ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ, ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ГИСТОГЕНЕЗА ЖЕЛЕЗИСТОГО РАКА ЛЕГКОГО

Исследование гистогенеза рака легкого (РЛ) обусловлено необходимостью рациональных подходов к его профилактике и ранней диагностике, что самым непосредственным образом влияет на эффективность лечебных мероприятий. Кроме того, существуют различные взгляды на роль каждого из клеточных элементов дыхательного аппарата в неопластической трансформации при развитии различных гистологических типов РЛ [1–3].

Большинство авторов считают основным источником возникновения РЛ базальный эпителий бронхов [1, 3]. В то же время разными экспериментально­морфологическими исследованиями показано, что эпителий выстилки альвеол характеризуется высокой пролиферативной активностью, что может привести к чрезмерной гиперплазии и анаплазии при предопухолевых состояниях и развитии РЛ [4]. Однако единого мнения о возможности малигнизации альвеолярного эпителия (АЭ) не существует.

Одним из объективных морфофункциональных способов оценки изменений эпителиальных клеток в процессе злокачественного перерождения может служить изучение ядрышкообразующих регионов (ЯОР) хромосом [5–9].

Кроме того, исследование цитоморфологических и электронно­микроскопических показателей структур легочной паренхимы при РЛ позволит на клеточном и субклеточном уровнях проследить возможный процесс малигнизации АЭ с учетом теории R.A. Willis об «опухолевом поле» [10, 11].

Цель работы — изучить цитологические, цитогенетические и ультраструктурные особенности АЭ и возможность его малигнизации при железистом РЛ (ЖРЛ).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованы цитологические препараты, полученные путем соскобов с перитуморальной зоны (ПТЗ) ЖРЛ — участка ткани легкого на расстоянии от края видимой границы опухоли до 2 см к периферии от нее. При этом соскобы с ПТЗ проводили по направлению к опухоли, не доходя до нее, с тем, чтобы исключить механическое попадание опухолевых клеток в исследуемую зону. Всего изучали цитограммы с ПТЗ у 23 больных, которым не проводили предоперационную противоопухолевую терапию. Из них у 16 пациентов исследованы также цитологические препараты наиболее отдаленной от ЖРЛ зоны (НОЗ) операционного материала — участка ткани легкого на расстоянии от 5 до 10 см и более от края видимой границы опухоли в зависимости от объема оперативного вмешательства (лобэктомия или пульмонэктомия). Все случаи ЖРЛ верифицированы гистологическим методом согласно международной гистологической классификации [12].

Больные были в возрасте от 44 до 73 лет, средний возраст составил 61,26 ± 1,74 года. Преобладали мужчины (73,9%). В большинстве случаев наблюдали периферическую форму ЖРЛ (73,9%).

Проводили цитологическое исследование препаратов, окрашенных по методам Паппенгейма и Папаниколау, на микроскопе OLYMPUS–СХ 41 при увеличении х 100; х 200; х 400; x 1000.

Для выявления ЯОР хромосом использовали метод окрашивания серебром по W. Howell, D. Black [13]. Морфофункциональные типы ядрышек (Яд) изучали согласно классификации П.В. Челидзе, О.В. Зацепиной (1988) [14] и предложенной нами рабочей схеме [15] при 1000­кратном увеличении.

При цитогенетическом исследовании определено общее количество Яд на одно ядро и процентное содержание основных типов Яд: компактных, нуклеолонемных, кольцевидных и микроядрышек. Также установлены показатели собственно нуклеолонемных и переходных нуклеолонемно­компактных форм Яд. В каждом случае изучалось по 30–100 ядер клеток АЭ. Всего исследовано 5773 Яд в 2200 ядрах клеток пролиферирующего АЭ в ПТЗ у 23 больных, 2422 Яд в 790 ядрах клеток АЭ с признаками выраженной пролиферации и некоторой атипии в ПТЗ у 15 больных и 2632 Яд в 1600 ядрах клеток АЭ, которые получены при соскобе в НОЗ у 16 больных при ЖРЛ.

