ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ПУХЛИНОАСОЦІЙОВАНИХ МОЛЕКУЛЯРНИХ МАРКЕРІВ У ХВОРИХ НА РАК МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ З РІЗНИМ ФЕНОТИПОМ ЛІКАРСЬКОЇ РЕЗИСТЕНТНОСТІ

ВСТУП

Вагомою передумовою радикальності лікуван­ ня пацієнтів із злоякісними новоутвореннями, що впливає на подальший перебіг процесу, є чутливість пухлин до цитотоксичної терапії, тому дослідження молекулярних маркерів, асоційованих з резистент­ ністю пухлини та її метастатичним потенціалом, є важливою задачею сучасної онкології. Вважають, що визначення спектра біомолекул, які детерміну­ ють біологічні особливості пухлинних клітин, дає спроможність прогнозувати перебіг пухлинного процесу на рівні із загальновизнаними (традиційни­ ми) клінічними та морфологічними характеристи­ ками [1, 2, 3]. Ще недавно основну увагу дослідники приділяли молекулам, які задіяні у формуванні ме­ ханізмів резистентності пухлини до протипухлинних препаратів. Це, зокрема, продукт гена MDR — Pgp, за умов експресії якого в пухлинних клітинах роз­ вивається резистентність до дії та антрациклінових антибіотиків, актиноміцину, алкалоїдів рослинного походження, наприклад, вінка­алкалоїдів, подофіл­ лотоксинів, таксанів [4], та група ферментів систе­ ми глютатіону (зокрема глютатіон­S­трансферази, GST), що виконують функцію детоксикації цитоста­ тиків. На сьогодні вони є найбільш вивченими мо­ лекулярними маркерами резистентності; значен­ ня GST [5] та Pgp [6] підтверджується і у деяких до­ слідженнях прогнозу агресивності перебігу РМЗ.

Але зв’язок цих молекул з іншими прогностични­ ми факторами вивчений ще недостатньо. Останнім часом все більше уваги приділяється молекуляр­ ним маркерам, які характеризують біологічні особ­ ливості пухлинних клітин, перш за все їх метаста­ тичний потенціал.

Тому вважаємо клінічно доцільним проведення комплексних досліджень щодо встановлення про­ гностичного значення експресії Pgp, GST, молекул адгезії (Е­кадгерину і муцину), рецепторів стероїд­ них гормонів (естрогену та прогестерону), а також білків­регуляторів проліферації клітин і апоптозу (p53, Bcl­2, металотіонеїну (МТ)) у злоякісних клі­ тинах у хворих на РМЗ.

Мета даної роботи — узагальнюючий аналіз су­ купності змін перелічених маркерів при РМЗ із різ­ ним ступенем агресивності.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експресію біологічних маркерів досліджували імуногістохімічним методом в операційному ма­ теріалі 45 хворих на РМЗ з розповсюдженням пух­ линного процесу T2N0­1­2M0, які лікувались у від­ ділі пухлин молочної залози Інституту онкології АМН України (1991–1995 рр.). Усім хворим прове­ дено радикальну мастектомію з подальшими курса­ ми хіміотерапії (ХТ) за стандартними схемами, пе­ реважно CMF [7]. На доопераційному етапі хворі не отримували спеціального лікування.

Морфологічне дослідження пухлин прово­ дили загальноприйнятим методом (забарвлення препаратів гематоксілін­еозином, світлооптична мікроскопія). Характеристики пацієнток за роз­ повсюдженням пухлинного процесу, віком, гісто­ логічним типом пухлини наведені у табл. 1. Імуно­ гiстохiмiчне дослiдження експресії молекулярних маркерів з використанням моноклональних анти­ тіл (МкАТ) проводили на парафінових зрізах тка­ нини пухлин, як описано раніше [8]. Дослідже­ но експресію Pgp, GST, МТ, p53, Bcl­2, рецепторів естрогенів та прогестерону (РЕ, РП), Е­кадгеріну та муцину (MUC1).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На першому етапі досліджено експресію мар­ керів резистентності Pgp та GST у пухлинах хворих з урахуванням гістологічного типу та стадій роз­ витку пухлинного процесу. Показано тенденції до збільшення частоти (порівняно з інфільтруючим дольковим раком (ІДР)) експресії Рgp і GST за на­ явності інфільтруючого протокового раку (ІПР), GST — інфільтруючого недиференційованого раку (ІНДР) (табл. 2).

