РІВЕНЬ ДЕЯКИХ ПРО- ТА ПРОТИЗАПАЛЬНИХ ЦИТОКІНІВ У МИШЕЙ З ВИСОКОАНГІОГЕННОЮ КАРЦИНОМОЮ ЛЕГЕНІ ЛЬЮЇС НА ФОНІ ЗАСТОСУВАННЯ ПРОТИПУХЛИННИХ ВАКЦИН

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-22-3-2020-g.9043

Питання щодо вивчення механізмів патогенезу паранеопластичних синдромів (ПНС) та можливості їх корекції у хворих зі злоякісними пухлинами все ще залишаються актуальними [1, 2]. На сьогодні налічується близько 70 видів ПНС, причому їх перелік постійно поповнюється [1, 3, 4]; частота виникнення ПНС з прогресуванням пухлинного процесу зростає до 75% [4]. Серед порушень, що реєструють при пухлинному процесі, важливими з огляду на можливість проведення спеціального лікування, є гематологічні порушення, зокрема пухлиноасоційована анемія [3, 5]. Відомо, що пухлиноасоційована анемія погіршує стан хворого, негативно впливає на прогноз лікування та може бути обмеженням для проведення спеціального протипухлинного лікування [5, 6].

З метою корекції пухлиноасоційованої анемії у клінічній практиці вже використовують еритропоетини [7], але пошук та дослідження безпечніших щодо стимуляції пухлинного процесу засобів продовжуються. Так, на моделі штаму карциноми легені Льюїс LLC/R9 мишей [8], який характеризується високою швидкістю росту первинної пухлини, високим ангіогенним та низьким метастатичним потенціалом, а також формуванням на ранніх стадіях пухлинного росту ПНС [9, 10], досліджено можливість корекції асоційованої з ростом LLC/R9 анемії за допомогою поліфенолів винограду [11], сорбентів [12], а також протипухлинних вакцин (ПВ) [13]. Застосування поліфенолів та сорбентів хоча і призводило до коригування деяких проявів ПНС, але не впливало на ріст та метастазування LLC/R9 [11, 12].

Застосування ПВ на основі антигенів високо- (LLC/R9) або низькоангіогенного (LLC) штамів карциноми легені Льюїс у мишей з LLC/R9 підвищувало виживаність вакцинованих мишей із пухлиною, але не запобігало розвитку пухлиноасоційованої анемії та спленомегалії. Зазначимо, що застосування вакцини, виготовленої з клітин LLC, достовірно зменшувало кількість та об’єм метастазів, а також на пізніх стадіях пухлинного росту сприяло підвищенню цитотоксичної активності природних клітин-кілерів та запобігало негативному впливу пухлини на вагові та клітинні характеристики ти­мусу, специфічну цитотоксичну активність спленоцитів та макрофагів у присутності сироватки крові (СК) [13]. Однак у роботі [13] не досліджені рівні про- і протизапальних цитокінів та вплив на них ПВ у мишей із високоангіогенним варіантом LLC/R9. Також відомо, що пухлиноасоційована анемія опосередковується гуморальними факторами як пухлинної, так і імунної природи (продукуються ефекторними клітинами протипухлинної імунної відповіді) [3, 14], зокрема підвищенням рівня таких цитокінів, як фактор некрозу пухлини (ФНП)-α, інтерлейкін (ІЛ)-1, ІЛ-6, інтерферон-гамма (ІФН-γ). Надлишок зазначених цитокінів призводить до порушення утилізації заліза, супресії диференціювання клітин — попередників еритроцитів, некоректної продукції еритропоетину тощо [14, 15].

Мета проведеної роботи — дослідити рівень деяких про- та протизапальних цитокінів у мишей з високоангіогенною карциномою легені Льюїс (LLC/R9) на фоні застосування протипухлинних вакцин, виготовлених на основі антигенів високоангіогенної карциноми легені Льюїс або на основі її вихідного низькоангіогенного штаму.

ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Робота виконана на експериментальному матеріалі.

Експериментальні тварини. Використовували статевозрілих мишей-самців лінії C₅₇Bl/6 (вік — 2–2,5 міс, маса тіла 20–23 г), які одержані з розплідника віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології (ІЕПОР) ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин та роботу з ними здійснювали відповідно до загальноприйнятих міжнародних правил з біоетики щодо проведення робіт з експериментальними тваринами [16, 17].

