ЕКСПРЕСІЯ БІЛКІВ ФЕРМЕНТІВ ОБМІНУ ПОЛІАМІНІВ У ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИНАХ ПЕРЕДМІХУРОВОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-4-2019-g.8406

Рак передміхурової залози (РПЗ) — одне із найпоширеніших злоякісних новоутворень у чоловіків віком старше 50 років. У більшості країн Європи та Америки РПЗ посідає перше-друге місця у структурі онкологічної захворюваності чоловічого населення. Темпи приросту захворюваності на РПЗ одні з найвищих серед усіх злоякісних новоутворень [1]. Більшість із існуючих маркерів РПЗ не є високо­специфічними та достатньо надійними. Вважають доцільним розширення їх спектра, оскільки це надасть додаткову інформацію про пухлину та слугуватиме не тільки для прогнозу перебігу захворювання, а й сприятиме індивідуалізації терапевтичних схем, розробці нових режимів персоніфікованого лікування. На сьогодні приділяється велика увага вивченню маркерів не лише в крові та сечі, а й нових тканинних маркерів, оскільки відмінності молекулярного профілю злоякісних пухлин мають вирішальне значення. Відомо, що проліферація клітин не може відбуватися за відсутності або навіть браку певної кількості поліамінів (ПА). Але в пухлинах різного гістогенезу процеси синтезу і катаболізму ПА, а також вміст окремих їх фракцій суттєво відрізняються [2].

Щодо тканини передміхурової залози відомо, що орнітиндекарбоксилаза (OДК) експресується як при доброякісній гіперплазії цього органа, так і в пухлинних клітинах. Надмірна експресія OДК, виявлена в субпопуляції епітеліальних клітин простати, спостерігається на ранніх етапах РПЗ і зменшується у міру прогресування пухлини. Водночас надекспресія цього ферменту недостатня для індукції канцерогенезу [3].

Вперше аргіназа (Аrg) була виявлена в печінці ссавців як термінальний фермент циклу сечовини. В інших тканинах, які позбавлені повного метаболізму сечовини, також виявляється її активність. У цьому разі важливість Аrg може полягати, зокрема, у продукції орнітину для синтезу ПА. Є дані, які свідчать, що у тканинах раку шлунка, стравоходу, легені, при різних формах лейкозів активність Аrg суттєво вища порівняно з нормальними тканинами [4, 5].

Показано підвищену активність Аrg і при РПЗ. Було виявлено, що експресія Аrg ІІ більш виражена в андрогензалежних клітинних лініях і менш помітна в андрогеннезалежних клітинних лініях РПЗ. Крім того, показано, що експресія орнітинамінотрансферази (ОАТ) — ферменту, також відповідального за синтез орнітину, обернено корелює з експресією Аrg ІІ. Сукупність даних свідчить про зв’язок експресії Аrg ІІ, ОАТ і синтезу ПА [6]. Стосовно активності ферменту є відомості, що специфічна активність Аrg ІІ вища в карциномах передміхурової залози, ніж при доброякісній гіперплазії останньої [7].

Поліаміноксидаза (ПАО) представляє новий клас катаболічних ферментів в метаболізмі ПА, здатних до їх ефективного окиснення. На сьогодні зростає інтерес до катаболізму ПА, оскільки доведена його роль у визначенні чутливості клітин до різних протипухлинних чинників [8, 9]. Вважають, що катаболічний шлях ПА у ссавців складається із двох ферментів: спермідин/спермін ацетилтрансферази (ССAT) [10] і ПАО, яка переважно каталізує окиснення N-ацетилполіамінів, утворених ССAT. Це окиснення призводить до утворення Н₂О₂-ацетамідопропанолу і путресцину або спермідину залежно від вихідного субстрату.

Дослідження показали, що ПАО проявляє велику специфічність до спермідину як субстрату [11]. Ці дані вказують, що оксидаза є додатковим ферментом у катаболізмі ПА і переважно використовує їх як субстрат. ПАО значною мірою індукує протипухлинні аналоги ПА, подібно до ССAT [12], що свідчить про те, що активність ПАО може відігравати безпосередню роль у загибелі клітин внаслідок утворення токсичного H₂O₂. Крім того, окиснення ПА нещодавно було охарактеризовано як критичний етап у детоксикації одного з протипухлинних поліамінових аналогів. Пухлинні клітини, які мають низький або невизначений рівень здатності до окиснення ПА, значно чутливіші до цитотоксичних ефектів [13].

Мета роботи — дослідити рівень експресії ферментів обміну ПА (Arg I, ОДК, ПАО) у клітинах РПЗ залежно від стадії захворювання.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Проведено дослідження операційного матеріалу 35 хворих на РПЗ I–IV cтадії (таблиця), які отримували лікування у відділенні пластичної та реконструктивної онкоурології Національного інституту раку МОЗ України. Діагноз РПЗ був гістологічно верифікований у Національному інституті раку. Жоден із хворих до проведення операції не отримував медикаментозного лікування. Пацієнти були поінформовані щодо мети проведення досліджень і надали згоду на використання свого клінічного матеріалу в наукових цілях.

