БІЛКИ РЕПЛІКАТИВНОГО СТРЕСУ ЯК ПОТЕНЦІЙНІ ПРОГНОСТИЧНІ МАРКЕРИ РЕЦИДИВУВАННЯ ЕНДОМЕТРІОЇДНОЇ КАРЦИНОМИ ЕНДОМЕТРІЮ У ХВОРИХ З І СТАДІЄЮ ЗАХВОРЮВАННЯ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-24-3-2022-g.10827

За даними онкоепідеміологічних досліджень, рак ендометрію (РЕ) є найпоширенішим серед гінекологічних новоутворень у жінок в багатьох розвинених країнах світу, у тому числі й в Україні [1, 2]. До того ж спостерігається тенденція до щорічного зростання захворюваності на цю патологію не тільки серед жінок менопаузального періоду. У 3–14% випадків РЕ виявляють у пацієнток до 40 років [3, 4].

Незважаючи на те що у 80% випадків РЕ за гістологічним варіантом є ендометріоїдною карциномою ендометрію (ЕКЕ), яку діагностують на ранніх стадіях і загальна 5-річна виживаність пацієнток становить 74–95%, проте майже у 7–20,0% хворих з І стадією захворювання в період від 6 міс до 3 років після лікування спостерігається рецидивування пухлинного процесу і розвиваються метастази [5–8].

Однією з причин неефективності лікування хворих на ЕКЕ є біологічна гетерогенність пухлинних клітин ендометрію навіть у межах однієї морфологічної форми. Саме проблема варіабельності ЕКЕ як за клініко-морфологічними властивостями, так і за молекулярно-біологічними характеристиками ускладнює діагностичний процес. Тому поглиблені дослідження на рівні геному і протеому є вельми актуальними, оскільки можуть забезпечити аргументоване підґрунтя для детекції високоагресивних підтипів цієї форми раку. Однією з основних характеристик пухлинних клітин є геномна нестабільність, яка може бути первинною або виникає внаслідок впливу екзо- та ендогенних факторів, у результаті чого відбувається активація онкогенів та інактивація генів-супресорів. При цьому ключову роль у генерації зазначених змін відіграє так званий реплікативний стрес ДНК — ситуація, за якої порушується реплікація ДНК, що призводить до пошкодження та накопичення одно- та дволанцюгових розривів [10–12].

Важливими маркерами реплікативного стресу є АTM- і ATR-кінази, які, активуючись на пошкодження ДНК, фосфорилюють FANCD2. Останній, у свою чергу, сприяє активації BRCA1 на шляху FA/BRCA, що є важливим сигнальним каскадом як у відновленні пошкоджень ДНК, так і для стабілізації «вилок» реплікації [11].

Протеїнкінази ATR і АTM беруть участь не тільки в процесах реплікації і репарації, але також є компонентами сигнальних шляхів (ATR-CHЕK1 та ATM-CHЕK2). Так, чекпойнт-кінази CHЕK1 (ATR-залежна) та CHЕK2 (ATM-залежна) у разі пошкодження ДНК запускають каскади сигнальних шляхів, що зупиняють клітинний цикл у S- і G2/M-фазі, а у разі виникнення дефектів ініціюють апоптоз [12].

Рядом авторів показано, що злоякісна трансформація епітеліальних клітин, у тому числі клітин ендометрію, може виникати внаслідок ампліфікації онко­генів C-MYC, CCNE1 і мутації K-RAS з одно­часною зміною експресії генів, що відповідають за репарацію ДНК — ATR, CHEK1, BRCA1, FANCD2 тощо. Тобто за умови неспроможності системи репарації у пухлинних клітинах зростає генетична нестабільність, що призводить до безконтрольної проліферації та подальшого виникнення біологічно поліморфних клонів пухлинних клітин з підвищеним інвазивним/метастатичним потенціалом і резистентних до хіміо- та променевої терапії [13, 14].