T2N2M0 виявлено у 43,0 та 56,0% випадків (р < 0,05) відповідно (рис. 2). Отримані дані свідчать про мож­ ливість використання GST як маркера несприят­ ливого перебігу хвороби та високої вірогідності (p < 0,05) розвитку метастазів у регіонарні лімфа­ тичні вузли пацієнток з РМЗ. У проведених рані­ ше дослідженнях показано існування зв’язку між наявністю метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах та виживаністю хворих на РМЗ. Так, загаль­ на 1­, 5­ та 10­річна виживаність хворих зі стадією Т2N0M0 становила 100,0%, а зі стадією T2N1M0 — 100,0; 80,0 та 73,0% відповідно. Результати зістав­ лення цих даних вказують на існування зв’язку між експресією маркерів резистентності та строками ви­ живаності [8].

Таблиця 1 Характеристика хворих, залучених у дослідження

Таблиця 2 Характеристика хворих на РМЗ за критерієм експресії у пухлині

маркерів лікарської резистентності1

1Відсотки обчислювали відносно загальної кількості хворих, залучених у дослідження.

Деякі автори звертають увагу на зв’язок експресії як Рgp, так і GST та гістологічного типу РМЗ [9]. У нашому дослідженні таку закономірність для Pgp не виявляли, проте встановлено, що при більш аг­ ресивному РМЗ (ІНДР, ІПР) експресія GST віро­ гідно вище (p < 0,05) порівняно з менш агресивни­ ми формами ІДР) (рис. 1).

При дослідженні експресії маркерів резистен­ тності залежно від стадії захворювання відзначена тенденція щодо посилення експресії Рgp у міру роз­ повсюдження процесу: у 20% хворих з РМЗ T2N0M0 стадії, у 30% — при стадії T2N1M0 та у 50% — при T2N2M0. Встановлено достовірний зв’язок між екс­ пресією GST та метастазуванням у регіонарні лім­ фатичні вузли. У хворих на РМЗ стадії T2N0M0 екс­ пресії GST не зареєстровано, а на стадіях T2N1M0 та

Рис. 1. Показники експресії Pgp, GST та МТ у пухлинах хворих на РМЗ із різним гістологічним типом. Відсотки обчислювали відносно загальної кількості хворих, у яких виявлено експресію даного маркера. *p < 0,5 порівня­ но з ІДР.

Рис. 2. Показники експрессії Pgp, GST і МТ у пухли­ нах хворих на РМЗ з відсутністю (T2N0M0) та наявніс­ тю (T2N1M0 і T2N2M0) метастазів у лімфатичних вузлах

*p < 0,5 порівняно з T2N0M0.

При аналізі експресії МТ — цистеїн­багатих металозв’язуючих білків з’ясовано, що їх гіперекс­ пресія має антиапоптичний характер і зумовлює підвищення проліферативної активності пухлинних клітин. МТ активує і специфічно взаємодіє з р50 — субчасткою фактора транскрипції NFkB (nuclear factor­kappa B), що призводить до трансактивації останнього [10]. Активований NFkB регулює екс­ пресію цикліну D1 та перехід клітинного циклу з G1 в S фазу, таким чином стимулюючи проліферацію клітин [11]. Встановлено, що експресія МТ зале­ жить від гістологічного типу РМЗ. Так, у пацієнтів

з ІДР експресія МТ відсутня, всі позитивні реакції зареєстровано у хворих із більш агресивними фор­ мами РМЗ — ІПР та ІНДР (відповідно у 21,0 і 79,0% позитивних випадків (див. рис. 1)). При аналізі екс­ пресії МТ при різній розповсюдженості метастазів у лімфатичних вузлах визначають пряму залежність між експресією МТ та наявністю метастазів (p < 0,05). Позитивну імуногістохімічну реакцію відзна­ чали у 41,0% хворих T2N1M0 групи, та у 71,0% — зі значним ураженням декількох лімфатичних вузлів (група T2N2M0) (див. рис. 2). Отже, маркер МТ — суттєвий фактор прогнозу перебігу пухлинного про­ цесу з високою вірогідністю виникнення регіонар­ них метастазів у хворих на РМЗ. Лише нещодавно з’ясували роль МТ у процесі набуття трансформо­ ваними клітинами резистентності до дії протипух­ линних препаратів [12, 13]. Результати даного до­ слідження демонструють, що поява експресії GST співпадає із зростанням експресії МТ; водночас не встановлено подібного зв’язку між експресією Рgp і МТ. Отримані результати свідчать про можливу участь МТ у розвитку резистентності, зумовленої GST, у хворих на РМЗ.