Пухлинні штами та протипухлинні вакцини. У дослідженнях використовували два різні за ангіогенним потенціалом штами експериментальних пухлин карциноми легені Льюїс (LLC) (вихідний низькоангіогенний штам LLC та високоангіогенний штам LLC/R9) як джерела пухлинних антигенів при приготуванні протипухлинних вакцин. Для моделювання пухлинного процесу використано високоангіогенний штам LLC/R9. Характеристика штамів, виготовлення пухлинних вакцин, індукування первинних пухлин детально описано в нашій попередній роботі [13].

Схема експерименту, експериментальні групи. ПВ вводили 4-разово (12-, 15-, 22- та 29-та доба пухлинного росту) підшкірно по 0,3 мл/мишу ([C] = 0,09 мг/мишу на 1 ін’єкцію). Сформовано 4 експериментальні групи: інтактні тварини (група «ІК», n = 4); невакциновані миші з LLC/R9 — контроль пухлинного росту (група «КПР», n = 12); миші з LLC/R9, яким вводили вакцину LLC/R9 (група «ПВ-LLC/R9», n = 12); миші з LLC/R9, яким вводили вакцину LLC (група «ПВ-LLC», n = 12).

На 33-тю добу росту LLC/R9 у СК та супернатантах (Сн) спленоцитів мишей дослідних груп оцінювали рівні ФНП-α, ІФН-γ, ІЛ-1β, -4, -10, а також їх співвідношення.

Отримання сироваток крові. СК експериментальних тварин отримували стандартним методом [18]. Зібрані СК заморожували та зберігали при –20 °С. Розмороження СК проводили безпосередньо перед проведенням тестування; повторне заморожування/розморожування СК не допускалося.

Отримання супернатантів спленоцитів. Сн спленоцитів отримували як описано [18]. 18-годинні Сн відбирали після центрифугування (15 хв при 3000 об./хв) у стерильні пробірки типу епендорф, заморожували та зберігали при –20 °С. Сн розморожували безпосередньо перед проведенням тестування; повторне заморожування/розморожування Сн не допускалося.

Визначення рівня цитокінів в СК та Сн спленоцитів. Рівень ФНП-α, ІФН-γ, ІЛ-1β, -4 та -10 визначали методом імуноферментного аналізу (ІФА) з використанням комерційних тест-систем BD OptEIA Set Mouse (BD Biosciences, США) відповідно до інструкції виробника. Вимірювання оптичної густини проводили при λ=450 нм проти λ=570 нм на автоматичному рідері StatFax 2100 (США). Рівні зазначених цитокінів визначали в пкг/мл за допомогою калібрувальної кривої.

Для порівняння показників вакцинованих мишей з відповідними показниками контрольних груп («ІК», «КПР») розраховували індекси модуляції (ІМ) [19].

де ПД — показник рівня цитокіну у СК (або Сн) мишей дослідних груп;

ПК — показник рівня цитокіну у СК (або Сн) мишей групи «ІК» або «КПР».

Статистичний аналіз. Статистичну обробку результатів проводили з використанням методів варіа­ційної статистики за допомогою програми StatSoft STATISTICA 7.0. Для оцінки достовірності відмінностей показників досліджуваних груп використовували t-критерій Стьюдента. Різницю між показниками вважали статистично достовірною при р < 0,05 [20].

Також розраховано коефіцієнти кореляції Пірсона між показниками кількості та об’єму метастазів (результати опубліковані у нашій попередній роботі [13]) та показниками нижченаведених співвідношень ІФН-γ/ІЛ-4, ІФН-γ/ІЛ-10, ІЛ-1β/ІЛ-4, ІЛ-1β/ІЛ-10.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Результати дослідження рівнів у СК та Сн спленоцитів інтактних мишей і тварин з LLC/R9 деяких про- (ІФН-γ, ІЛ-1β, ФНП-α) та протизапальних (ІЛ-4, ІЛ-10) цитокінів представлені у табл. 1 та на рис. 1, 2.

АБ

Рис. 1. Зміни рівнів цитокінів в СК (А) та Сн спленоцитів (Б) невакцинованих і вакцинованих мишей з LLC/R9 на 33-тю добу пухлинного росту порівняно з інтактними тваринами (*р < 0,05)

АБ

Рис. 2. Зміни рівнів цитокінів у СК (А) та Сн спленоцитів (Б) вакцинованих мишей із LLC/R9 на 33-тю добу пухлинного росту порівняно з показниками групи «КПР» (*р < 0,05)

¹р < 0,05 порівняно з показниками групи «ІК»; ²р < 0,05 порівняно з показниками групи «КПР».

