовували кон’югований з індоціаніном фрагмент МкАТscFvL19, специфічних до фібронектину— одного з чільних маркерів судинної сітки, також відзначали блокаду процесів неоангіогенезу. Але, на жаль, цей кон’югат виявив суттєві недоліки, пов’язані з низьким рівнем продукції синглетного кисню фотосенсибілізатором індоціаніном [45].

Якщо говорити про дослідження імунокон’югатів, орієнтованих на ліганд — VEGF, то треба відзначити, що їх зовсім немає. Останнім часом з’явився лише один препарат на основі кон’югованого того ж вертепорфіну з візудіном — антитілами до фактора VEGF [46]. Відомо, що при застосуванні цих нативних антитіл відзначали значну затримку росту пухлин, а в деяких випадках ріст взагалі припинявся. Так, при дослідженні препарату кон’югованого з візудіном (антитілами до фактора VEGF) вертепорфіну з’ясували, що спектр емісії кон’югованого фотосенсибілізатора не відрізнявся від спектра емісії вільного вертепорфіна. Також досліди проводили на культурі ендотеліоцитів. Культуру ендотеліоцитів опромінювали лазером, після чого визначали виживаність клітин через 1 та 24 год. З’ясували, що через годину після опромінювання виживаність ендотеліоцитів знижувалася до 6%, (р < 0,0001), через 24 год — до 4% (р < 0,0001). При відсутності опромінювання виживаність складала 40%. При визначенні цитотоксичності з’ясували, що кон’югований вертепорфін більш токсичний, ніж вільний, хоча між ними не було статистично достовірної різниці. Таким чином, кон’югований з візудіном вертепорфін потенційно може бути доволі ефективним препаратом у фотодинамічній цілеспрямованій антиангіогенній терапії.

Можна припустити, що ефективність кон’югованих з антитілами препаратів, скерованих на блокування активності VEGF (на зразок візудіна) може бути пояснена не тільки фотодинамічною дією, але й нейтралізацією дії пулу VEGF в екстрацелюлярному матриксі, внаслідок чого фактор не може потрапляти до рецепторів VEGFR, а відтак не може стимулюватися проліферативний сигнал ендотеліоцитів. Це певною мірою може компенсувати неспроможність інтерналізації фотосенсибілізатора до клітини, де фотодинамічна дія була би значно ефективнішою. Крім того, при орієнтуванні фотоімунокон’югату на рецептори VEGFR можна досягти подібного

синергічного ефекту, оскільки внаслідок зв’язування фотоімунокон’югату з рецептором може блокуватися функція цього рецептора, врезультаті чого відбувається гальмування клітинного поділу ендотеліоцитів.

Отже, цілеспрямована антиангіогенна ФДТ — порівняно молодий напрямок в онкології. Завдяки їй досягається високоефективна селективність у накопиченні фотосенсибілізатора саме у васкулярній мережі пухлин, зарахунок чого мінімізуються побічні ефекти та підвищується ефективність терапії.

ЛІТЕРАТуРА

1. Mew D, Wat CK, Towers GH, Levy JC. Photoimmunotherapy treatment of animal tumors with tumor — specific monoclonal antibody — hematoporphyrin conjugates. J Jmmunol 1983; 130: 1473–7.

2. Engbrecht BW, Menon C, Kachur AV, Fraker DL. Photofrin — mediated photodynamic therapy induces vascular occlusion and apoptosis in a human sarcoma xenograft model. Cancer Res 1999; 59 (17): 4334–42.

3. Vrounraets MB, Visser GV, Loup C, et al. Targeting of a hydrophilic photosensitizer by use of internalizing monoclonal antibodies: A new possibility for use in photodynamic therapy. Int J Cancer 2000; 88 (1): 108–14.

4. Jiang FN, Richter AM, Jain AK, et al. Biodistribution of a benzoporphyrin derivative monoclonal antibody conjugate in A549 — tumor bearing nude mice. Biotechnol Ther 1993; 4 (1–2): 43–61.

5. Hemming AW, Davis NL, Dubois B, et al. Photodynamic therapy of squamous cell carcinoma. An evalution of a new photosensitizing agent benzoporphyrin derivative and new photoimmunoconjugate. Surgical Oncol 1993; 2 (Issue 3): 187–96.