Відомо, що на початкових етапах метастазуван­ ня пухлинні клітини змінюють свої адгезивні влас­ тивості, маркерами яких є, зокрема, Е­кадгерин та муцин [10]. У клітинах нормальної молочної зало­ зи Е­кадгерин (представник родини кальційзалеж­ них трансмембранних глікопротеїнів) відіграє важ­ ливу роль у підтримуванні фенотипу епітеліальних клітин та є медіатором міжклітинної адгезії остан­ ніх, що реалізується за рахунок гомотипічної взає­ модії їх позаклітинних доменів (контакти типу «зона злипання» — zona adhaerence). У пухлинних кліти­ нах значної кількості пацієнтів із РМЗ відзначають суттєве зниження експресії цього маркера. Дефек­ ти функціонування Е­кадгерину та кадгерин­катені­ нового комплексу пов’язують з інвазією [14], про­ гресуванням пухлинного росту та метастазуванням [15, 16]. Відзначено тенденцію до втрати або зни­ ження експресії Е­кадгерину та підвищення екс­ пресії МUC1 за наявності у пацієнтів регіонарних метастазів. Експресія Е­кадгерину виявлена у 60% хворих зі стадією пухлинного процесу T2N0M0 і ли­ ше у 31% — зі стадією T2N1M0 [8], МUC1 — у 30 та 40% пацієнтів відповідно. Відзначали також знижен­ ня експресії Е­кадгерину зі зниженням ступеня ди­ ференціювання пухлинних клітин при РМЗ. Зокре­ ма, при ІНДР експресія Е­кадгерину не визначена в жодному випадку. Отже, набування пухлинними клітинами інвазивного та метастатичного потенціа­ лу супроводжується зниженням експресії Е­кадге­ рину з певним підвищенням експресії МUC1. Отри­ мані дані співпадають з даними інших дослідників, що вказують на суттєве зниження експресії Е­кадге­ рину при РМЗ із зменшенням безрецидивної та за­ гальної виживаності хворих [17, 18, 19]. Підвищення експресії MUC1 у пацієнтів з РМЗ можна поясни­ ти даними літератури, які свідчать, що при злоякіс­

ній трансформації відбувається процес гіперглікози­ лювання молекул муцинів, який не тільки зумовлює послаблення зв’язків між клітинами та спричиняє розповсюдження пулу пухлинних клітин за межі первинної пухлини, але й супроводжується маску­ ванням сайтів зв’язування ракових клітин з цито­ токсичними Т­лімфоцитами, що в нормі сприяють елімінації трансформованих клітин [20]. Крім того, цитоплазматична форма MUC1 може конкурувати з Е­кадгерином за зв’язування з β­катеніном, що та­ кож може бути причиною порушення адгезивних властивостей пухлинних клітин [21].

Встановлено, що набування клітинами фено­ типу лікарської резистентності шляхом експресії Рgp і GST супроводжується зменшенням експресії Е­кадгерину та підвищенням експресії MUC1. На­ явнiсть Е­кадгерину у цитоплазмi пухлинних клi­ тин виявлена у 60% хворих, які не мали експресії Pgp (Pgp–­група); у Pgp+­групі позитивна реакція на Е­кадгерин — у 44%. Залежно від експресії GST експресія Е­кадгерину змінювалась більш суттєво. GST+­пухлинні клітини експресують Е­кадгерин у 27% випадків, а GST–­клітин — у 57%. Дослiд­ ження експресiї MUC1 дозволило встановити по­ зитивну імуногістохімічну реакцію у 65 і 83% хво­ рих Pgp–­ та Pgp+­груп відповідно. У пацієнток, пух­ линні клітини яких експресували GST, експресію MUC1 відзначали у 94%, у хворих GST–­групи — у 80% випадків.

