ОСОБЕННОСТИ РОСТА ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ДИФФУЗИОННЫХ КАМЕРАХ

ВВЕДЕНИЕ

Рак молочной железы (РМЖ) занимает ведущее место в структуре онкологических заболеваний женского населения, что обусловливает постоянный поиск новых, более эффективных методов диагностики и лечения этой патологии [1]. К известным факторам риска возникновения РМЖ относятся наследственная предрасположенность, отсутствие детей или рождение ребенка в зрелом возрасте, применение гормонов в постменопаузальный период, индекс массы тела [2]. С достаточно большой частотой имеет место развитие и доброкачественных опухолей, риск малигнизации которых достаточно значителен. С целью профилактики развития и ранней диагностики РМЖ проводят маммографические и ультразвуковые исследования, клиническое наблюдение за больными, гистологическое исследование операционного и биопсийного материала [3, 4].

Нередко при благополучном гистологическом диагнозе после удаления доброкачественной опухоли, больные вновь обращаются по поводу новообразования, которое, в значительном количестве случаев, имеет все признаки малигнизации [5]. В связи с этим приобретает несомненное значение поиск признаков, которые могут быть использованы в качестве прогнозирования малигнизации доброкачественных опухолей. Эти признаки, как правило, основаны на сравнительном изучении свойств клеток доброкачественных и злокачественных опухолей. В качестве примера можно привести определение онкогенов и их продуктов, маркеров апоптоза, рецепторов гормонов и факторов роста. Показано, что высокая экспрессия р53, онкопро-

теина с-erbB-2, TGFβ играет важную роль в развитии аденокарциномы in situ [6]. Оценить биологическую агрессивность и метастатический потенциал опухолей молочной железы (МЖ) можно и при изучении клеточной пролиферации (экспрессия Ki-67, PCNA) [7–9].

Ранее нами для изучения особенностей роста доброкачественных опухолей МЖ (фиброаденоматоз) и формирования групп риска был разработан метод культивирования эксплантатов опухолей в диффузионных камерах. Результаты исследований показали, что у всех больных, в культуре эксплантатов которых были выявлены множественные конгломераты (плотно прилегающие друг к другу клетки) и сфероиды (упорядоченные колониеподобные структуры с признаками спиральной ориентации, которые на фильтрах диффузионных камер имеют вид полусфер) [10], по истечении года был установлен диагноз: РМЖ с метастазами в подмышечных лимфатических узлах [11].

Продолжая это направление исследований, для получения новых дополнительных критериев характеристики опухолей МЖ нами было проведено сравнительное изучение особенностей роста как доброкачественных, так и злокачественных опухолей МЖ параллельно с изучением противоопухолевого действия неактивированных и активированных лимфоцитов периферической крови больных по отношению к аутологичным опухолевым клеткам.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опухолевая ткань и лимфоциты периферической крови (ЛПК) были получены от пациенток с доброкачественными и злокачественными

опухолями МЖ, на что пациентки дали информированное согласие. Всего изучены материалы от 20 больных (8 — с диагнозом карцинома МЖ и 12 — с фиброаденомами (7), фибрознокистозными мастопатиями (2), фиброаденоматозам (1), папилломой с изъязвлениями (1), макромастией (1)), находящихся на стационарном лечении в отделении хирургии Киевской больницы № 1. У 3 был диагностирован РМЖ II, у 4 — III стадии заболевания.

При исследовании опухолевой ткани использо-

вали эксплантаты опухоли (кусочки опухолевой ткани размером до 0,2 мм3). ЛПК выделяли из цельной гепаринизированной крови (из локтевой вены больных, натощак) путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина.

Для получения ЛАК клетки инкубировали с ронколейкином-2 (1000 МЕ/мл; БИОТЕХ, Россия) на протяжении 2 ч при 37 °С, затем 2 раза отмывали.