Электронно­микроскопические исследования проведены на операционном материале 14 больных ЖРЛ. Для электронной микроскопии операционный материал брали не позже 1 ч после удаления опухоли, как правило, из двух участков: из визуально определяемой краевой зоны опухоли (без видимых некрозов) и ПТЗ. Образцы опухолевой ткани и ПТЗ легкого измельчали до размеров 1 мм3 и немедленно фиксировали в 2,0% растворе глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере Серенсена в течение 1,5 ч при температуре 4 °С на встряхивателе. Затем ткань промывали в том же буфере в течение 20 ч и дофиксировали 2,0% раствором четырехокиси осмия (ОsО4) в том же буфере в течение 1,5 ч при темпера­

туре 4 °С с последующим обезвоживанием в спиртах

восходящей концентрации (70°–96°–100°) и абсолютном ацетоне. Заключали ткань в смесь эпоксидных смол «Эпон» по методике Лафта. С эпоксидных блоков делали ультратонкие срезы до 500 А толщиной и контрастировали их уранил­ацетатом по Лафту и цитратом свинца по Рейнольдсу. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM–100В (Япония) при ускоряющем напряжении 60 кВ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t­критерия Стьюдента, уровень вероятности р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении цитологических препаратов ПТЗ при ЖРЛ в большинстве случаев определяли клетки пролиферирующего АЭ и опухолевые элементы в различных соотношениях (рис. 1), в среднем 51,48 ± 6,00 и 48,52 ± 6,00% соответственно (табл. 1).

Рис. 1. Комплекс опухолевых клеток среди лимфоцитов и клеток АЭ с признаками пролиферации и дистрофическими изменениями. ПТЗ операционного материала при ЖРЛ. Цитологический препарат. Окраска по Паппенгейму, х 200

Отмечено преобладание опухолевых клеток (более 90% клеточного состава) в 6 наблюдениях при макроскопически неизмененной ПТЗ. В 3 случаях опухолевые клетки в ПТЗ при ЖРЛ отсутствовали. Среди пролиферирующего АЭ выявлялись в небольшом количестве клеточные элементы с признаками выраженной пролиферацииинекоторой атипии— 8,04± 1,26% (см. табл. 1). При этом в них наблюдали укрупнение размеров клеток и ядер, неравномерную структуру хроматина, гиперхроматоз и неровный контур ядра, утолщение ядерной оболочки, увеличение количества и размера Яд.

Таблица 1 Основной клеточный состав цитограмм соскобов различных

участков ткани легкого при ЖРЛ

р < 0,05: 1по сравнению с НОЗ; 2по сравнению с % опухолевых клеток.

В то же время в цитологических препаратах НОЗ определяли преимущественно клетки АЭ с признаками пролиферации (91,38 ± 2,59%), в некоторых из них также отмечены явления атипии (8,69 ± 1,33%), при этом в 5 случаях выявлены опухолевые элементы (8,62 ± 2,59%).

При цитогенетическом исследовании клеток АЭ с признаками выраженной пролиферации и некоторой

Таблица 2

Морфофункциональные типы Яд в клетках АЭ при ЖРЛ

p < 0,05 по сравнению с частотой выявления: 1нуклеолонемных Яд, 2собственно нуклеолонемных Яд.

атипии в ПТЗ при ЖРЛ (табл. 2, рис. 2 и 3) выявлено статистически достоверное (р < 0,05) увеличение в них общего количества Яд в одном ядре (от 2,75 ± 0,12 до 3,15 ± 0,11) и наиболее морфофункционально активных компактных их форм (от 1,51 ± 0,34 до 4,52 ± 1,02%), а также уменьшение количества неактивних кольцевидных Яд (от 21,12 ± 1,13 до 15,13 ± 1,58%) по сравнении с клетками АЭ с признаками пролиферации.