Хоча більшість авторів схиляється до думки про відсутність прямого зв’язку між експресією Е­кад­ герину та набуттям пухлиною множинної лікарської резистентності, отримані дані вказують, що поява маркерів резистентності в пухлинних клітинах су­ проводжується змінами в експресії маркерів адгезії. Існує припущення [22], що Е­кадгерин сприяє роз­ витку множинної лікарської резистентності: зумов­ лена ним міжклітинна адгезія супроводжується підвищенням рівня р27KIP1, що призводить до ареш­ ту клітинного циклу та виникнення рефрактерності до лікарських препаратів. Дані літератури свідчать також про участь Е­кадгерину у пригніченні мета­ статичного та проліферативного потенціалу пухлин

1. і про те, що наявність Е­кадгерину асоціюєть­ ся з позитивним прогнозом щодо перебігу пухлин­ ного процесу [24].

   Результати дослідження експресії рецепторів сте­ роїдних гормонів у пухлинах хворих на РМЗ показа­ ли, що поява регіонарних метастазів супроводжуєть­ ся зниженням експресії РЕ (з 50 до 30% випадків) та незначним підвищенням експресії РП (з 30 до 40% випадків). Втрата пухлинними клітинами здатності до диференціювання супроводжується зниженням експресії обох рецепторів [8]. Набування клітинами резистентного фенотипу супроводжується знижен­ ням експресії РЕ і РП. Кількість пацієнток із пози­ тивною реакцією на РЕ становить 60% у Pgp–­групі та 28% — у Pgp+­групі. У 47% пацієнток GST–­групи відзначали експресію РЕ, у той час як у GST+­групі

   лише у 33%. Експресія РП знижувалась у Рgp+­групі порівняно з Рgp–­групою на 18%, при порівнянні GST+­ і GST–­груп — на 9%.

   За наявності регіонарних метастазів у лімфатич­ них вузлах експресію РЕ виявляли у 20% хворих, РП — у 10%. При втраті пухлинними клітинами здат­ ності до диференціювання (при ІНДР), експресія РЕ відзначена лише у 13%, а РП — у 23% хворих.

   Отримані результати можна пояснити відомою взаємозалежністю експресії РП пухлинними кліти­ нами та їх проліферативної активності [25]. Так, при дослідженні проліферативного потенціалу пухлин хворих GST–­групи високу проліферативну актив­ ність відзначали у 15%, GST+­групи — лише у 7%. Таким чином, при РМЗ визначена зворотня залеж­ ність між експресією РП пухлинними клітинами та їх проліферативною активністю, яку можна пояс­ нити участю РП у зупинці клітинного циклу. По­ казано, що за наявності експресії РП у пухлинних клітинах підвищується рівень білка р21WAF1/СІР1, що при пошкодженні ДНК відповідає за зупинку клі­ тинного циклу у пізній фазі G1 [26]; одночасно в клітині знижується рівень фосфорильованих форм MAPK (mitogen­activated protein kinase) — р42 та р44 МАРКs, які являються ефекторами мітогенно­ го сигналу.

   Встановлено також, що поява експресії Рgp і GST супроводжується підвищенням експресії р53. Так, присутність р53 у резистентних і чутливих пухли­ нах виявлена у 67 і 28% випадків відповідно. Тільки у 10% пацієнтів GST–­групи пухлинні клітини екс­ пресують р53, кількість р53­позитивних пухлин у GST+­групі становила 80%. Використовували МкАТ до нормальної та мутантної форм р53, але дані лі­ тератури свідчать, що позитивна імуногістохіміч­ на реакція виникає при взаємодії МкАТ саме з му­ тантною формою р53. Підвищення рівня експресії мутантного р53, не здатного до виконання функції арешту клітинного циклу при пошкодженнях ДНК, супроводжується накопиченням пухлинними кліти­ нами мутованих генів. Деякі з них можуть бути ко­ рисними для життєдіяльності пухлини, що в свою чергу може призвести до виникнення більш агре­ сивних її форм [27]. Крім того, у відповідь на дію онкогенних агентів активується протеїн ARF, який зв’язує білок MDM2, що в свою чергу призводить до стабілізації р53. Через Siah2­залежний шлях р53 викликає дерегуляцію β­катеніну, який, як відомо, входить до складу кадгерин­катенінового адгезив­ ного комплексу, що у нормі забезпечує зв’язок клі­ тин молочної залози між собою. Послаблення ад­ гезії між пухлинними клітинами зумовлює підви­ щення інвазивного потенціалу РМЗ [28].

