СОДЕРЖАНИЕ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ВВ ПРИ МИЕЛОФИБРОЗЕ С МИЕЛОИДНОЙ МЕТАПЛАЗИЕЙ У ЛИЦ, ПОДВЕРГАВШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Миелофиброз с миелоидной метаплазией(МММ) возникает в результате злокачественной трансформации стволовой гемопоэтической клетки. Однако многие ключевые симптомы при данном заболевании связаны с пролиферацией неопухолевой популяции стромальных клеток костного мозга (КМ), в первую очередь, фибробластов. Предположения об участии в развитии фиброза мегакариоцитов первоначально основывалось на данных гистоморфологического исследования КМ. Накопление волокнистых структур наиболее интенсивно происходит в участках скопления мегакариоцитов. В дальнейшем было установлено, что фибросклеротические процессы в КМ обусловлены выделением из мегакариоцитов комплекса ростовых факторов, включая тромбоцитарный фактор роста ВВ (PDGF­ВВ) [1, 2, 3].

Известно, что PDGF — один из наиболее функционально активных и распространенных пептидных митогенов для клеток соединительной ткани. Лигандиндуцированная димеризация рецепторов PDGF­бета активирует внутриклеточные сигнальные пути, стимулирующие переход неделящихся клеток из фазы G0 в фазу G1 [4, 5], потенцируя клеточное де­

ление, проявляя антиапоптическое действие. Следует учесть, что связывание димерных изоформ PDGF происходит избирательно: рецептор PDGF­бета взаимодействует с высокой степенью афинности только с PDGF­BВ, тогда как PDGF­альфа связывает все изоформы PDGF [4, 7].

В настоящее время установлено, что в КМ ростовой фактор PDGF­BВ синтезируется не только мегакариоцитами [6, 19], но и незрелыми гемопоэтическими клетками [8, 9], фибробластами [10], а также другими, подвергшимися стимуляции, клетками крови и сосудистой стенки, такими как макрофаги [11], эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов [12, 13]. Рецепторы PDGF­бета имеются как в фибробластах [14], так и в мегакариоцитах [15, 16], макро­

фагах [17], гладкомышечных [14] и эндотелиальных клетках сосудов КМ [18, 19], в нормальных клетках миелоидной и лимфоидной (Т­лимфоциты) линий, а также в клетках этих линий при лейкозном процессе или вирусном инфицировании [20, 21, 22]. Таким образом, нельзя исключить возможность аутокринной стимуляции роста клеток, коэкспрессирующих ростовой фактор PDGF­BВ и PDGF­бета рецепторы [20, 23]. Обращает на себя внимание, что пролиферирующие клетки КМ при МММ характеризуются коэкспрессией PDGF­BВ и бета­рецепторов. Данные этих наблюдений согласуются с результатами исследований S.Y. Yoon и соавторов [9] и .. o и соавтров [24], изучавших с помощью иммуногистохимического метода распределение PDGF­ВВ и его рецепторов в клетках КМ у пациентов с МММ и негематологических больных. Авторами было установлено, что незрелые гемопоэтические предшественники в контроле и при МММ экспрессируют исключительно PDGF­ВВ димер, а также имеют PDGF­бета рецепторы.

В данной работе мы исследовали состояние кле­

ток мегакариоцитарного ростка кроветворения и определяли концентрацию PDGF­ВВ в сыворотке крови и КМ у пациентов с МММ, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения (ИИ) в результате аварии на ЧАЭС. Принимали во внимание, что ИИ является одним из непосредственных индукторов ростстимулирующих эффектов в фибробластах [1, 25], а также тот факт, что влияние ИИ на систему кроветворения в диапазоне доз, характерных для аварии на ЧАЭС, в период послерадиационной регенерации КМ, проявляется активацией темпа деления стволовых кроветворных клеток, сокращением транзитного времени созревания клеточных элементов, выходом в циркуляцию незрелых клеток­предшественников и функционально неполноценных клеток разной степени зрелости [26]. Учитывали также, что при МММ выявлено увеличение количества циркулирующих стволовых клеток в периферической крови [27].