Рис. 2. Основные морфофункциональные типы Яд в клетках АЭ: а) с признаками пролиферации, б) с признаками пролиферации и некоторой атипии. ПТЗ операционного материала при ЖРЛ. Цитологический препарат. Окраска по методу W. Howell, D. Black, х 1000

Рис. 3. Основные морфофункциональные типы Яд в клетках АЭ перитуморальной и наиболее отдаленной зон при ЖРЛ

Клетки АЭ в НОЗ при ЖРЛ характеризовались более низкими (р < 0,05) показателями общего количества Яд в ядре (1,65 ± 0,06) и микроядрышек (31,80 ± 2,17%); а также большими (р > 0,05) значениями собственно нуклеолонемных (7,27 ± 1,73%) и кольцевидных (24,48 ± 1,43%) форм Яд, чем пролиферирующий АЭ в ПТЗ (см. табл. 2; рис. 3, 4).

Рис. 4. Основные морфофункциональные типы Яд в клетках АЭ. НОЗ операционного материала при ЖРЛ. Цитологический препарат. Окраска по методу W. Howell,

D. Black, х 1000

При этом уровень компактных Яд в клетках АЭ в НОЗ почти такой же, как и в пролиферирующем АЭ в ПТЗ при ЖРЛ (соответственно 1,59 ± 0,32 и 1,51 ± 0,34%).

При электронно­микроскопическом (ЭМ) исследовании ткани ПТЗ при ЖРЛ выявлены различные изменения. Основные из них — инвазия клеток опухоли в виде отдельных атипических элементов и реже — в виде их сплошных пластов в ПТЗ (рис. 5).

Рис. 5. Инвазия перитуморальной ткани пластом атипичных эпителиальных клеток. ПТЗ умереннодифференцированной аденокарциномы легкого. Электронная микрофотограмма. х 6500

Такая инвазия наблюдалась в большинстве случаев при ЖРЛ, независимо от уровня его дифференцировки. Однако в некоторых случаях эпителиальные элементы ПТЗ определялись с выраженными признаками пролиферации и атипии (рис. 6) неза­

висимо от основной зоны опухолевого роста (как проявление«опухолевого поля» (?)).

Рис. 6. Поэтапная пролиферация стволовых клеток (пневмоцитов I типа (?)) с дифференцировкой их в атипичные пневмоциты II типа в просвете альвеолы. ПТЗ низкодифференцированной аденокарциномы легкого. Электронная микрофотограмма. х 2500

При наличии таких зон пролиферации и атипии на больших расстояниях от основного очага принято говорить о множественных очагах малигнизации или о мультифокальном росте ЖРЛ или же о ближайшем метастазировании в периферических отделах легкого. О том, что это не метастазы примордиальной опухоли, может свидетельствовать сохранение связи пролифератов (например пневмоцитов II типа), даже при нарастающей атипии составляющих их клеток, с базальными мембранами альвеол (рис. 7).

Рис. 7. Группа атипичных пневмоцитов II типа в просвете альвеолы, местами сохраняющих контакт с аэрогематическим барьером. ПТЗ низкодифференцированной аденокарциномы легкого. Электронная микрофотограмма. х 5500

АЭ в ПТЗ при ЖРЛ характеризовался различными ультраструктурными признаками атипии: значительные искажения формы пневмоцитов I типа, а также различные деформации миелиновых телец, их запустения и отклонения в продукции деградированного сурфактанта в просветы альвеол (в виде «нереализованного сурфактанта»). Типичным явлением в ПТЗ являлось

утолщение межальвеолярных перегородок аэрогематического барьера за счет утолщения базальных мембран капилляров и альвеол, фибриноза и склероза межуточной ткани, а также дистрофия и отслойка пневмоцитов I и II типов с «оголением» больших участков внутренней поверхности альвеол.