6. Миронов АФ. Фотодинамическая терапия рака — новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных заболеваний. Соросовский образовательный журн 1996; 8: 32–40.

7. Van Hillegersberg R, Pickering JW, Aalders M, Beek JF. Optical properties of rat liver and tumor at 633 nm and 1064 nm: photofrin enhances scattering. Lasers Surg Med 1993; 13 (1): 31–9.

8. Rovers JP, Schuitmaker JJ, Vahrmeijer AL, et al. Interstitial photodynamic therapy with the second-generation photosensitizer bacteriochlorin a in a rat model for liver metastases. Br J Cancer 1998; 77 (12): 2098–103.

9. Hamblin MR, Del Gevernatore M, Rizvi I, Hasan T. Biodistribution of charged 17.1A photoimmunoconjugates in a murine model of hepatic metastasis of colorectal cancer. Br J Cancer 2000; 83 (11): 1544–51.

10. Del Governatore M, Hamblin MR, Christopher R Shea, et al. Experimental photoimmunotherapy of hepatic metastases of colorectal cancer with a 17.1A chlorin e6 immunoconjugate. Cancer Res 2000; 60: 4200–5.

11. Van Hillegersberg R, Marijnissen JP, Kort WJ, et al. Interstitial photodynamic therapy in a rat liver metastasis model. Br J Cancer 1992; 66 (6): 1005–14.

12. Woodburn KW, Stylli S, Hill JS, et al. Evaluation of tumour and tissue distribution of porphyrins for use in photodynamic therapy. Br J Cancer 1992; 65 (3): 321–8.

13. Boyle RW, Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. Photochem Photobiol 1996; 64 (3): 469–85.

14. Dougherty TJ, Gomer CJ, Henderson BW, et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst 1998; 90 (12): 889–905.

15. Van Hillegersberg R, Van den Berg JW, Kort WJ, et al.

    Selective accumulation of endogenously produced porphyrins

    in a liver metastasis model in rats. Gastroenterol 1992; 103 (12): 647–51.

16. Governatore MD, Hamblin MR, Shea CR, et al. Experimental Photoimmunotherapy of Hepatic Metastases of Colorectal Cancer with a 17.1A Chlorin e-6 Immunoconjugate. Cancer Research 2002; 60 (8): 4200–5.

17. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers. Photochem Photobiol 1991; 53 (6): 859–70.

18. Миронов АФ. Фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и родственных соединений для фотодинамической терапии. Итоги науки и техники 1990; (3): 5–63.

19. Peng Q, Moan J. Correlation of distribution of sulfonated aluminium with their photodynamic effect in tumor and skin of mice bearing CaD2 mammary carcinoma. Br J Cancer 1995; 72 (3): 565–74.

20. Vrounraets MB, Visser GV, Stigter M, et al. Targeting of aluminium (III) phthalocyanine tetrasulfonate by use of internalizing monoclonal antibodies: improved efficacy in photodynamic therapy. Cancer Res 2001; 61 (5): 1970–5.

21. Wesley M, Sharman WM, Johan E, et al. Aller. Targeted photodynamic therapy via receptor mediated delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews 2004; 56 (Issue 1): 53–76.

22. Gantchev TG, Ouellet R, van Lier JE. Binding interactions and conformational changes induced by sulfonated aluminum phthalocyanines in human serum albumin. Arch Biochem Biophys 1999; 366 (1): 21–30.

23. Hamblin MR, Miller JL, Ortel B. Scavenger-receptor targeted photodynamic therapy. Photochem Photobiol 2000; 72 (4): 533–40.

24. Hamblin MR, Huzaira M, O’Donnell DA. Scavenger receptor-targeted photodynamic therapy of murine tumors in vivo. 13th International Congress on Photobiology, San Francisco. CA 2000; (Abstract): 173.

25. Rosenkranz AA, Jans DA, Sobolev AS. Targeted intracellular delivery of photosensitizers to enhance photodynamic efficiency. Immunol Cell Biol 2000; 78 (4): 452–64.