До настоящего времени, судя по данным доступ­

ной литературы, определение и сравнение концентрации PDGF­ВВ в сыворотке крови и КМ у пациентов с МММ, подвергавшихся и не подвергавшихся действию ИИ, не проводили.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иccледована концентрация PDGF­ВВ в сыворотке крови и КМ у 23 пациентов с МММ, составивших I и II группы и у 7 лиц (III группа) без признаков онкогематологических заболеваний. I основная группа была представлена 13 пациентами с МММ, принимавшими участие в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС в 1986–1987 годах и проживающими на контролируемых территориях. По данным маршрутных листов и проведенным расчетам [28, 29], дозовые нагрузки у пациентов I группы колебались в пределах 0,01–0,25 Зв. Во II группу вошли 10 больных с МММ без наличия в анамнезе воздействия ИИ.

Для определения концентрации PDGF­ВВ ис­

пользовали набор реагентов «Qantikine, Hman PDGF­BB Immnoassay» («R & D Systems Inc.», USA). Приготовление образцов сыворотки крови и КМ, определение концентрации фактора PDGF­ВВ проводили методом ELISA, применяющимся для количественного определения концентрации человеческого PDGF­BB в супернатанте клеточной культуры, сыворотке и плазме крови [30, 31]. Все исследования повторяли трижды. Результаты исследования анализировали с учетом клинико­гематологических, цитологических данных, анализа мегакариоцитограммы аспирата КМ и гистоморфометрических исследований трепанобиоптатов КМ [32, 33, 34].

Полученные данные были обработаны с помощью общепринятых методов вариационной статистики [35], c использованием пакета программ

«icrosoft Excel 2000», достоверность различий оценивали Т­тестом, применяли методику корреляционного анализа для малых выборок [36].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Концентрация ростового фактора PDGF­ВВ в исследуемых образцах сыворотки кровии КМлицконтрольной III группы (без гематологических заболеваний и признаков фиброза КМ) варьировала в значительной степени: от 63,09 до 398,00 пг/мл в образцах КМ и от 97,72 до 331,13 пг/мл в сыворотке крови. В группе больных с МММ верхний предел колебаний был значительно выше: 141,2–3623,4 пг/мл в сыворотке КМ и 61,7–1144,3 пг/мл в сыворотке крови. Концентрация PDGF­ВВ в образцах КМ при МММ была достоверно выше таковой в контрольной группе (p < 0,05) (таблица).

Таблица Концентрация PDGF-ВВ в образцах крови и КМ больных миело-

фиброзом с миелоидной метаплазией

Примечание: по сравнению с контрольной группой *p < 0,05; **p < 0,01. Концентрация PDGF­ВВ в сыворотке крови лиц контрольной группы была равной или не превышала соответствующий показатель в КМ более чем на 20%. У больных МММ, напротив, концентрация фактора в образцах КМ была в среднем на 50% выше

по сравнению с таковой в крови (см. таблицу).