Відомо, що в основі гетерогенності морфологічних і молекулярних особливостей злоякісних пухлин (60–80%) лежить генетична нестабільність, яка виникає внаслідок порушення реплікації ДНК та репарації помилок сегрегації хромосом, що може проявлятися як кількісними, так і структурними абераціями хромосом, включаючи анеуплоїдію, поліплоїдію, та зміною копійності генів, підвищенням фрагільних сайтів хромосом та ін. [15–19].

За даними літератури, показано, що у пухлинних клітинах і лімфоцитах периферичної крові хворих на РЕ спостерігається виражена хромосомна нестабільність, пов’язана з порушенням роботи генів системи репарації MMR. Ці зміни супроводжуються підвищеним рівнем одно- та двониткових розривів ДНК, аберацій хромосом та фрагільних сайтів хромосом, гіперчутливістю до впливу генотоксичних агентів різної природи, що асоціюється з агресивністю пухлинного процесу [20–23].

Важливе значення у прогресії неоплазій мають порушення процесу реплікації (реплікаційний стрес) та ефективність функціонування системи репарації пошкоджень ДНК. Суттєвою в реалізації цих процесів є експресія наступних маркерів: ATR, АTM, CHEK1/2, FANCD2, BRCA1, значення яких у маніфестації злоякісності РЕ до цього часу вивчено недостатньо. Тому застосування біоінформатичних інтернет-ресурсів для встановлення ролі експресії маркерів як індукторів геномних пошкоджень в клітинах РЕ, асоційованих з реплікативним стресом, є актуальним завданням сучасних досліджень та інновацій у галузі онкології [24].

Мета дослідження: на основі біоінформатичного аналізу експресії маркерів, асоційованих з реплікативним стресом, оцінити їх значення у прогресуванні ЕКЕ.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

На основі біоінформатичного аналізу відкритих баз даних, у яких представлена інформація щодо молекулярних особливостей нормальних та пухлинних клітин ендометрію, було проведено інтерактивний аналіз експресії мРНК генів, асоційованих з реплікативним стресом — ATR, CHEK1/2, ATM, FANCD2, BRCA1. Використано інтерактивний вебінструмент GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), що дозволяє проводити оцінку експресії генів на основі порівняння нормальних і пухлинних зразків РЕ, інтегрованих з бази даних TCGA i GTEx. Аналіз мережі передбачених асоціацій досліджених генів проводили з використанням біоінформатичної бази даних STRING v.11.5 (https://www.string-db.org/). Окрім того, пошук потенційних взаємодій досліджених білків проведено з використанням бази даних та алгоритму FunCoup v.5.0 (https://funcoup5.scilifelab.se/).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

З використанням інтерактивного вебінструмента GEPIA проведено аналіз експресії панелі маркерів реплікативного стресу у зразках незміненої тканини (91 зразок) та карциноми ендометрію (174 зразка). При цьому встановлено, що в карциномі ендометрію експресія гена ATR, який контролює «вилку» реплікації та запобігає виникненню одноланцюгових розривів ДНК має тенденцію до зниження на рівні мРНК порівняно з незміненою тканиною ендометрію. Аналогічна спрямованість змін спостерігалася під час оцінки експресії гена ATM, який зупиняє проходження клітинного циклу у разі виникнення дволанцюгових розривів ДНК. Визначені зміни вірогідно свідчать про порушення контролю за процесами реплікації ДНК у клітинах ЕКЕ (рис. 1 a, б).

Водночас спостерігається зростання рівня експресії генів CHEK1/2 у клітинах ЕКЕ порівняно з нормою. Отримані дані узгоджуються з висновками ряду авторів, які показали, що експресія CHEK1 може підвищуватися при раку молочної залози та колоректальному раку порівняно з прилеглими нормальними тканинами [25, 26]. Дослідження продемонструвало, що ген CHEK1 неоднаково експресується в новоутвореннях різного генезу. Так, знижена експресія мРНК гена CHEK1 є несприятливим прогностичним фактором для хворих на колоректальний та рак шлунка. Встановлено нижчу виживаність пацієнтів з високою експресією гена CHEK1 при раку мозку, легені, яєчника і молочної залози порівняно з пухлинами з низькою експресією CHEK1 [27].