Рост опухолевых клеток (ОК) и их взаимодействие с лимфоцитами изучали при их совместном культивировании в диффузионных камерах. Клетки культивировали на протяжении 5 сут в полной среде RPMI-1640 (Sigma, США) при 37 °С и 5% СО2. После окончания срока культивирования фильтры диффузионных камер фиксирова-

ли, окрашивали гематоксилином Караччи, про-

водили через спирты возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле, готовили препараты с использованием канадского бальзама и микроскопировали.

Для характеристики опухолевого роста использовались следующие морфологические критерии: деструкция опухолевых клеток, отсутствие миграции клеток из эксплантата; миграция единичных опухолевых клеток, расселение опухолевых клеток по фильтру и образование монослоя различной плотности; наличие конгломератов клеток; образование сфероидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование особенностей роста эксплантатов злокачественных и доброкачественных опухолей МЖ при их культивировании в диффузионных камерах выявило определенные отличия. Рост эксплантатов злокачественных опухолей характеризовался выраженной интенсивностью: активная миграция клеток из эксплантатов, расселение по всему фильтру диффузионной камеры, образование разных по размеру участков монослоя низкой и средней плотности; в одном случае наблюдались начальные этапы образования конгломератов клеток. В отличие от этого рост эксплантатов доброкачественных опухолей был незначительным, наблюдали только миграцию единичных клеток вокруг эксплантата и лишь в одном случае начальные этапы образования монослоя (рис. 1, 2).

Рис. 1. Рост ОК больной с диагнозом карцинома МЖ (культивирование в диффузионной камере), х 400

Рис. 2. Отсутствие миграции клеток из эксплантата опухоли больной с диагнозом фиброаденома (культивирование в диффузионной камере), х 400

Изучение противоопухолевого действия неактивированных ЛПК и лимфокинактивированных клеток (ЛАК) показало, что оно проявляется по-разному в отношении клеток доброкачественных и злокачественных опухолей. Так, если у всех больных с карциномами действие ЛПК характеризовалось миграцией из эксплантатов единичных клеток и отсутствием монослоя, в сравнении с выраженным монослоем различной плотности и начальными этапами образования конгломератов ОК в контроле, то противоопухолевое действие ЛПК пациентов с доброкачественными опухолями было выражено незначительно и наблюдалось только в 4 случаях из 12. При сочетанном культивировании неактивированных ЛПК и эксплантатов доброкачественных опухолей практически не отмечали различия с ОК в контроле (культивирование эксплантатов опухолей без ЛПК) (табл. 1, 2).

Действие аутологичных ЛАК в отношении клеток

злокачественных опухолей было хорошо выражено: у 2 больных отмечали деструкцию ОК; в остальных случаях противоопухолевое действие приводило к угнетению роста ОК по сравнению с контролем. Действие же ЛАК относительно доброкачественных

Рост эксплантатов злокачественных опухолей под влиянием ЛПК и ЛАК

Таблица 1

Рост эксплантатов доброкачественных опухолей под влиянием ЛПК и ЛАК

Таблица 2

клеток практически не отличалось от действия неактивированных ЛПК этих больных.

Суммируя полученные результаты можно констатировать, что противоопухолевое действие как неактивированных ЛПК, так и ЛАК проявляется активно только в отношении эксплантатов больных со злокачественными опухолями, в то время как относительно доброкачественных опухолей практически отсутствует.

Полученные нами данные о различном характере роста эксплантатов доброкачественных и злокачественных опухолей МЖ можно попытаться объяснить, используя данные литературы, которые отражают биологические характеристики клеток этих опухолей, в частности, особенности в экспрессии молекулярных маркеров. Изучение экспрессии молекул контроля клеточного цикла и TGFβ показало различие экспрессии этих маркеров клетками злокачественной опухоли по сравнению с клетками карциномы in situ и клетками доброкачественной опухоли МЖ [6]. Различия пролиферативных свойств клеток доброкачественных и злокачественных опухолей МЖ выявлены в системе in vitro при помощи люминисцентных методов. Отмечено, что уровень АТФ-люминесценции клеток злокачественной опухоли был значительно

выше по сравнению с клетками доброкачественной опухоли и нормальной тканью МЖ [7].