Таблиця. Розподіл хворих за стадіями РПЗ

Для визначення рівня експресії Аrg I, OДК та ПAO з пухлинної тканини готували екстракти згідно з методом [14]. Концентрацію загального білка в зразках визначали за допомогою методу [15]. Гель-електрофорез білкових препаратів (клітинних екстрак­тів пухлин), денатурованих за допомогою SDS, проводили за модифікованою методикою [16]. Використано МкАт до Arg I, OДК та ПAO (Mouse monoclonal IgG «Santa Cruz Biotechnology», США); кон’югати: Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP («Santa Cruz Biotechnology», США). Дані вестерн-блотингу були математично оброблені за допомогою комп’ютерної програми TotalLab.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Найвищі рівні експресії Arg I у клітинах РПЗ спостерігали на початкових стадіях захворювання. Рівень експресії Arg І в пухлинах І і ІІ стадії відрізняється мало (рис. 1): різниця рівнів експресії Arg I становить лише 8,1%. Але надалі, з прогресуванням захворювання, рівень експресії Arg I знижується. Так, у тканині РПЗ ІІІ і IV стадії помітно значне зниження цього показника порівняно з І (на 28,8 і 34,2% відповідно) та ІІ стадією (на 20,7 і 26,1% відповідно). Отже, можна припустити, що найвища активність молекулярно-біологічних процесів, регульованих Arg I (тобто метаболізм аргініну), актуальна на початкових етапах пухлинного росту.

аб

Аналогічні результати отримано при дослідженні рівня експресії ОДК — ключового ферменту синтезу ПА. На рис. 2 представлені дані щодо рівнів експресії ОДК в клітинах РПЗ I–IV стадії. Найвищі рівні експресії ОДК у пухлинних клітинах РПЗ спостерігали також на початкових стадіях (див. рис. 2). За рівнем експресії ОДК різниця між І та ІІ стадіями більша, ніж аналогічна різниця за показниками Arg I (див. рис. 1), розбіжність становить 21,6%. Надалі, з прогресуванням хвороби рівень експресії ОДК знижується ще активніше. Так, у групах РПЗ ІІІ і IV стадії зниження рівня експресії ОДК порівняно з І стадією становить на 33,1 і 50,7% відповідно; порівняно з ІІ стадією — на 10,6 і 28,7% відповідно. Отже, найвища активність процесу синтезу ПА, яка регулюється ОДК, вочевидь, важлива на початкових етапах посилення клітинної проліферації і пухлинного росту.

Ці результати цілком підтверджуються даними літератури. Так, показано, що ОДК надекспресується в пухлинних тканинах, при цьому явище надмірної експресії ОДК, очевидно, відбувається на ранніх етапах канцерогенезу передміхурової залози [3].

аб

Виявлено, що рівень експресії ПАО підвищується у процесі прогресування РПЗ (рис. 3). Найнижчі рівні експресії ПАО спостерігали в пухлинах I стадії. Надалі з прогресуванням хвороби рівень експресії ПАО підвищується. У групах ІІ, ІІІ і IV стадії помітне значне підвищення рівня експресії ПАО: порівняно з І стадією рівень експресії ПАО при ІІ стадії зростає на 24,6%, при ІІІ стадії — на 33,5%, при IV стадії — на 42,6%. Такі результати узгоджуються з даними публікацій в літературі [17]. Інші автори зазначають, що ПАО може індукувати протипухлинні аналоги ПА [18], і що її активність може відігравати безпосередню роль у загибелі клітин через утворення токсичного H₂O₂. Існують відомості, що рівень експресії ПAO є нижчим у більшості пухлин (включаючи пухлини передміхурової залози) порівняно з нормальними тканинами [19–21]. Протиріччя у результатах теоретично узгоджуються з даними метааналізу профілів експресії генів у злоякісних пухлинах передміхурової залози [22] та свідчать, що метаболізм ПА є одним із найбільш нерегульованих шляхів у патогенезі РПЗ.

аб

Зазначимо, що твердження про перспективність ферментів біосинтезу ПА як мішеней для протипухлинної терапії вже встигло зайняти місце в науковій літературі. Існують публікації щодо впливу інгібіторів біосинтезу ПА (здебільшого інгібіторів OДК) на ріст модельних пухлин та перебіг канцерогенезу [2, 3]. Дані щодо особливостей метаболізму ПА, зокрема активності/експресії ферментів їх обміну (Arg, ОДК, ССAT, спермінсинтази, ПАО тощо) та рівня окремих фракцій ПА в пухлинах передміхурової залози, могли би стати науковою основою для розроблення нових інгібіторів синтезу ПА як протипухлинних засобів таргетної дії. Окрім цього, дані щодо експресії ферментів обміну ПА в пухлинах можуть бути використані як потенційні маркери для прогнозу перебігу захворювання. Все вищезазначене вказує на перспективність вивчення особливостей обміну ПА в пухлинах передміхурової залози людини.