Відомо, що гени CHEK1 і CHEK2 активуються відповідно ATM- і ATR-залежною протеїнкіназою та регулюють експресію важливих білків репарації FANCD2 і BRCA1, які задіяні як в регуляції клітинного циклу, так і репарації одно- та дволанцюгових розривів ДНК [28].

Згідно з даними інтерактивного аналізу профілю експресії генів FANCD2, BRCA1 та CHEK1/2 у клітинах РЕ виявлено більш високий рівень таких показників у пухлинах порівняно з нормальними тканинами. Натомість показники експресії ATM і ATR були значно нижчими у пухлинах ендометрію порівняно з незміненою тканиною, що вірогідно відображає дисфункцію репарації ДНК (див. рис. 1).

За даними багатоцентрових досліджень, злоякісні новоутворення ендометрію у хворих з І стадією захворювання були гетерогенними як за біологічними особливостями, так і за ризиком прогресування пухлинного процесу [5]. Відомо, що ступінь диференціювання і глибина інвазії пухлини є критично значущими факторами в оцінці прогнозу та призначення ефективного лікування хворим на ЕКЕ [29, 30].

Наведене аргументує важливість оцінки рівня експресії генів ATR, ATM, CHEK1/2 (сигналінг ATM/ATR–CHЕK1/2) і FANCD2 та BRCA1 (сигналінг FANC–BRCA) в карциномах ендометрію залежно від стадії пухлинного процесу (рис. 2). Показано варіабельність експресії досліджених генів залежно від стадій пухлинного процесу. При цьому з’ясувалося, що експресія ATR у клітинах ЕКЕ мала тенденцію до підвищення при стадії ІІІ порівняно зі стадіями І і ІІ.

Встановлено, що рівень мРНК CHEK1 корелює зі стадіями захворювання пацієнтів з ЕКЕ (р = 0,048). Детальний аналіз експресії CHEK1 в субтипах карцином ендометрію виявив, що при ІС стадії (інвазія >¹/₂ пухлини у міометрій) її значення аналогічні до таких при стадії ІІІ.

Під час дослідження експресії ATМ встановлено її зниження, а FANCD2 та BRCA1 — зростання. Ці зміни вірогідно відображають активацією таких механізмів репарації ДНК, як гомологічна рекомбінація та ексцизійна репарація нуклеотидів. Поряд із зазначеним встановлено, що рівень експресії ATR, ATM, BRCA1 та FANCD2 в карциномах ендометрію хворих з ІС стадією подібний до їх показників у ЕКЕ з поширеними стадіями пухлинного процесу.

Важливою властивістю білка FANCD2 є його спроможність формувати в сайтах пошкодження ДНК репараційні комплекси з іншими білками, такими як BRCA1, BRCA2, ATR, CHЕK1 і ATM, активуючи таким чином шлях репаративної гомологічної рекомбінації [31–34]. Для аналізу виявлення функціональних зв’язків між білками, що кодуються наведеними генами, було використано біоінформатичний вебінструмент STRING v.11.5, що інтегрує набори даних з певною інформацією про взаємодію цих генів. Також створено відповідний інтерактом з високими коефіцієнтами взаємодії (score >0,700). Продемонстровано, що компоненти шляхів ATR↔CHЕK1, ATR↔CHЕK2, ATM↔CHЕK2, CHЕK2↔BRCA1, ATM↔BRCA1, FANCD2↔BRCA1 взаємопов’язані між собою з найбільш високою достовірністю (score = 0,999). Встановлено також наступні зв’язки: ATM↔ATR (0,998), ATM↔CHЕK1 (0,998), ATR↔BRCA1 (0,996), ATM↔FANCD2 (0,993), CHЕK1↔FANCD2 (0,992), ATR↔FANCD2 (0,988), CHЕK1↔BRCA1 (0,987), CHЕK1↔CHЕK2 (0,974), CHЕK2↔FANCD2 (0,802) (рис. 3).