Як видно, на 33-тю добу росту LLC/R9 у невакцинованих мишей з пухлиною порівняно з показниками групи «ІК» відзначався певний дисбаланс рівнів цитокінів як в СК, так і в Сн. Незважаючи на те що внаслідок гетерогенізації жоден із досліджених показників у групі «КПР» не досягнув статистичної значимості, відзначили тенденцію до підвищення рівня ІЛ-10 в Сн спленоцитів, що може свідчити про формування та накопичення в їх популяції клітин з імуносупресорними властивостями, а також ролі ІЛ-10 у розвитку анемії, формуванням якої характеризується ріст модельної пухлини LLC/R9 [8–10]. Наші дані зіставні з результатами роботи [21], в якій показана роль ІЛ-10 у патогенезі анемії у хворих із запальним захворюванням кишечнику. Автори вважають, що формування анемії головним чином пов’язане із прямим впливом IЛ-10 на транс­ляцію феритину і, ймовірно, подальше зберігання заліза в активованих моноцитах/макрофагах, що може обмежити доступність заліза до клітин — попередників еритроцитів.

Ефекти введення ПВ залежали від виду вакцини. У групі «ПВ-LLC» в СК відзначали достовірне зниження рівня ІФН-γ (р < 0,05 порівняно з показниками групи «ІК») та тенденцію до підвищення ФНП-α (0,05 < р < 0,1 порівняно з показниками груп «ІК» та «КПР»). Також відзначено підвищений рівень ІЛ-10, який внаслідок гетерогенізації не досягнув статистичної значимості. Такий рівень досліджених цитокінів у СК, можливо, і забезпечував у вакцинованих тварин збереження цитотоксичної активності макрофагів при додаванні до них аутологічної СК, як показано раніше [13]. Спленоцити вакцинованих мишей цієї групи характеризувалися достовірно зниженою (порівняно з показниками групи «ІК», але не групи «КПР») здатністю до продукції ІЛ-1β та достовірно підвищеною здатністю продукувати ІЛ-10 (р < 0,05 порівняно з показниками групи «ІК»).

Представлені дані добре узгоджуються з отриманими раніше результатами [13] щодо антимета­статичної дії та імунологічних ефектів цієї ПВ, а також відсутністю впливу на пухлиноасоційовану анемію. Як уже зазначалося вище, ІЛ-1β та -10 — одні з цитокінів, які можуть спричиняти формування анемії [14, 21]. Щодо рівня в СК ІФН-γ, то відомо, що високий вміст цього цитокіну на пізніх стадіях пухлинного росту є поганою прогностичною ознакою, оскільки цей цитокін може спричиняти стимулювання пухлини як за рахунок безпосереднього впливу на пухлинні клітини (сприяння формуванню імуноінвазивного фенотипу), так і через імунні механізми. Зокрема, ІФН-γ встановлює імунодепресивне мікросередовище пухлини, запускаючи гомео­статичну реакцію для обмеження запалення і стимулюючи таким чином пухлинні клітини виробляти імунодепресивні молекули (наприклад IDO1), що спричиняє місцеве виснаження амінокислот триптофану, пригнічуючи цитотоксичні Т-лімфоцити та природні кілери й активуючи (або вербуючи нові) Т-регуляторні клітини (Tregs) та мієлоїдні клітини-супресори (MDSC) [22]. Водночас деяке підвищення рівня ФНП-α є достатнім для позитивного впливу СК на цитотоксичну активність макрофагів.

У групі «ПВ-LLC/R9» в СК відзначали достовірне підвищення рівнів ІЛ-4 (р < 0,05 порівняно з показником групи «ІК») та ІЛ-1β (р < 0,05 порівняно з показником групи «КПР»). Відзначимо, що таке підвищення ІЛ-1β у СК стало, ймовірно, однією з причин, що призвели до більш вираженої в цій групі анемії [13]. Спленоцити мишей групи «ПВ-LLC/R9» характеризувалися здатністю до достовірно зниженої продукції ІФН-γ (р < 0,05 порівняно з показниками групи «ІК») з одночасною тенденцією до підвищеної продукції ІЛ-10 (0,05 < р < 0,1 порівняно з показниками групи «ІК»).

