ДОКЛІНІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ЛЕКТИНУ B. SUBTILIS IMВ В-7724 НА ДИНАМІКУ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ МАКРОФАГІВ ПРИ ПЕРЕЩЕПЛЕННІ ЧУТЛИВОЇ АБО ХІМІОРЕЗИСТЕНТНОЇ МОДЕЛЬНОЇ ПУХЛИНИ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-1-2021-g.9409

Однією з головних причин недостатньої ефективності лікування хворих зі злоякісними пухлинами вважають резистентність пухлинних клітин до засобів хіміотерапії. Основною метою використання цього методу лікування є досягнення максимальної циторедукції первинної пухлини або метастатичних вогнищ за рахунок пригнічення неконтрольованої проліферації, індукції процесів апоптозу або некрозу злоякісно трансформованих клітин. Результат лікування цитостатиками залежить від біологічних особливостей пухлинних клітин, їх чутливості або стійкості до використаних терапевтичних засобів. При застосуванні цитостатиків, до яких пухлинні клітини нечутливі, відбувається пригнічення протипухлинної резистентності організму (імуносупресія), що спричиняє ріст резистентних клонів трансформованих клітин і швидкий розвиток віддалених метастазів. Тому підвищення ефективності хіміотерапії включає і подолання множинної медикаментозної резистентності, і підвищення чутливості клітин пухлини до протипухлинних препаратів [1–3].

Терапевтична чутливість пухлин значною мірою залежить від складної взаємодії трансформованих клітин з різними компонентами мікросередовища пухлини. Клітинні компоненти мікрооточення включають мезенхімальні та ендотеліальні клітини, асоційовані з пухлиною фібробласти та макрофаги (Мф). Останнім часом значну увагу приділяють ролі пухлиноасоційованих Мф (ПАМ) у формуванні протипухлинної відповіді. ПАМ вважають головним вродженим імунним компонентом мікросередовища солідних пухлин. Продукуючи різні фактори та впливаючи на інші імунні клітини, Мф беруть участь не тільки в розвитку хронічного запалення, але й у прогресуванні або стримуванні пухлинного процесу. Зокрема, такі фактори, як орнітин, фактор росту ендотелію судин (Vascular endothelial growth factor — VEGF), епідермальний фактор росту (Epidermal Growth Factor — EGF), і трансформуючий фактор росту β (Transforming growth factor β — TGF-β) стимулюють пухлинний процес, тоді як оксид азоту (NO), що утворюється в результаті активації індукованої NO-синтази (Inducible nitric oxide synthase — iNOS) в Мф, може інгібувати ріст пухлини [4]. Було продемонстровано, що Мф безпосередньо чи опосередковано залучені до кількох ключових процесів канцерогенезу, включаючи ангіогенез, інвазію, метастазування, регуляцію мікросередовища пухлини та виникнення терапевтичної стійкості [5, 6]. ПАМ виявляють виражену неоднорідність та фенотипову пластичність. Існує два основних напрямки фенотипової та функціональної поляризації Мф: класично активовані прозапальні Мф М1 з протипухлинними властивостями та альтернативно активовані протизапальні Мф М2, які спричиняють пухлинний процес. Альтернативно активовані Мф М2 можуть опосередковувати хіміорезистентність, секретуючи фактори росту та інгібуючи шляхи передачі сигналів клітинної смерті в клітинах пухлини, захищаючи їх від цитотоксичних ефектів хіміотерапії [7]. У більшості солідних пухлин ПАМ мають яскраво виражений фенотип М2. Однак також існують експериментальні дані, які свідчать про те, що ПАМ можуть поєднувати властивості Мф М1 та М2 або можлива реполяризація цих клітин [8–10]. Тому дослідження можливості зміни поляризації Мф видається перспективним як з наукової, так і клінічної точок зору.