ВИСНОВКИ

1. Найвищі рівні експресії Arg I і ОДК виявлено на початкових стадіях РПЗ, найнижчі рівні (на 34,2 і 50,7% відповідно) — у пухлинах IV стадії. Очевидно, при кінцевих стадіях захворювання синтез ПА (в якому беруть безпосередню участь Arg I і ОДК) значно гальмується.

2. Виявлено зростання рівня експресії ПАО у клітинах РПЗ у процесі прогресування хвороби: найвищий (на 42,6%) рівень експресії ПАО виявлено у пухлинах IV стадії. Очевидно, посилена експресія ПАО виснажує пул ПА у клітинах РПЗ на пізніх стадіях.

3. Визначення рівнів експресії білків ферментів обміну ПА в РПЗ може бути запропоновано для уточнення діагностики та прогнозу перебігу РПЗ.

ПОДЯКА

Висловлюємо щиру подяку лікарям відділення пластичної та реконструктивної онкоурології Національного інституту раку МОЗ України і особисто — кандидату медичних наук, лікарю-урологу вищої категорії Ю.В. Вітруку.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Ferlay J, Autier P, Boniol M. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2010. Ann Oncol 2011; 18: 581–92.
• 2. Soda K. The mechanisms by which polyamines accelerate tumor spread. J Exp Clin Cancer Res 2011; 30 (1): 95.
• 3. Young L, Salomon R, Au W, et al. Ornithine decarboxylase (ODC) expression pattern in human prostate tissues and ODC transgenic mice. J Histochem Cytochem 2006; 54 (2): 223–9.4. Akram J, Mahmoud A, Hamid-Reza R. Rhodanese and arginase activity in normal and cancerous tissues of human breast, esophagus, stomach and lung. Arch Irn Med 2001;
• 4: 88–92.
• 5. Gogol SV, Yanish YuV, Zaletok SP, Ivanivska TS. Arginase activity and expression in the peripheral blood cells of patients with the different forms of leukemia. Oncology 2018; 20, 4 (78): 265–8 (in Ukrainian).
• 6. Mumenthaler SM, Yu H, Tze S, et al. Expression of arginase II in prostate cancer. Int J Oncol 2008; 32 (2): 357–65.
• 7. Harris BE, Pretlow TP, Bradley EL, et al. Arginase activity in prostatic tissue of patients with benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma. Cancer Res 1983; 43 (6): 3008–12.
• 8. Bergeron RJ, Feng Y, Weimar WR, et al. A comparison of structure-activity relationships between spermidine and spermine analogue antineoplastics. J Med Chem 1997; 40: 1475–94.
• 9. Casero JrRA, Woster PM. Terminally alkylated polyamine analogues as chemotherapeutic agents. J Med Chem 2001; 44: 1–26.
• 10. Casero JrRA, Pegg AE. Spermidine/spermine N1 acetyltransferase — the turning point in polyamine metabolism. FASEB J 1993; 7: 653–61.
• 11. Vujcic S, Diegelman P, Bacchi CJ, et al. Identifcation and characterization of a novel avin-containing spermine oxidase of mammalian cell origin. Biochem J 2002; 367: 665–75.
• 12. Wang Y, Devereux W, Woster PM, et al. Cloning and characterization of a human polyamine oxidase that is inducible by polyamine analogue exposure. Cancer Res 2001; 61: 5370–3.
• 13. Lawson KR, Marek S, Linehan JA, et al. Detoxifcation of the polyamine analogue N1-ethyl-N11-(cycloheptyl)methyl-4,8-diazaundecane (CHENSpm) by polyamine oxidase. Clin Cancer Res 2002; 8: 1241–7.
• 14. Sovak M, Bellas R, Kim D, et al. Aberrant nuclear factor-kB/Rel expression and pathogenesis of breast cancer. J Clin Invest 1997; 100: 2952–60.
• 15. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248–54.
• 16. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680–5.
• 17. Ha HC, Woster PM, Yager JD, Casero JrRA. The role of polyamine catabolism in polyamine analogue-induced programmed cell death. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 11557–62.
• 18. Wang Y, Devereux W, Woster PM, et al. Cloning and characterization of a human polyamine oxidase that is inducible by polyamine analogue exposure. Cancer Res 2001; 61: 5370–3.
• 19. Wallace HM, Duthie J, Evans DM, et al. Alterations in polyamine catabolic enzymes in human breast cancer tissue. Clin Cancer Res 2000; 6: 3657–61.
• 20. Quash G, Keolouangkhot T, Gazzolo L, et al. Diamine oxidase and polyamine oxidase activities in normal and transformed cells. Biochem J 1979; 177: 275–82.
• 21. Takenoshita S, Matsuzaki S, Nakano G, et al. Selective elevation of the N1-acetylspermidine level in human colorectal adenocarcinomas. Cancer Res 1984; 44: 845–7.
• 22. Rhodes DR, Barrette TR, Rubin MA, et al. Metaanalysis of microarrays: interstudy validation of gene expression profiles reveals pathway dysregulation in prostate cancer. Cancer Res 2002; 62: 4427–33.

Адреса для листування:
Гоголь С.В.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
Е-mail: tantattoo72@gmail.com

Одержано 29.11.2019