   Експресія антиапоптичного білка Bcl­2 підви­ щується при появі експресії Рgp і знижується при експресії GST. Bcl­2 експресується у цитоплазмі пухлинних клітин у 28% хворих Pg–­групи і 67% — Рgp+­групи; у GST+­групі експресію Bcl­2 виявляли у 20% хворих, у GS–­групі — у 45%. Згідно з дани­

   ми літератури гіперекспресія Bcl­2 позитивно коре­ лює з експресією РЕ, низьким рівнем злоякісності пухлинних клітин, меншими розмірами пухлини та розповсюдженістю злоякісного процесу [29]. Отже, визначений позитивний зв’язокекспресії Bcl­2 з екс­ пресією Рgp та обернений з експресією GST свідчить про більш агресивний фенотип пухлинних клітин, у яких лікарська резистентність розвивається шля­ хом активації GST механізму.

   ВИСНОВКИ

   1. Набування пухлинними клітинами резистент­ ного фенотипу (Рgp+, GST+) корелює із більш агре­ сивними гістологічними типами РМЗ та наявністю метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах, на­ слідком чого є зниження виживаності хворих.
   2. Для прогнозу перебігу пухлинного процесу у хворих на РМЗ важливе значення має механізм, за яким формується резистентний фенотип. Серед маркерів резистентності, які є ключовими для різ­ них механізмів резистентності, експресія GST доз­ воляє достовірно прогнозувати несприятливий роз­ виток пухлинного процесу.
   3. Встановлено, що серед білків­регуляторів про­ гностично вагомим маркером несприятливого про­ гнозу РМЗ є експресія у пухлинних клітинах МТ.
   4. При формуванні фенотипу резистентності за Рgp­ або GST­механізмами експресія маркерів ад­ гезії, рецепторів стероїдних гормонів, р53, Bcl­2 змі­ нюється неоднаково; за сукупністю цих маркерів останній механізм (GST опосередкований) зумов­ лює більш агресивний перебіг РМЗ.

ЛІТЕРАТУРА

1. Linjawi A, Kontogiannea M, Halwani F, et al. Prognostic significance of p53, bcl­2, and Bax expression in early breast cancer. J Am Coll Surg. 2004; 198 (1): 83–90.

2. Hlupic L, Jakic-Razumovic J, Bozikov J, et al. Prognostic value of different factors in breast carcinoma. Tumori. 2004; 90 (1): 112–9.

3. Horita K, Yamaguchi A, Hirose K, et al. Prognostic factors affecting disease­free survival rate following surgical resection of primary breast cancer. Eur J Histochem. 2001; 45 (1): 73–84.

4. Yang X, Uziely B, Groshen S, et al. MDR1 gene expression in primary and advanced breast cancer. Lab Invest 1999; 79 (3): 271–80.

5. Huang J, Tan PH, Thiyagarajan J, Bay BH. Prognostic significance of glutathione S­transferase­pi in invasive breast cancer. Mod Pathol 2003; 16 (6): 558–65.

6. Larkin A, O’Driscoll L, Kennedy S, et al. Investigation of MRP­1 protein and MDR­1 P­glycoprotein expression in invasive breast cancer: A prognostic study. Int J Cancer 2004; 112 (2): 286–94.

7. Переводчикова НИ. Противоопухолевая химиотерапия: Справочник. — М: Медицина, 1993. 223 с.

8. Юрченко ОВ, Волкова ЕД, Русецкая НВ и др. Имму­ ногистохимическое исследование экспрессии рецепторов стероидных гормонов и Е­кадгерина как возможных марке­ ров прогноза у больных раком молочной железы. Онколо­ гия 2004; 6 (4): 252–9.