Результаты цитологического, цитогенетического и ЭМ­исследований ПТЗ при ЖРЛ демонстрируют частое распространение опухолевых клеток за границы визуально определяемой зоны роста опухоли. При этом в клеточных элементах АЭ отмечаются реактивные изменения, выражающиеся в высокой степени пролиферации и явлениями атипии части из них. Клетки увеличиваются в размерах, значительно укрупняются ядра, нарушается структура хроматина, утолщается ядерная оболочка, увеличивается количество и размер Яд. Выявление большого количества опухолевых клеток в ПТЗ и отдельных их групп в НОЗ свидетельствует о нарастании атипии, о возможной малигнизации АЭ как рядом с опухолью, так и на расстоянии от нее. Выявленные цитоморфологические признаки пролиферации клеток АЭ в ПТЗ подтверждаются наличием наиболее морфофункционально активных компактных форм Яд (1,51 ± 0,34%). В то же время в клетках АЭ с явлениями атипии в ПТЗ при ЖРЛ наблюдается рост этого показателя до 4,52 ± 1,02%, а также увеличение общего количества Яд при сравнении с пролиферирующим АЭ, что свидетельствует об усиленной активации ЯОР хромосом и возможной злокачественной трансформации АЭ. Это также подтверждается ЭМ­исследованием, которое, кроме упомянутого, констатирует нарастание атипии в АЭ — в пневмоцитах I и II типов, растущих на месте, то есть неразрывных с базальной мембраной как в ПТЗ, так и в НОЗ ЖРЛ. Таким образом, проведенные цитоморфологические, цитогенетические и ультраструктурные исследования подтверждают теорию «опухолевого поля»

R.A. Willis и обосновывают выводы о мультифокальном росте периферического ЖРЛ и об альвеологенном источнике его развития.

ЛИТЕРАТУРА

1. Болгова ЛС. О гистогенезе рака легкого. Онкология 1999; 1 (3): 195–8.

2. Кim CF, Jakson EI, Wolfenden AE, et al. Идентификация бронхоальвеолярных стволовых клеток в норме и при раковой опухоли. Cell 2005; 6: 823–35.

3. Tomida Shuta, Yatabe Yasushi, Yanagisawa Kiyoshi, et al. Throwing new light on lung cancer pathogenesis: Updateu on three recents topics. Cancer Sci 2005; 96 (2): 63–8.

4. Романова ЛК. Регуляция восстановительных процессов. Москва: Изд­во Московского ун­та, 1984. 174 с.

5. Trere D. AgNOR staining and quantification. Micron 2000; 31 (2): 127–31.

6. Болгова ЛС, Лобода ВИ, Туганова ТН. Ядрышковые организаторы в процессе малигнизации бронхиального эпителия. Цитол генет 1998; 32 (1): 79–82.

7. Abe S, Ogura S, Kunikane H, et al. Nucleolar organizer regions in precancerous and cancerous lesions of the bronchus. Cancer 1991; 67 (2): 472–5.

8. Usuda K, Saito Y, Okaniwa G, et al. Assesment of nucleolar organizer regions (Ag­NORs) in bronchial dysplasia and roentgenographically occult bronchogenic squamous cell carcinoma. Nippon Kyobu Geka Gakkai Zasshi 1995; 43 (6): 836–40.

9. Галахин КА, Лобода ВИ, Логинова ЕА. Значение активности ядрышковых организаторов в диагностике предраковых изменений бронхиального эпителия. В: Матеріали III наук­практ конф «Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти». Онкология 2002; 4 (Suppl): 11–2.

10. Райхлин НТ, Филиппова НА, Смирнова ЕА, Давид Г. Опухоли трахеи, бронхов, легких и плевры. В: Ультраструктура опухолей человека. Москва: Медицина, 1981: 92–113.

11. Willis RA. Pathology of tumors. London: Butterwoeth, 1953.

12. Travis WD, Brambilla E, Muller-Hermelink HK, Harris CC (Edc.). World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. Lyon: IARC Press, 2004. 344 p.

13. Howell WM, Black DA. Controlled silver staining of nucleolar regions with protective colloidal developer: a one step method. Experientia 1980; 36: 1014–5.

14. Челидзе ПВ, Зацепина ОВ. Морфофункциональная классификация ядрышек. Усп совр биол 1988; 105 (2): 252–68.

15. Туганова ТН, Болгова ЛС, Махортова МГ, Алексеенко ОИ. Диагностический алгоритм цитологического исследования фиброаденом и рака молочной железы. Онкология 2007; 9 (4): 315–20.