Более высокая противоопухолевая активность цитотоксических ЛПК больных со злокачественными опухолями совпадает с исследованиями других авторов, которые использовали иные субпопуляции клеток. Так, у пациентов со злокачественной опухолью МЖ активность естественных киллеров (ЕК) в отношении клеток линии К562 была значительно выше в сравнении с таковой больных с доброкачественными опухолями и здоровыми донорами [12, 13]. Отмечены различия функциональной активности цитотоксических клеток по отношению к доброкачественным и злокачественным ОК яичника, а также различия количественного характера между асцитной жидкостью и периферической кровью (ПК) больных со злокачественными опухолями яичника. При изучении субпопуляций CD3+CD56+ ЕК Т-лимфоцитов и CD3–CD56+ ЕK ПК больных с доброкачественными и злокачественными опухолями яичника не установлены различия в количестве клеток. Однако разное количество этих клеток отмечали в асцитной жидкости и ПК больных раком яичника [14]. Различия отмечены при изучении метаболической активности еще одной популяции

клеток, способных к цитотоксическому действию — нейтрофилов ПК больных с доброкачественными и злокачественными опухолями яичника. У больных со злокачественными опухолями отмечали значительную активность нейтрофилов [15].

Наши данные согласуются также с исследованиями, в которых отмечена высокая цитотоксическая активность мононуклеаров ПК, активированных интерлейкином (ИЛ)-2, больных со злокачественными опухолями МЖ в отношении клеток линии МСF-7 (позитивная по рецепторам эстрогенов линия клеток МЖ). Подобной активности активированных мононуклеаров здоровых доноров не наблюдали [16]. Эти данные также могут быть использованы и при обсуждении результатов, полученных нами. Речь идет о том, что если в наших исследованиях изучали действие аутологичных лимфоцитов в отношении доброкачественных и злокачественных ОК, то в предыдущей работе использовали лимфоциты больных со злокачественными опухолями и лимфоциты здоровых доноров. Возникает вопрос: почему в обоих исследованиях наиболее выраженный эффект связан с использованием ЛАК, полученных от больных? Такое действие ЛАК может быть обусловлено тем, что у больных со злокачественными опухолями лимфоциты преактивированы антигенами опухолей и активация ИЛ-2 существенно усиливает их противоопухолевое действие [17]. К этому следует добавить, что противоопухолевая активность ЛАК также может быть связана с усилением пролиферации лимфоцитов и продукцией цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, TNFα) этими клетками, увеличением количества CD3+-лимфоцитов и индукторных Т-хелперов. Действие ИЛ-2 приводит к повышению экспрессии нормальными киллерами молекул адгезии (CD18, CD54, CD58, CD56), что усиливает их взаимодействие с опухолевыми клеткамимишенями [18, 19].

Таким образом, результаты настоящих исследо-

ваний и данные, полученными нами ранее, позволяют прийти к заключению, что изучение характера роста эксплантатов доброкачественных опухолей в сочетании с определением противоопухолевой активности аутологичных лимфоцитов больных, могут быть важным прогностическим критерием малигнизации опухолей. Учет этих критериев, возможно в комплексе с другими показателями, может быть использован для формирования групп риска больных с доброкачественными заболеваниями МЖ, а следовательно дает основание выработать тактику наблюдения за указанными больными.

ВЫВОДЫ

1. В характере роста эксплантатов злокачественных и доброкачественных опухолей МЖ выявлены существенные различия.

2. Активированные ИЛ-2 лимфоциты периферической крови больных с доброкачественными опухолями практически не обладают противоопухолевой активностью в отношении аутологичных эксплантатов опухолей.

3. Действие аутологичных ЛАК в отношении клеток злокачественных опухолей хорошо выражено.

ЛИТЕРАТУРА

1. Franek G, Wilczek B, Chłopecka H. The role of education in creating wholesome manners on the base of the programme concerning breast cancer prevention among women. Wiad Lek 2002; 55 (Supple 1, Pt 2): 673–8.

2. Reinier KS, Vacek PM, Geller BM. Risk factors for breast carcinoma in situ versus invasive breast cancer in a prospective study of pre- and post-menopausal women. Breast Cancer Res Treat 2007; 103 (3): 343–8.