На теперішній час однією з найбільш поширених в усьому світі (включаючи Україну) форм злоякісних новоутворень жінок є рак молочної залози (РМЗ). Зокрема, за даними Національного канцер-реєстру України за 2019–2020 рр., питома вага РМЗ в структурі захворюваності на злоякісні новоутворення жіночого населення України становила 20,3%, в структурі смертності — 20,1% [11]. Залежно від молекулярно-біологічних характеристик пухлинних клітин, при лікуванні хворих на РМЗ використовують хіміотерапію, гормонотерапію, імунотерапію чи їх комбінацію. Незважаючи на досягнення в дослідженні молекулярних механізмів виникнення та прогресування цього захворювання, розробка і впровадження цих методів, ефективність терапії залишається недостатньою. Однією з причин цього є хіміорезистентність пухлинних клітин (первинна чи набута). Для подолання проблеми резистентності пропонують комбіноване використання різних терапевтичних опцій, зокрема, хіміопрепаратів та засобів імунотерапії.

Із переліку хіміотерапевтичних препаратів у стандартних схемах лікування при різних молекулярних підтипах РМЗ широко використовують доксорубіцин (DOX) [12–14]. Серед засобів, які можуть бути перспективними в лікуванні хворих з різноманітними злоякісними пухлинами, досліджуються лектини. Привертають увагу не лише цитотоксичні, а й імуномодулюючі властивості останніх, що дозволяє розглядати лектини як потенційні засоби імунотерапії [15–18].

Інформативною експериментальною моделлю, морфологічні характеристики та особливості перебігу якої подібні до таких у РМЗ людини є карциносаркома Уокера-256. Ця модель дозволяє послідовно відтворювати процеси, що відбуваються на всіх стадіях канцерогенезу протягом нетривалого періоду часу [19]. Пухлина характеризується швидким ростом, агресивністю, інвазивністю та здатністю до метастазування. Перебіг пухлинного процесу у щурів супроводжується значною резорбцією кісток і збільшенням ламкості скелету, що корелює з процесом метастазування у кістки людей, хворих на РМЗ [19, 20]. Було отримано резистентний до засобів хіміотерапії (зокрема DOX) штам цієї пухлини, опубліковано результати досліджень щодо метаболічних змін (показники енергетичного обміну, вмісту К+ і Мg++ в організмі і в пухлині) на тлі розвитку резистентної до DOX карциносаркоми Уокера-256, а також охарактеризована роль клітин імунної системи у формуванні такої резистентності [21, 22]. Викладене зумовило вибір експериментальної моделі та загальний дизайн нашого дослідження.

Метою роботи стало визначення показників функціональної поляризації перитонеальних Мф щурів у динаміці росту різних за чутливістю до DOX штамів карциносаркоми Уокера-256 за умови застосування DOX або лектину B. subtilis ІМВ В-7724.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведені на щурах лінії Wistar (самки віком 2,5 міс та масою тіла 180–200 г). Тварини були надані віварієм Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького Національної академії наук України. Під час проведення експерименту щури перебували в стандартних умовах віварію з природним режимом освітлення, на повноцінному раціоні харчування. Утримання тварин і робота з ними здійснювалися відповідно до загальноприйнятих міжнародних правил проведення досліджень на експериментальних тваринах [23].

У якості моделей пухлинного росту використано два різних за чутливістю до DOX штами карциносаркоми Уокера-256 — вихідний і резистентний. Пухлинні клітини обох штамів одержували з Банку клітинних ліній з тканин людини та тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіо­біології ім. Р.Є. Кавецького Національної академії наук України. Резистентність пухлини було індуковано, як описано I.N. Todor et al. [22]. Перещеплення пухлинних клітин проводили у стегно правої задньої кінцівки в кількості 1×10⁶ клітин у фізіологічному розчині NaCl.

Для кожного штаму карциносаркоми Уокера-256 були сформовані по 3 групи: «Контроль пухлинного росту» або «КПР» — неліковані щури з пухлиною; «DOX» — щури з пухлиною, яким в якості засобу хіміотерапії вводили DOX; «Лектин» — щури з пухлиною, яким в якості засобу імунотерапії вводили лектин B. Subtilis ІМВ В-7724 [24–26].

Лікування тварин починали на 7-му добу пухлинного росту, використовуючи в монорежимі DOX (внутрішньочеревно, 0,250 мг/тварину в 0,3 мл фізіологічного розчину NaCl, щоденно, протягом 5 діб) або лектин B. Subtilis ІМВ В-7724 (підшкірно, по 0,2 мг/тварину в 0,2 мл фізіологічного розчину NaCl, щоденно, протягом 5 діб). Отримані результати порівнювали з даними інтактних щурів тієї ж лінії, віку і статі.