9. Linn SC, Giaccone G, van Diest PJ, et al. Prognostic relevance of P­glycoprotein expression in breast cancer. Ann Oncol 1995; 6 (7): 679–85.

10. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D. Prognostic Factors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2000; 124 (7): 966–78.

11. Hellin AC, Bentires-Alj M, Varleat M, et al. Roles of nuclear factor­κB, p53 and p21/WAF1 in daunomicin­induced cell cycle arrest and apoptosis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2000; 295 (3): 870–8.

12. Глухова ЕИ, Лукашина МИ, Богатырев ВН, Барышников АЮ. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз и ин­ декс ДНК опухолевых клеток рака молочной железы. Рос био­ терапевт журн 2003; 1 (3): 15–21.

13. Florianczyk B, Grzybowska L. Metallothione in levels in cell fractions from breast cancer tissues. Acta Oncol 2000; 39 (2): 141–3.

14. Madhavan M, Srinivas P, Abraham E, et al. Cadherins as predicrive markers of nodal metastasis in breast cancer. Mod Pathol 2001; 14 (5): 423–7.

15. Frixen UH, Behrens J, Sachs M, et al. E­cadherin­ mediated cell­cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells. J Cell Biol 1991; 113 (1): 173–85.

16. Perl AK, Wilgenbus P, Dahl U, et al. A causal role of E­cadherin in the transition from adenoma to carcinoma. Nature 1998; 392 (6672): 190–3.

17. Zhang X, Emerald BS, Mukhina S, et al. HOXA1 is required for E­cadherin­dependent anchorage­independent survival of human mammary carcinoma cells. J Biol Chem 2006; 281 (10): 6471–81.

18. Gould Rothberg BE, Bracken MB. E­cadherin Immunohistochemical Expression as a Prognostic Factor in Infiltrating Ductal Carcinoma of the Breast: a Systematic Review and Meta­Analysis.Breast Cancer Res Treat 2006; 100 (2):

    139–48.

19. Swiatoniowski G, Matkowski R, Suder E, et al. E­cadherin and fibronectin expressions have no prognostic role in stage II ductal breast cancer. Anticancer Res 2005; 25 (4): 2879–83.

20. Smith GH, Chepko G. Mammary epithelial stem cells. Microsc Res and Techn 2001; 52 (2): 190–203.

21. Rahn JJ, Dabbagh L, Pasdar M. The importance of MUC1 cellular localization in patients with breast carcinoma: an immunohistologic study of 71 patients and review of the literature. Cancer 2001; 91 (11): 1973–82.

22. Shain KH, Dalton WS. Cell Adhesion Is a Key Determinant in de Novo Multidrug Resistance (MDR): New Targets for the Prevention of Acquired MDR. Molecular Cancer Therapeutics 2001; 1 (11): 69–78.

23. Madhavan M, Srinivas P, Abraham E, et al. Cadherins as predicrive markers of nodal metastasis in breast cancer. Mod Pathol 2001; 14 (5): 423–7.

24. Cavallaro U, Christofori G. Cell adgesion in tumor invasion and metastasis: loss of the gene is not enought. Biochim Biophys Acta 2001; 1552 (1): 39–45.

25. Song ZC, Wang GL, Qi YX, Li Y. Relationship between expression of multiple tumor suppressor (MTS1) and E­cadherin and metastasis of breast cancer. Ai Zheng 2003; 22 (5): 526–8.

26. Lin VC, Woon CT, Aw SE, Guo C. Distinct molecular pathways mediate progesterone­induced growth inhibition and focal adhesion. Endocrinology 2003; 144 (12): 5650–7.

27. Ostrakhovitch EA, Cherian MG. Differentiatial regulation of signal transduction pathways in wild type and mutated p53 breast cancer epithelial cells by copper and zinc. Arch Biochem Biophys 2004; 432 (2): 351–61.

28. Vousden KH. Activation of the p53 tumor suppressor protein. Biochimica Biophysica Acta 2002; 16 (2): 47–59.

29. Olopade OI, Adeyanju MO, Safa AR, et al. Overexpression of BCL­x protein in primary breast cancer is associated with high tumor grade and nodal metastases. Cancer J Sci Am 1997; 3 (4): 230–7.