Аналогічні достовірні (сonfidence >0,7) зв’язки експресії досліджених маркерів було визначено і під час застосування іншого методу біоінформатичного прогнозування (FunCoup v.5.0). Виявлено наступні асоціації між парами генів: ATM↔ATR (сonfidence = 1,000), ATR↔CHЕK2 (0,998), FANCD2↔BRCA1 (0,995), CHЕK1↔BRCA1 (0,993), ATM↔FANCD2 (0,992), CHEK2↔BRCA1 (0,991), ATM↔CHЕK2 (0,987), ATR↔FANCD2 (0,980), ATR↔CHЕK1 (0,960), CHЕK1↔FANCD2 (0,744), ATR↔BRCA1 (0,729) (рис. 4).

Таким чином, біоінформатичний аналіз відкритих баз даних дозволив встановити високопрогнозовані зв’язки між асоційованими з реплікативним стресом білками ATR, CHEK1/2, ATM, FANCD2 та BRCA1 і відмінності експресії мРНК генів, що продукують ці білки в незміненій тканині ендометрію і карциномах ендометрію у хворих з різною стадією пухлинного процесу.

Оскільки реплікація — це процес, що забезпечує точне подвоєння ДНК, і саме реплікативний стрес є фундаментальною засадою та, вірогідно, ранньою подією геномної нестабільності. Враховуючи зазначене, вже на початкових стадіях онкогенезу в ендометрії можуть відбуватися зміни активності ATR- і CHEK1-кіназ, внаслідок чого зростає проліферативна активність як один з ключових факторів прогресування ЕКЕ [9, 35, 36].

Як видно з результатів аналізу відкритих баз даних, у карциномах ендометрію спостерігаються зміни експресії генів, асоційованих з реплікативним стресом — ATR, CHEK1/2, ATM, FANCD2 і BRCA1. Причому характер цих змін неоднозначний, що, безумовно, потребує подальшого їх експериментального дослідження.

ВИСНОВКИ

Виявлений зв’язок експресії генів ATR, ATM, CHEK1/2, FANCD2 і BRCA1 на рівні мРНК з клінічними стадіями захворювання пацієнтів з ЕКЕ зумовлює доцільність більш детального вивчення експресії маркерів для ідентифікації молекулярних ознак високозлоякісних ЕКЕ у хворих з І стадією пухлинного процесу.