З метою оцінки балансу про- та протизапальних цитокінів, які є важливими для формування протипухлинної резистентності [23], було оцінено в СК та Сн такі співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4, ІФН-γ/ІЛ-10, ІЛ-1β/ІЛ-4, ІЛ-1β/ІЛ-10 (табл. 2). Як видно, у мишей групи «КПР» в СК показники співвідношень ІФН-γ/ІЛ-10 та ІЛ-1β/ІЛ-10, хоча і недостовірно (внаслідок гетерогенізації показника), все ж перевищували відповідні рівні у групі інтактного контро­лю. Причому розраховані коефіцієнти кореляції між цими співвідношеннями та об’ємом і кількістю метастазів становлять відповідно, 0,780 і 0,836 та 0,910 і 0,867. Достовірне зниження показника співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 у Сн невакцинованих мишей з LLC/R9 (р < 0,05 порівняно з показниками «ІК») узгоджується з нашим припущенням щодо накопичення клітин із імуносупресорною активністю; коефіцієнти кореляції становлять (–0,991) та (–0,999). У мишей групи «ПВ-LLC» фіксували достовірне зниження порівняно з групою «ІК» (р < 0,05) показників співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 (в СК та Сн) та ІЛ-1β/ІЛ-4 (в Сн), що, вірогідно, свідчить про формування імуносупресивного стану, але відсутність різкого дисбалансу таких цитокінів, як ІФН-γ, ІЛ-1β та -10. Коефіцієнти кореляції між рівнем ІЛ-1β/ІЛ-4 в Сн та об’ємом і кількістю метастазів становили відповідно 0,841 та 0,766.

¹р < 0,05 порівняно з показниками групи «ІК».

У мишей групи «ПВ-LLC/R9» фіксували в СК достовірно вищий (р < 0,05 порівняно з показником групи «ІК») показник співвідношення ІЛ-1β/ІЛ-10 (коефіцієнти кореляції становили відповідно (–0,652) та (–0,980)) та достовірно нижчий (порівняно з показником групи «ІК») в Сн показники співвідношень ІФН-γ/ІЛ-4 (коефіцієнт кореляції між цим показником та об’ємом метастазів становив 0,879) та ІФН-γ/ІЛ-10 (коефіцієнт кореляції між цим показником та об’ємом метастазів становив (–0,997)), що, вірогідно, і спричинило поглиб­лення пухлиноасоційованої анемії [13].

Таким чином, у мишей із високоангіогенною пухлиною LLC/R9 важливим фактором у формуванні пухлиноасоційованої анемії є ІЛ-10, а також ІФН-γ. Застосування вакцини, виготовленої з клітин вихідного (низькоангіогенного) штаму LLC, запобігало на пізніх стадіях пухлинного росту накопиченню в сироватці крові ІФН-γ, що, ймовірно, і зумовило можливість сформувати достатній для антиметастатичного ефекту протипухлинний захист. Водночас введення цієї вакцини не запобігало формуванню імуносупресивного стану (підвищена здатність спленоцитами до продукції ІЛ-10 з одночасним зниженням продукції ІЛ-1β). Застосування вакцини, виготовленої з клітин високоангіогенного штаму LLC/R9, не впливало на пізніх стадіях пухлинного росту на рівень накопичення в сироватці крові ІФН-γ та підвищувало рівень ІЛ-4 та -1β, що, вірогідно, й зумовило в цій групі розвиток більш вираженої анемії. Застосування цієї вакцини також не впливало на функціо­нальний стан спленоцитів: відзначали зниження продукції ІФН-γ.

ВИСНОВКИ

Одержані дані підтверджують гуморальний, зокрема зумовлений рівнями цитокінів ІЛ-10, ІФН-γ та ІЛ-1β, механізм формування асоційованої з розвитком LLC/R9 анемії, а також можуть стати підґрунтям для розроблення показань використання аутологічних вакцин з урахуванням проявів паранеопластичного синдрому.

Робота виконана в рамках цільової програми наукових досліджень відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології НАН України «Фундаментальна геноміка і метаболоміка в системній біології».