Проводили оцінку стандартних параметрів пухлинного росту (частота прищеплення пухлин, розмір первинного пухлинного вузла, виживаність тварин з пухлиною). Оцінку показників функціонального стану Мф, виділених з перитонеальної порожнини, проводили на 7-му та 22-гу добу пухлинного росту. Дослідження включало визначення рівня продукції NO та активності аргінази (Arg). Тип поляризації Мф визначали за співвідношенням показників NO/Arg.

Перитонеальні Мф отримували, використовуючи метод ступінчастого центрифугування на подвійному градієнті густини з фікол-урографіном (1,114 г/мл і 1,076 г/мл) протягом 15 хв при 250 g з наступним гіпотонічним лізисом домішок еритроцитів. Після цього 1 мл клітинної суспензії відбирали у пластикову мікропробірку, інкубували при 37 °С протягом 24 год, осаджували методом центрифугування. Надосад використовували для оцінки рівня продукції NO; осад клітин — для визначення активності Arg. У дослідженнях використовували кінцеву концентрацію 1×10⁶ клітин/мл.

Продукцію NO (за кількістю NO2-) визначали за методикою [20] з використанням реактиву Грісса (ACROS Organics, United Kindom). Облік результатів проводили спектрофотометричним методом при довжині хвилі збудження 550 нм. Рівень NO визначали за калібрувальною кривою, побудованою з використанням стандартних розчинів нітриту натрію. Рівень NO представляли в ммоль NO^2-/10⁶ клітин.

Активність Arg визначали за швидкістю утворення сечовини [27, 28]. Реакцію зупиняли додаванням суміші кислот (Н₂SO₄:H₃PO₄:H₂O). Для колориметричного визначення концентрації сечовини до суміші додавали α-ізонітрозопропіофенон та інкубували при 95 °С упродовж 30 хв, а потім при 4 °С 30 хв. Концентрацію сечовини визначали спектрофотометрично при довжині хвилі збудження 550 нм. Значення оптичної густини переводили в мікрограми, використовуючи калібрувальну криву, побудовану за розчинами сечовини відомої концентрації. Активність Arg розраховували за методикою R.S. Dovgiyі співавторів [29]. Одна одиниця аргіназної активності — кількість ферменту, що гідролізує 1 мкмоль аргініну за 1 хв. Дані представлені в од./10⁶ клітин.

Статистичну обробку результатів проводили за загально прийнятими методами варіаційної статистики [30]. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними вимірами оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними показниками при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Карциносаркома Уокера-256 розвинулася у 100% тварин незалежно від групи. В обох групах нелікованих щурів відмічали швидкий ріст пухлин, особ­ливо за умови перещеплення резистентної до DOX карциносаркоми.

Як і слід було сподіватися, штами пухлини по-різному реагували на введення DOX. Так, на 22-гу добу пухлинного росту у щурів з вихідним штамом карциносаркоми, яким вводили DOX, об’єм пухлин був статистично достовірно меншим (на 61%, p<0,05) порівняно з показником групи «КПР». У щурів з резистентними до DOX пухлинами проведення хіміотерапії було неефективним (рис. 1).

Натомість застосування лектину B. subtilis IMB B-7724 сприяло уповільненню росту пухлин незалежно від того, який за чутливістю до DOX штам карциносаркоми Уокера-256 було перещеплено: у щурів, яким вводили бактеріальний лектин, спостерігали статистично достовірне (p<0,05) зменшення розміру первинного пухлинного вузла порівняно з тваринами контрольної групи (рис. 1).