Робота виконувалася в рамках НДР «Фактори реплікативного стресу у прогресії ендометріоїдної карциноми ендометрію» (0122U001977).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Fedorenko Z, Goulak L, Gorokh Ye, et al. Cancer in Ukraine, 2020-2021. Morbidity, mortality, indicators of the oncology service activity. Bull Natl Cancer Register Ukr. Kyiv, 2022; 23. http://www.ncru.inf.ua/publications/BULL_23/index_e.htm.
2. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2018; 68 (6): 394–24. doi:10.3322/caac.21492.
3. Hamilton CA, Pothuri B, Arend RC, et al. Endometrial cancer: a society of gynecologic oncology evidence-based review and recommendations, part II. Gynecol Oncol 2021; 160 (3) :827–34. doi: 10.1016/j.ygyno.2020.12.024.
4. Siegel RL, Miller KD, Fuchs HE, Jemal A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer J Clin. 2022; 72 (1): 7–33. doi: 10.3322/caac.21708.
5. Concin N, Matias-Guiu X, Ignace Vergote, et al. ESGO/ESTRO/ESP guidelines for the management of patients with endometrial carcinoma. Int J Gynecol Cancer 2021; 31: 12–39. doi: 10.1136/ijgc-2020-002230.
6. Ruz-Caracuel I, Ramón-Patino JL, López-Janeiro Á, et al. Myoinvasive pattern as a prognostic marker in low-grade, early-stage endometrioid endometrial carcinoma. Cancers (Basel) 2019; 11 (12): 1845. doi: 10.3390/cancers11121845.
7. Bendifallah S, Canlorbe G, Collinet P, et al. Just how accurate are the major risk stratification systems for early-stage endometrial cancer? Br J Cancer 2015; 112: 793–801. doi: 10.1038/bjc.2015.35.
8. Movchan OM, SvintsitskiyVS, Tsip NP et al. Features of recurrence of endometrioid type endometrial cancer of І stage. Exp Oncol 2021; 43 (4): 365–69. doi: 10.32471/exp-oncology.2312-8852.vol-43-no-4.17052.
9. Kotsantis P, Petermann E, Boulton SJ. Mechanisms of oncogene-induced replication stress: jigsaw falling into place. Cancer Discov 2018; 8 (5): 1–19. doi: 10.1158/2159-8290.CD-17-1461.
10. Primo LMF, Teixeira LK. DNA replication stress: oncogenes in the spotlight. Genet Mol Biol 2020; 43: e20190138: doi.org/10.1590/1678-4685-GMB-2019-0138.
11. Kim H, D’Andrea AD. Regulation of DNA cross-link repair by the Fanconi anemia/BRCA pathway. Genes Dev 2012; 26 (13): 1393-408. doi: 10.1101/gad.195248.112.
12. Takeuchi M, Tanikawa M, Nagasaka K, et al. Anti-tumor effect of inhibition of DNA damage response proteins, ATM and ATR, in endometrial cancer cells. Cancers (Basel) 2019; 11 (12): 1913. doi: 10.3390/cancers11121913.
13. Alhmoud JF, Woolley JF, Al Moustafa AE, Malki MI. DNA damage/repair management in cancers. Cancers (Basel) 2020; 12 (4): 1050. doi: 10.3390/cancers12041050.
14. Segeren HA, Westendorp B. Mechanisms used by cancer cells to tolerate drug-induced replication stress. Cancer Lett 2022; 544: 215804. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215804.
15. Turajlic S, Sottoriva A, Graham T, Swanton C. Resolving genetic heterogeneity in cancer. Nat Rev Genet 2019; 20 (7): 404–16. doi: 10.1038/s41576-019-0114-6.
16. Sansregret L, Vanhaesebroeck B, Swanton C. Determinants and clinical implications of chromosomal instability in cancer. Nat Rev Clin Oncol 2018; 15 (3): 139–50.
17. Bakhoum SF, Cantley LC. The multifaceted role of chromosomal instability in cancer and its microenvironment. Cell. 2018; 174 (6): 1347–60. doi: 10.1016/j.cell.2018.08.027.
18. Turajlic S, Swanton C. Metastasis as an evolutionary process. Science. 2016; 352 (6282): 169–75. doi: 10.1126/science.aaf2784.
19. Trautmann K, Terdiman JP, French AJ, et al. Chromosomal instability in microsatellite-unstable and stable colon cancer. Clin Cancer Res 2006; 12 (21): 6379–85. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-06-1248.