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Bilynsky BT, Dzhus MB, Litvinyak RI. The conceptual and clinical problems of paraneoplastic syndrome in oncology and internal medicine. Exp Oncol 2015; 37: 82–8.
• 2. Blyakhman I, Chakravarthy K. Updated review and treatment recommendations on paraneoplastic neurologic syndromes and chronic pain. Pain Physician 2019: 22: 433–45.
• 3. Henry K. Paraneoplastic syndromes: Definitions, classification, pathophysiology and principles of treatment. Sem Diagnostic Pathol 2019; 36 (4): 204–10.
• 4. Boyiadzis M, Lieberman FS, Geskin LJ, et al. Paraneoplastic syndromes. In: Cancer: principles and practice of oncology. 8th ed. DeVita VT, Lawrence TS, Rosenberg SA (eds). New York: Lippincott, Williams & Wilkins, 2008: 2343–62.
• 5. Schwartz RN. Anemia in patients with cancer: incidence, causes, impact, management, and use of treatment guidelines and protocols. Am J Health Syst Pharm 2007; 64: S5–S13.
• 6. Pelosof LC, Gerber DE. Paraneoplastic syndromes: an approach to diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc 2010; 85 (9): 838–54.
• 7. Debeljak N, Solár P, Sytkowski AJ. Erythropoietin and cancer: the unintended consequences of anemia correction. Front Immunol 2014; 5: Article 563: 1–14.
• 8. Peskovskaya OM, Solyanyk GI, Fedorchuk, et al. The method of obtaining a modified variant of Lewis lung cancer. Pat. №48525 Ukraine, MPK G 01 N 33/15. №u2009 08956; stat. 28.08.2009; publish. 25.03.2010, Bull. № 6 (in Ukrainian)
• 9. Pyaskovskaya ON, Dasyukevich OI, Kolesnik DL, et al. Changes in VEGF level and tumor growth characteristics during Lewis lung carcinoma progression towards cis-DDP resistance. Exp Oncol 2007; 29 (3): 197–202.
• 10. Fedorchuk OG, Pyaskovskaya OM, Skivka LM, et al. Paraneoplastic syndrome in mice bearing high-angiogenic variant of Lewis lung carcinoma: Relations with tumor derived VEGF. Cytokine 2012; 57 (1): 81–8.
• 11. Pyaskovskaya OM, Gorbyk GV, Yakshibaeva YUR, et al. Correction of tumor-associated anemia with grape polyphenols. Farmakol ta likarsʹka toksykol 2014: (1 (37)): 91–8.
• 12. Sarnatskaya VV, Nikolaev VG, Yushko LA, et al. Effect of enterosorption on paraneoplastic symptom manifestation in mice with highly angiogenic variant of Lewis lung carcinoma. Exp Oncol 2015; 37 (4): 255–61.
• 13. Karaman ОМ, Fedosova NІ, Voyeykova ІМ, et al. Manifestations of tumorassociated anemia in mice with Lewis lung carcinoma at the background of use of cancer vaccines. Onkologiya 2016; 18 (4): 262–8 (in Ukrainian).
• 14. Lavrova VS, Chernova YeN, Karpova GV, et al. Disregulating processes in the blood system during cancer. Bull Sib Med 2006; (2): 75–84 (in Russian).
• 15. Bron D, Meuleman N, Mascaux С. Biological basis of anemia. Semin Oncol 2001; 28 (2, Suppl 8): 1–16.
• 16. Kozhemyakin YuM, Khromov OS, Boldyreva NE, et al. Scientific and practical recommendations for keeping laboratory animals and working with them. K: Interservis, 2017. 182 p. (in Ukrainian).
• 17. Council Directive 2010/63/EU of 22 september 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official J Eur Commun 2010; 276: 33–79.
• 18. Klaus J. Lymphocytes. Methods. M: Mir, 1990. 395 p. (in Russian).
• 19. Kovbasyuk SA, Yudin VM, Kravchenko SP. Immunomodulatory effect of cyclophosphamide with various schemes of its administration to mice. Cytologia 1985; (3): 316–21 (in Russian).
• 20. Sidenko AV, Vishnyakov VV, Isaev SM. The theory of statistics. Manual. М: MAKS-Press, 2011. 343 p. (in Russian).
• 21. Tilg H, Ulmer H, Kaser A, Weiss G. Role of IL-10 for induction of anemia during inflammation. J Immunol 2002; 169 (4): 2204–9.
• 22. Mojic M, Takeda K, Hayakawa Y. The dark side of IFN-γ: its role in promoting cancer immunoevasion. Int J Mol Sci 2017; 19 (1): 89.
• 23. Lee HL, Jang JW, Lee SW et al. Inflammatory cytokines and change of Th1/Th2 balance as prognostic indicators for hepatocellular carcinoma in patients treated with transarterial chemoembolization. Sci Rep 2019; 9: 3260.

Адреса для листування:
Караман О.М.
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України
вул. Васильківська, 45, Київ, 03022
E-mail: kmolga1977@gmail.com

Одержано: 18.09.2020