3. Shin S, Schneider HB, Cole FJ Jr, et al. Follow-up recommendations for benign breast biopsies. Breast J 2006; 12 (5): 413–7.

4. Ben Hassouna J, Damak T, Ben Slama A, et al. Breast carcinoma arising within fibroadenomas. Report of four observations. Tunis Med 2007; 85 (10): 891–5.

5. Erbas B, Provenzano E, Armes J, et al. The natural history of ductal carcinoma in situ of the breast: a review. Breast Cancer Res Treat 2006; 97 (2): 135–44.

6. García-Tuñón I, Ricote M, Ruiz A, et al. Cell cycle control related proteins (p53, p21, and Rb) and transforming growth factor beta (TGFbeta) in benign and carcinomatous (in situ and infiltrating) human breast: implications in malignant transformations. Cancer Invest 2006; 24 (2): 119–25.

7. Loo WT, Tong JM, Cheung MN, et al. A new predictive and prognostic marker (ATP bioluminescence and positron emission tomography) in vivo and in vitro for delivering adjuvant treatment plan to invasive breast tumor patients. Biomed Pharmacother 2006; 60 (6): 285–8.

8. Papantoniou V, Tsiouris S, Koutsikos J, et al. Scintimammographic detection of usual ductal breast hyperplasia with increased proliferation rate at risk for malignancy. Nucl Med Commun 2006; 27 (11): 911–7.

9. Ioachim EE, Athanassiadou SE, Kamina S, et al. Matrix metalloproteinase expression in human breast cancer: an immunohistochemical study including correlation with cathep- sin D, type IV collagen, laminin, fibronectin, EGFR, c-erbB-2 oncoprotein, p53, steroid receptors status and proliferative indices. Anticancer Res 1998; 18 (3A): 1665–70.

10. Lin RZ, Chang HY. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J 2008; 3 (9–10): 1172–84.

11. Яхимович ЛВ, Семенова-Кобзарь РА, Бережная НМ. Использование метода диффузионных камер для прогнозирования течения фиброаденоматоза. Информационное письмо, 1985. 12 с.

12. Wiltschke C, Tyl E, Speiser P, et al. Increased natural killer cell activity correlates with low or negative expression of the HER-2/neu oncogene in patients with breast cancer. Cancer 1994; 73 (1): 135–9.

13. Andrianov IG, Dobkin AN, Kiselev OI, et al . Immunomodulating activity of natural killers in patients with breast tumors using vasopressin and interleukin 2 in vitro. Vopr Onkol 1989; 35 (10): 1186–91.

14. Lamkin DM, Lutgendorf SK, McGinn S, et al. Positive psychosocial factors and NKT cells in ovarian cancer patients. Brain Behav Immun 2008; 22 (1): 65–73.

15. Kondera-Anasz Z, Mielczarek-Palacz A, Switała J, et al. Metabolic activity of peripheral blood neutrophils in women with ovarian tumours. Ginekol Pol 2004; 75 (8): 609–14.

16. Kamamura Y, Takahashi K, Komaki K, et al. Effects of interferon-alpha and gamma on development of LAK activity from mononuclear cells in breast cancer patients. J Med Invest 1998; 45 (1–4): 71–5.

17. Берeжная НМ, Горецкий БА. Интерлейкин-2 и злокачественные новообразования. Киев: Наук думка, 1992. 176 с.

18. Savas B, Kerr PE, Pross HF. Lymphokine-activated killer cell susceptibility and adhesion molecule expression of multidrug resistant breast carcinoma. Cancer Cell Int 2006; 6: 24.

19. Ostanin AA, Chernykh HR, Leplina OY, et al. IL-2-activated killer cells and native cytokines in treatment of patients with advanced cancer. Russ J Immunol 1997; 2 (3–4): 167–76.

formation of monolayers with low and medium density. Antitumor efficiency of nonactivated PBL and activated by IL-2 peripheral blood lymphocytes from the patients with malignant was higher than ones from the patients with benign disease. The obtained data may be useful as an additional important criterion of mammary gland malignization.