Дослідження змін функціональної активності перитонеальних Мф на тлі росту пухлини включало визначення рівня продукції NO та оцінку аргіназної активності на 7-му та 22-гу добу пухлинного росту. Відомо, що метаболізм аргініну в Мф з різними функціональними властивостями (М1 та М2) суттєво відрізняється. Зокрема, експресований в Мф М1 фермент iNOS метаболізує аргінін до NO та цитруліну. У свою чергу, NO може бути метаболізований для подальшого виходу реактивних форм азоту, тоді як цитрулін може бути використаний для ефективного синтезу NO через цикл цитрулін — NO. Arg, яка експресується в Мф М2, гідролізує аргінін до орнітину та сечовини. Активація аргіназного шляху обмежує доступність аргініну для синтезу NO, а сам орнітин може бути додатково задіяний у важливих шляхах синтезу поліаміну та проліну, які необхідні для клітинної проліферації та відновлення тканин. Обидва метаболічні шляхи перехресно інгібують один одного на рівні відповідних продуктів розпаду аргініну, що і зумовлює більш точне визначення М1 або М2 поляризаційного статусу Мф [31].

Мф, отримані з перитонеальної порожнини інтактних щурів, характеризувалися високим рівнем продукції NО (42,4±1,0 ммоль NO^2-/10⁶ клітин) та низькою активністю Arg (2,22±0,09 од/10⁶ клітин). Незалежно від того, який варіант карциносаркоми було перещеплено, на 7-му добу пухлинного росту за функціональною активністю Мф щурів з пухлинами практично не відрізнялися від таких у інтакт­них тварин. У щурів з чутливими до DOX пухлинами показник співвідношення NO/Arg становив 16,0, з резистентними —16,2, у інтактних тварин — 19,1.

На 22-гу добу пухлинного росту у нелікованих щурів з вихідним штамом карциносаркоми рівень продукції NО суттєво не змінювався і становив 41,03 ммоль NO^2-/10⁶ клітин (рис. 2). У той час як показник активності Arg достовірно зростав (2,81±0,05 од/10⁶ клітин проти 2,2±0,05 од/10⁶ клітин на 7-му добу, р<0,05), що призводило до зменшення співвідношення NO/Arg в 1,1 разу порівняно з аналогічним показником на 7-му добу росту пухлини. Така динаміка показників функціональної активності свідчить, що в процесі росту пухлин у тварин цієї групи відбувалося поступове зменшення кількості Мф М1 та збільшення кількості клітин з фенотипом М2. Для тварин, яким вводили DOX, характерним було збереження популяції Мф з фенотипом М1 і на термінальних стадіях пухлинного процесу (рівень співвідношення NO/Arg в 1,6 разу перевищував такий у нелікованих щурів, р<0,05). У групі тварин, яким вводили лектин, зазначені зміни були виражені більшою мірою. За рахунок підвищення синтезу NO та зниження активності Arg рівень співвідношення NO/Arg в цей термін становив 33,2, перевищуючи відповідні показники групи КПР та інтактних щурів в 2,3 та 1,7 раза відповідно (р<0,05) (рис. 2а).

У контрольних щурів з резистентним до DOX штамом карциносаркоми на 22-гу добу пухлинного росту спостерігали статистично достовірне зниження рівня продукції NО (27,05 ммоль NO2-/10⁶ проти 34,0±0,7 ммоль NO2-/10⁶ на 7-му добу, р<0,05) та підвищення активності Arg (2,5±0,01 проти 2,1±0,01 на 7-му добу, р<0,05). Достовірної різниці за цими показниками між групами щурів, які отримали курс хіміотерапії з використанням DOX, та нелікованими тваринами (рис. 2б) не спостерігали. Потрібно відмітити, що застосування бактеріального лектину в якості засобу імунотерапії у цих тварин призвело до суттєвого підвищення продукції NO перитонеальних Мф порівняно з показниками тварин усіх досліджуваних груп (див. рис. 2б). Такі результати дозволяють говорити про превалювання у тварин цієї групи протягом усього терміну спостереження Мф з фенотипом М1.