26. Norbyry CJ, Zhivotovsky B. DNA damage-induced apoptosis. Oncogene 2004; 23 (16): 2797–808.

27. Akhlynina TV, Rosenkranz AA, Jans DA, et al. The use of internalizable derivative of chlorin e6 for increasing its photosensitizing activity. Photochem Photobiol 1993; 58 (1): 45–8.

28. Hemming AW, Davis NL, Dubois B, et al. Photodynamic therapy of squamous cell carcinoma. An evalution of a new photosensitizing agent benzoporphyrin derivative and new photoimmunoconjugate. Surgical Oncol 1993; 2 (Issue 3): 187–96.

29. Gullick WJ. Prevalence of aberrant expression of the epidermal growth factor receptor in human cancer. Br Med Bull 1991; 47 (1): 87–98.

30. Goldstein NI, Prewett M, Zuklys K, et al. Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumor xenograft model. Clin Cancer Res 1995; 1 (11): 1311–8.

internalizable conjugates on A431 cells. Int J Oncol 1998; 13 (6): 1171–7.

1. Gijsens A, Missiaen L, Merleved W, Witte de P. Epidermal growth factor-mediated targeting of chlorin e6 selectively potentiates its photodynamic therapy. Cancer Res 2000; 60 (8): 2197–202.

2. Dudek AZ, Pawlak WZ, Kirstein MN. Molecular targets in the inhibition of angiogenesis. Expert Opin Ther Targets 2003; 7 (4): 527–41.

3. Ровенский ЮА. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии. Биохимия 1998; 63 (9): 1204–21.

4. Молекулярно-генетичні детермінанти раку молочної залози: теоретичні засади практичного застосування в діагностиці і лікуванні. Здоровье женщины 2005; 41 (24): 189–98.

5. Shimizu K, Oku N. Cancer anti-angiogenic therapy. Biol Pharm Bull 2004; 27 (5): 599–605.

6. Ursula M, Erfurth S, Pruente C. Management of neovascular age-related macular degeneration. Progress Rational Eye Res 2007; 24 (Issue 4): 437–51.

7. Kanae Ichikawa, Tomoya Hikita, Noriyki Maeda, et al. PEGylation of liposome descreases the susceptibility of liposomal drug in cancer photodynamic therapy. Biol Pharm Bull 2004; 27: 443–4.

8. Takeuchi Y, Kurohade K, Ichicawa K, et al. Induction of intensive tumor suppressor by antiangiogenic photodynamic therapy using polycation-modified liposomal photosensitizer. Cancer 2003; 97: 2027–34.

9. Renno RZ, Terada Y, Haddadin MJ, et al. Selective photodynamic therapy by targeted verteporfin delivery to experimental choroidal neovascularization mediated by a homing peptide to vascular еndothelial grovth factor receptor-2. Arch Ophtalmol 2004; 122 (7): 1002–11.

10. Birchler M, Viti F, Zardi L, et al. Selective targeting and photocoagulation of ocular angiogenesis mediated by a phage-derived human antibody fragment. Nat Biotech 1999; 17: 984–8.

11. Mayo GL, Melendez RF, Kumar N, et al. Antibody-targeted photodynamic therapy. Am J Ophatalmol 2003; 36 (6): 1151–2.

1. Divgi CR, Welt S, Kris M, et al. Phase I and imaging trial

   of indium 111 — labeled anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody 225 in patients with squamous cell lung carcinoma. J Natl Cancer Inst 1991; 83 (2): 97–104.

2. Schwartz GK. Invasion and metastases in gastric cancer: in vitro and in vivo models with clinical correlations. Semin Oncol 1996; 23 (3): 316–24.

3. Harris RC, Chung E, Coffey RJ. EGF receptor ligands. Exp Cell Res 2003; 284: 2–13.

4. Lutsenko SV, Feldman NB, Finakova GV, et al. Targeting phthalocyanines to tumor cells using epidermal growth factor conjugates. Tumour Biol 1999; 20 (4): 218–24.

5. Gijsens A, Witte de P. Photocytotoxic action of EGF- PVA-Sn(IV)chlorin e6 and EGF-dextran-Sn(IV)chlorin e6