Выявлены некоторые особенности, позволяющие судить о факторах, обусловливающих концентрацию PDGF­ВВ в КМ. Учитывая, что основным источником PDGF­ВВ являются мегакариоциты, логичным было предположить наличие зависимости концентрации фактора от содержания мегакариоцитов в КМ, которое мы оценивали по значению мегакариоцитарного коэффициента (МКЦК). Для вычисления МКЦК использовали результаты ранее проведенной диагностической гистоморфометрии препаратов трепанобиоптатов КМиз заднего гребешка подвздошнойкости [34]. Прямая корреляционная связь между МКЦК и содержанием PDGF­ВВ в образцах КМ четко прослеживалась в начальной (r = 0,8309; p < 0,01) и развернутой (r = 0,8009, p < 0,01) стадиях МММ; в терминальной стадии, в фазе бластного криза, прямая корреляция сопоставляемых показателей отсутствовала (r = –0,402). Концентрация ростового фактора в фазе бластного криза значительно возрастала (рисунок), что, вероятно, обусловлено способностью секретировать его миелоидных клеток­предшественников и других клеток КМ, коэкспрессирующих PDGF­BВ и PDGF­бета­рецепторы. Зависимость между количеством МГКЦ на единицу площади гемопоэтической ткани в трепанобиоптатах КМ и содержанием фактора в периферической крови не выявлено ни в контроле, ни при МММ. В тоже время концентрация PDGF­ВВ в сыворотке крови коррелировала как в контрольной группе, так и при МММ с тромбоцитозом (r = 0,7994, p < 0,01), что подтверждает преимущественно тромбоцитарное происхождении данного фактора в сыворотке крови.

Рисунок. Концентрация PDGF­ВВ в образцах КМ при различных стадиях заболевания

Полученные предварительные данные позволяют предположить наличие ряда факторов, которые определяют концентрацию PDGF­ВВ в исследуемом образце: тромбоциты периферической крови, мегакариоциты КМ (обусловливающие повышенное содержание PDGF­ВВ в КМ у больных МММ), а также миелоидные клетки­предшественники, роль которых возрастает при бластной трансформации МММ.

По результатам наших исследований, концентрация PDGF­ВВв КМупациентов I группывначальной и развернутой стадиях МММ (1113,51 + 390,01 пг/мл) по сравнению с таковой у пациентов II группы (238,47 + 69,64 пг/мл), не подвергавшихся действию ИИ, была достоверно выше (p < 0,05) (см. рисунок), что позволяет предполагать наличие дополнительных факторов, инициированных ИИ, в реализации механизмов развития данного заболевания. К числу таких факторов можно отнести особенности регенерации КМ у лиц, подвергавшихся действию ИИ в результате аварии на ЧАЭС [26], возможность секреции PDGF­ВВ гемопоэтическими клетками предшественниками [9].

При изучении мегакариоцитограмм у больных I группы выявлено преобладание по сравнению со II группой малых и гипоглобулярных форм мегакариоцитов, включая прои мегакариобласты [33]. Содержание мегакариобластов и промегакариоцитов в парциальной мегакариоцитограмме достоверно корреллировало с уровнем PDGF­ВВ (r = 0,62; p < 0,01). Примечательно, что, по данным ряда авторов [6, 37], согласно проведенному ими цитоморфометрическому анализу, преимущественно клетки подобного типа являются секретирующей PDGF­BB популяцией. В некоторой степени этим может определяться установленная нами повышенная концентрация PDGF­BB в КМ у лиц с МММ, подвергавшихся действию ИИ.

Нами были изучены мегакариоцитограммы пациентов I, II и III групп в мазках КМ, окрашенных по Паппенгейму. Данный метод позволяет оценить степень дифференцировки и зрелости как ядра, так и цитоплазмы. У пациентов с МММ в мегакариоцитограммах была выделена популяция клеток с асинхронизмом созревания ядра и цитоплазмы. Количество подобных клеток у пациентов с МММ достоверно превышало таковое у здоровых лиц (21,0 ± 3,0 и 1,0 ± 0,4% соответственно p < 0,05).

ВЫВОДЫ

1. В КМ больных МММ I и II групп достоверно повышена концентрация PDGF­ВВ по сравнении с таковой у лиц III группы, а также отмечена тенденция к повышению PDGF­ВВ в сыворотке крови.

2. Выявлена корреляционная зависимость между содержанием PDGF­ВВ в образцах КМ и числом мегакариоцитов у больных с МММ I и II групп вне стадии бластного криза; при развитии последнего, преимущественным источником секреции PDGF­ ВВ, вероятно, становятся гемопоэтические клетки предшественники.