20. Buchynska L, Brieieva O, Glushchenko N, et.al. DNA repair deficiency in peripheral blood lymphocytes of endometrial cancer patients with a family history of cancer. BMC Cancer 2014; 14: 765. doi: 10.1186/1471-2407-14-765.
21. Бучинська ЛГ, Брєєва ОВ, Несіна ІП, та ін. Особливості репарації ДНК у лімфоцитах периферичної крові та пухлинній тканині хворих на рак ендометрію. Онкология 2016; 18 (4): 300–4.
22. Buchynska LG, Brieieva OV. Sensitivity to 4-hydroxyestradiol and DNA repair efficiency in peripheral blood lymphocytes of endometrial cancer patients. Exp Oncol 2018; 40 (1): 68–72.
23. Madireddy А, Kosiyatrakul ST, Boisvert RA, et al. Schildkraut FANCD2 facilitates replication through common fragile sites. Molecular Cell 2016; 64: 388–404. doi: 10.1016/j.molcel.2016.09.017.
24. Gachechiladze M, Skarda J, Bouchalova K, et al. Predictive and prognostic value of DNA damage response associated kinases in solid tumors. Front Oncol 2020; 10: 581217. doi: 10.3389/fonc.2020.581217.
25. Verlinden L, Bempt IV, Eelen G, et al. The E2F-regulated gene Chk1 is highly expressed in triple-negative estrogen receptor−/progesterone receptor−/HER-2−breast carcinomas. Cancer Res 2007; 67: 6574–81. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-3545.
26. Madoz-Gúrpide J, Cañamero M, Sanchez L, et al. A proteomics analysis of cell signaling alterations in colorectal cancer. Mol Cell Proteom 2007; 6: 2150–64. doi: 10.1074/mcp.M700006-MCP200.
27. Fadaka AO, Bakare OO, Sibuyi NRS, Klein A. Gene expression alterations and molecular analysis of CHEK1 in solid tumors. Cancers (Basel) 2020; 12 (3): 662. doi: 10.3390/cancers12030662.
28. Pichierri P, Rosselli F. The DNA crosslink-induced S-phase checkpoint depends on ATR–CHK1 and ATR–NBS1–FANCD2 pathways. EMBO J 2004; 23 (5): 1178–87. doi: 10.1038/sj.emboj.7600113.
29. Barlin JN, Soslow RA, Lutz M, et al. Redefining stage I endometrial cancer: incorporating histology, a binary grading system, myometrial invasion, and lymph node assessment. Int J Gynecol Cancer 2013; 23 (9): 1620–28. doi: 10.1097/IGC.0b013e3182a5055e.
30. Soslow RA, Tornos C, Park KJ, et al. Endometrial carcinoma diagnosis: use of FIGO grading and genomic subcategories in clinical practice: recommendations of the International Society of Gynecological Pathologists. Int J Gynecol Pathol 2019; 38 (Suppl 1): S64–S74. doi: 10.1097/PGP.0000000000000518.
31. Nepal M, Che R, Ma Chi, et al. FANCD2 and DNA Damage. Int J Mol Sci 2017; 18 (8): 1804. doi: 10.3390/ijms18081804.
32. Ren L, Chen L, Wu W. Potential biomarkers of DNA replication stress in cancer. Oncotarget 2017; 8 (23): 36996–37008. doi: 10.18632/oncotarget.16940
33. Ngoi NYL, Sundararajan V, Tan DS. Exploiting replicative stress in gynecological cancers as a therapeutic strategy. Int J Gynecol Cancer 2020; 30 (8): 1224–38. doi: 10.1136/ijgc-2020-001277.
34. Cleary JM, Aguirre AJ, Shapiro GI, et al. Biomarker-guided development of DNA repair inhibitors. Mol Cell 2020; 78 (6): 1070–85. doi: 10.1016/j.molcel.2020.04.035.
35. Liao H, Ji F, Helleday T, Ying S. Mechanisms for stalled replication fork stabilization: new targets for synthetic lethality strategies in cancer treatments. EMBO Rep 2018; 19 (9): e46263. doi: 10.15252/embr.201846263.
36. Mhawech-Fauceglia P, Wang D, Kim G, et al. Expression of DNA repair proteins in endometrial cancer predicts disease outcome. Gynecol Oncol 2014; 132 (3): 593–8. doi: 10.1016/j.ygyno.2014.02.002.

Адреса для листування:
Глущенко Н.М.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології iм. Р.Є. Кавецького
НАН України
E-mail: laboncogen@gmail.com
Одержано: 23.11.22