аб

Рис. 2. Зміни показників функціональної активності перитонеальних Мф щурів з вихідним (а) та резистентним (б) до DOX штамами карциносаркоми Уокера-256 при введенні DOX або лектину B. subtilis IMB B-7724

Таким чином, отримані нами результати свідчать про поступову зміну функціональної поляризації перитонеальних Мф нелікованих щурів на пізніх термінах росту карциносаркоми Уокера-256. Розвиток пухлинного процесу супроводжувався поглибленням імуносупресії та збільшенням кількості Мф з пропухлинними властивостями (альтернативно активовані Мф М2). Такі зміни були більше виражені у щурів з резистентним до DOX штамом карциносаркоми, який характеризується швидким та агресивним ростом пухлин. Введення лектину B. subtilis ІМВ В-7724 сприяло збереженню протягом всього терміну спостереження в пулі перитонеальних Мф клітин М1-типу, що володіють прозапальними (протипухлинними) властивостями незалежно від чутливості пухлин до хіміотерапії. Це, най­імовірніше, сприяло гальмуванню росту первинної пухлини, яке спостерігали у щурів з карциносаркомою Уокера-256 незалежно від її штаму.

Виявлені кореляційні зв’язки між розміром первинного пухлинного вузла та показниками функціо­нальної активності Мф підтверджують висловлене нами припущення (таблиця). Між розміром пухлин та показниками, що вказують на приналежність Мф до фенотипу М1 (рівень продукції NO та співвідношення NO/Arg) виявлений сильний негативний зв’язок (p<0,05). У той же час кореляція з рівнем активності Arg, яка є характерною ознакою Мф з фенотипом М2, була сильною. Негативний кореляційний зв’язок між об’ємом пухлини та показниками функціональної активності Мф М1 вказує на те, що поляризовані за цим типом клітини відіграють значну роль у стримуванні пухлинного росту.

Таким чином, отримані результати свідчать, що у щурів з карциносаркомою Уокера-256 в процесі росту пухлини відбувається суттєве пригнічення протипухлинної активності Мф. Такі зміни виражені більшою мірою у щурів з резистентним штамом цієї модельної пухлини, ніж у тварин з вихідним штамом. Результати застосування у тварин з пухлиною лектину B. subtilis IMB B-7724 окремо заслуговують на увагу. Після проведення імунотерапії рівень співвідношення NO/Arg, який вказує на тип поляризації Мф, у віддалені терміни росту пухлини (на 22-гу добу) статистично достовірно перевищував показники як контрольних щурів з пухлиною, так й інтактних тварин. Такі результати дозволяють говорити про превалювання у тварин (як з чутливим, так і, що дуже важливо, з резистентним до хіміотерапії штамами карциносаркоми) протягом усього терміну спостереження Мф з фенотипом М1. Механізми, за допомогою яких лектин впливав на функціо­нальну активність Мф, залишаються недостатньо з’ясованими. Що лише вказує на необхідність подальшого вивчення впливу цього лектину як на Мф зокрема, так і на ефектори протипухлинного захисту в цілому.

Отримані нами результати співпадають з даними літератури щодо дослідження ролі ПАМ та зокрема, клітин з фенотипом М1 або М2, в прогресуванні пухлинного процесу. У ряді досліджень продемонстровано, що ПАМ можуть спричиняти рецидив пухлини після проведення хіміотерапії, ініціюючи фізіологічну регенеративну програму, яка є сприятливою під час загоєння ран, але негативно впливає у разі розвитку пухлини. Шляхи, відповідальні за промоторну функцію ПАМ після проведення хіміотерапії та розвитку хіміорезистентності, включають збільшення кількості Мф з імуносупресивними функціями, пропухлинну поляризацію в напрямку клітин з фенотипом М2, знижену цитотоксичну відповідь Т-клітин, активацію антиапоптотичних програм у злоякісних клітинах [9, 10]. Зокрема, наведено дані, що ПАМ, які спричиняють стійкість пухлини до DOX, мають високу експресію CD68, CD206, CD163, PD-L1, але низьку — CD80 і CD86. Крім того, ці Мф продукують імуносупресивні цитокіни (IL10 та TGFβ), фактори, що спричиняють інвазію (MMP9, MMP13), проангіогенний фактор VEGF, що викликає реваскуляризацію. Це свідчить про переважання серед ПАМ клітин з пропухлинними властивостями — Мф М2-типу. Підвищена експресія PD-L1 обмежує реакцію пухлини на хіміотерапію шляхом пригнічення протипухлинних функцій цитотоксичних Т-клітин, що призводить до виживання та проліферації пухлинних клітин та формування хіміорезистентності [9]. Введення бактеріального лектину на тлі росту пухлини запобігало поляризації Мф в М2, а отже, ці та інші можливі пухлиностимулюючі ефекти проявлялися меншою мірою, що виразилося в значному інгібуванні росту пухлини. Тобто, розробка методів впливу на поляризацію Мф за допомогою лектину B. subtilis IMB B-7724 виглядає перспективною.