3. Более высокое содержание PDGF­ВВупациентов I группы, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС, в начальной и развернутой стадиях МММ по сравнению с таковым у пациентов II группы, ассоциировано с особенностями костномозгового кроветворения у пациентов I группы: увеличением количества гемопоэтических клеток­предшественников, а также незрелых клеток мегакариоцитарного ряда, в наибольшей степени секретирующих PDGF­ВВ.

4. Результаты проведенных исследований свидетельствуют об участии PDGF­ВВ в развитии миелофиброза и миелопролиферативного процесса при МММ. Они также отражают опосредованно влияние ионизирующего излучения на течение данного заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Колосков АВ. Мегакариоциты и фиброз костного мозга. Гематол трансфузиол 1997; 42 (1): 29–31.

2. Castro-Malaspina H, Rabellino EM, Yen A, et al. Hman megakaryocyte stimlation of proliferation of bone marrow fibrosis. Blood 1981; 57: 781–7.

3. Reilly JT. ytogenetic and moleclar genetic aspects of idiopatic myelofibrosis. Acta Haematol 2002; 108 (3): 113–9.

4. Heldin C.-H, Westermark B. Platelet­derived growt factor: mecanism of action and possible in vivo fnction. ell Regl 1990; 1: 555–66.

5. Ostman A, Andersson M. Identification of a cell retention signal in te B­cain of platelet derived growt factor and in te long splice version of te A­cain. ell Regl 1991; 2: 503–12.

6. Wickenhauser C, Hillienhof A, Jungheim K, et al. Detection and qantification of transforming growt factor beta (TGF­beta) and platelet­derived growt factor (PDGF) release by normal

   man megakaryocytes. Lekemia 1995; 9 (2): 310–5.

7. Claesson-Welsh I, et al. cDNA cloning and expression of te man A­type platelet­derived grows factor (PDGF) receptor establises strctral similarity to te B­type PDGF receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 4917–21.

8. Miyazono K, Takaku F. Platelet­derived growt factors. Blood Rev1989; 3 (4): 269–76.

9. Yoon SY, Tefferi A, Li CY. elllar distribtion of platelet­ derived growt factor, transforming growt factor­beta, basic fibroblast growt factor, and teir receptors in normal bone marrow. Acta Haematol. 2000; 104 (4): 151–7.

10. Paulsson Y, Hammacher A, Heldin C-H, Westermark B.

    Possible positive atocrine feedback in te prereplicative pase of

    man fibroblasts. Natre 1987; 328: 715–7.

11. Shimokado K, Raines EW, Madtes DK, et al. A significant part of macropage­derived growt factor consists of at least two forms of PDGF. ell 1985; 43: 277–86.

12. Nilsson J, Sjolund M, Palmberg L, et al. Arterial smoot mscle cells in primary cltre prodce a platelet­derived growt factor­like protein. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: 4418–22.

13. Dicorleto PE, Bowen-Pope DF. ltred endotelial cells prodce a platelet­derived growt factor­like protein. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 1919–23.

14. Heldin C-H, Westermark B. ecanism of action and in vivo role of platelet­derived growt factor. Pysiol Rev 1999; 79: 1283–316.

15. Daynes RA, Dowell T, Araneo BA. Platelet­derived growt factor is a potent biologic response modifier of T cells. Exp ed 1991; 174: 1323–33.

16. De Parseval N, Fichelson S, Mayeux P, et al. Expression of fnctional platelet­derived growt factor receptors on

    ematopoietic cell lines. ytokine 1993; 5: 8–15.

17. Inaba T, Shimano H, Gotoda T, et al. Expression of platelet­ derived growt factor . receptor on man monocyte­derived macropages and effects of platelet­derived growt factor BB dimer on te celllar fnction. Biol em 1993; 268: 24353–60.

18. Bar RS, Boes M, Booth BA, et al. Te effects of platelet­ derived growt factor in cltred microvessel endotelial cell. En­ docrinology 1989; 124: 1841–8.