ВИСНОВКИ

1. Введення лектину B. subtilis IMB B-7724 мало виражений протипухлинний ефект у щурів з вихідним та резистентним до DOХ штамами карциносаркоми Уокера-256: у тварин, яким вводили бактеріальний лектин, спостерігали статистично достовірне (p < 0,05) гальмування росту первинного пухлинного вузла порівняно з показниками контрольної групи.

2. На тлі росту резистентного до DOX штаму карциносаркоми Уокера-256 зниження здатності до продукції NO та підвищення активності Arg для перитонеальних Мф були більш вираженими, порівняно з вихідним штамом пухлини: співвідношення NO/Arg в 1,8 раза (р < 0,05) менше за показник інтактних щурів та в 1,3 рази менше за показник тварин з вихідним штамом карциносаркоми (р > 0,05).

3. Застосування бактеріального лектину в якості засобу імунотерапії запобігало поляризації Мф в М2 навіть у віддалені терміни (22-га доба) росту карциносаркоми Уокера незалежно від чутливості пухлини до хіміотерапії.

Робота виконана за підтримки Цільової програми наукових досліджень Відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології Національної академії наук України («Молекулярно-біологічні фактори гетерогенності злоякісних клітин та варіабельність клінічного перебігу гормонозалежних пухлин», номер держреєстрації 0117U002034, 2017–2021) та конкурсу науково-дослідних робіт молодих учених Національної академії наук України («Функціональна активність фагоцитуючих клітин як предиктор ефективності протипухлинної дії доксорубіцину», номер держреєстрації 0119U102416, 2019–2020).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Ji X, Lu Y, Tian H, et al. Chemoresistance mechanisms of breast cancer and their countermeasures. Biomed Pharmacother 2019; 114: 108800.
• 2. Christowitz C, Davis T, Isaacs A, et al. Mechanisms of doxorubicin-induced drug resistance and drug resistant tumour growth in a murine breast tumour model. BMC Cancer 2019; 19: 757.
• 3. Micallef I, Baron B. Doxorubicin: an overview of the anti-cancer and chemoresistance mechanisms. Ann Clin Toxicol 2020; 3 (2): 1031.
• 4. Mills CD. Anatomy of a discovery: M1 and M2 macrophages. Front Immunol 2015; 6: 212.
• 5. Ruffell B, Coussens LM. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell 2015; 27 (4): 462–72.
• 6. Dudas J, Ladanyi A, Ingruber J, et al. Epithelial to mesenchymal transition: a mechanism that fuels cancer radio/chemoresistance. Cells 2020; 9 (2): 428.
• 7. Sun D, Luo T, Dong P, et al. M2-polarized tumor-associated macrophages promote epithelial-mesenchymal transition via activation of the AKT3/PRAS40 signaling pathway in intrahepatic cholangiocarcinoma. J Cell Biochem 2020; 121 (4): 2828–38.
• 8. O’Sullivan T, Saddawi-Konefka R, Vermi W, et al. Cancer immunoediting by the innate immune system in the absence of adaptive immunity. J Exp Med 2012; 209 (10): 1869–82.
• 9. Larionova I, Cherdyntseva N, Liu T, et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. Oncoimmunology 2019; 8 (7): 1596004.
• 10. D’Alterio C, Scala S, Sozzi G, et al. Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion. Semin Cancer Biol 2020; 60: 351–61.
• 11. Cancer in Ukraine, 2019–2020. Incidence, mortality, prevalence and other relevant statistic. Bull Natl Cancer Register Ukr; Kyiv, 2021; 22: http://www.ncru.inf.ua/publications/BULL_22. (in Ukrainian)
• 12. Pilco-Ferreto N, Calaf GM. Influence of doxorubicin on apoptosis and oxidative stress in breast cancer cell lines. Int J Oncol 2016; 49 (2): 753–62.
• 13. Zhao M, Ding XF, Shen JY, et al. Use of liposomal doxorubicin for adjuvant chemotherapy of breast cancer in clinical practice. J Zhejiang Univ Sci 2017; 18 (1): 15–26.
• 14. Pritchard JE, Dillon PM, Conaway MR, et al. A mechanistic study of the effect of doxorubicin/adriamycin on the estrogen response in a breast cancer model. Oncology 2012; 83 (6): 305–20.
• 15. Santos JVdO, Porto ALF, Cavalcanti IMF. Potential application of combined therapy with lectins as a therapeutic strategy for the treatment of bacterial infections. Antibiotics 2021; 10 (5): 520.
• 16. Oliveira Brito PKM, Gonçalves TE, Fernandes FF, et al. Systemic effects in naïve mice injected with immunomodulatory lectin ArtinM. PLoS One 2017; 12 (10): e0187151.
• 17. Mishra A, Behura A, Mawatwal S, et al. Structure-function and application of plant lectins in disease biology and immunity. Food Chem Toxicol 2019; 134: 110827.
• 18. Podgorskii VS, Kovalenko ÉA, Karpova IS, et al. Extracellular lectins from saprophytic strains of bacteria of the genus Bacillus (review). Prikl Biokhim Mikrobiol 2014; 50 (3): 256–63. (in Russian)
• 19. do Amaral LA, de Souza GHO, Santos MR, et al. Walker-256 tumor: experimental model, implantation sites and number of cells for ascitic and solid tumor development. Braz Arch Biol Technol 2019, 62 (12): e19180284.
• 20. Shenoy PA, Kuo A, Vetter I, Smith MT. The Walker 256 breast cancer cell-induced bone pain model in rats. Front Pharmacol 2016; 7: 286.
• 21. Boroday NV, Chekhun VF. Morphological features of doxorubicin-resistant Walker 256 carcinosarcoma and response of mast cells. Exp Oncol 2018, 40 (1): 42–7.
• 22. Todor IN, Lukianova NYu, Shvets YuV, et al. Metabolic changes during developmentof Walker-256 carcinosarcoma resistance to Doxorubicin. Exp Oncol 2015, 37 (1): 19–22.
• 23. Kozhemyakin UM, Filonenko MA, Saifetdinova GA. Scien­tific and Practical Recommendations for Keeping Laboratory Animals and Working with Them. K: Avicenna 2002; 156 p (in Ukrainian).
• 24. Podgorsky VS. The method for the obtainmen of bacterial lectin, specific to sialic acids (Pat. № 1791 UA). Publ. 23.01.1991. Bul. № 1. (in Ukrainian)
• 25. Fedosova NI, Cheremshenko NL, Hetman KI, et al. Physi­cal-chemical and cytotoxic properties of Bacillus subtilis IMV B-7724 extracellular lectin. Mikrobiol Z 2021; 83 (1): 39–48.
• 26. Chumak A, Shcherbina V, Fedosova N, Chekhun V. Polarization of macrophages of mice under the influence of lectin from Bacillus Subtilis IMV B-7724. EUREKA: Life Science 2021; (3): 3–10.
• 27. Reiner NE. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods Mol Biol 2009; 531: v-vi. doi: 10.1007/978–1-59745–396–7.
• 28. Corraliza IM, Campo ML, Soler G, Modolell M. Determination of arginase activity in macrophages: a micromethod. J Immunol Methods 1994; 174 (1–2): 231–5.
• 29. Dovgiy RS, Shitikov, D.V., Pishel, I.N., et al. Functional state and metabolic polarization of splenic macrophages of old immunized mice. Problemy stareniya i dolgoletiya 2015; 24 (2): 147. (in Russian)
• 30. Sidenko AB, Vishnyakov VV, Isaev SM. Theory of statistics. М: MAX-Press, 2011. 343 p. (in Russian)
• 31. Rath M, Müller I, Kropf P. Metabolism via arginase or nitric oxide synthase: two competing arginine pathways in macrophages. Front Immunol 2014, 5: 532.

Адреса для листування:
Чумак А.В.
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
iм. Р.Є. Кавецького НАН України
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
E-mail: immunomod@ukr.net

Одержано: 25.05.2021