19. Smits A, Hermanson M, Nister M, et al. Rat brain capillary endotelial cells express fnctional PDGF B­type receptors. Growt Factors 1989; 2: 1–8.

20. Yoon SY, Tefferi A, Li CY. elllar distribtion of platelet­ derived growt factor, transforming growt factor­beta, basic fibroblast growt factor, and teir receptors in normal bone marrow. Acta Haematol 2000; 104 (4): 151–7.

21. Pantazis P, Goustin AS, Nixon J. Platelet­derived growt factor and its receptor in blood cell differentiation and neoplasia. Er Haematol 1990; 45 (3): 127–38.

22. Шитикова АС. Тромбоцитарный гемостаз. СПб: Издательство СПб ГМУ, 2000. 227с.

23. Bonner JC. Reglation of PDGF and its receptors in fibrotic diseases. ytokine Growt Factor Rev 2004; 15 (4): 255–73.

24. Chou JM, Li CY, Tefferi A. Bone marrow immno­

    istocemical stdies of angiogenic cytokines and teir receptors in myelofibrosis wit myeloid metaplasia. Lekemia Res 2003; 27 (6): 499–504.

25. Зуброва СГ, Быкова ТВ, Зарицкий АЮ и др. Влияние ионизирующей радиации на функциональную активность макрофагов. Вопр онкологии. 1996; 45 (6): 645–9.

26. Білько НМ. Кровотворні клітини­попередники при радіаційному опроміненні. [Автореф дис … д­ра мед наук]. Київ: ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Український науково­дослідний інститут онкології і радіології МОЗ України.Київ. 1998. 31 с.

27. Chervenick PA. Increase in irclating Stem ells in Patients wit yelofibrosis. Blood 1973; 41 (1): 67–71.

28. Likhtarev IA, Kovgan LN, Jacob P, Anspaugh LR.

    ernobyl accident: retrospective and prospective estimates of external dose of te poplation of Ukraine. Healt Pys 2002; 82: 290–303.

29. Чумак ВВ, Баханова ЕВ, Мусияченко НВ и др. Дозиметрия ликвидаторов через 14 лет после Чернобыльской аварии: проблемы и достижения. Межд Журн Радиац Медицины 2000; 1: 26–45.

30. Raines EW. Platelet­derived growt factor. Sporn B, Roberts AB. Eds. Peptide Growt Factors and teir Receptors I. 1991: 173–242.

31. Eming SA, Martin L, Yarmush, et al. Reglation of te Spatial Organization of esencymal onnective Tisse: Effects of ell­Associated verss Released Isoforms of Platelet­Derived Growt Factor Am Patol 1999; 154: 281–9.

32. Byelinska IV, Kabachenko IN, Dyagil IS. egakaryocytes morpology in idiopatic (primary) myelofibrosis. Rep Pract On­ col Radioter 2004; 9: 223–8.

33. Kabachenko IN, Byelinska VI, Klymenko SV, et al.

    egakaryocytopoiesis in clean­p workers of te ernobyl accident wit myelofibrosis wit myeloid metaplasia. Annals of Oncology. Volme 15. Abstract Book of te 29t ESO ongres, Vienna, Astria, 2004; 3 (Sppl.): 164.

34. Кабаченко ИН, Бебешко ВГ, Грабовой АН и др. Особенности структурной организации костного мозга при различных стадиях миелофиброза с миелоидной метаплазией. Вісник морфології 2005; 2: 164–8.

35. Сергиенко ВИ, Бондарева ИБ. Математическая статистика в клинических исследованиях. Москва: ГЭОТАРМЕД, 2001. 256 с.

36. Каминский ЛС. Обработка клинических и лабораторных данных. Медгиз: Ленинградское отделение, 1959. 196 с.

37. Kimura A, Katoh O, Hyodo H, et al. Platelet derived growt factor expression, myelofibrosis and cronic myelogenos leke­ mia. Lek Lympoma. 1995 l; 18 (3–4):237–42.

CONTENTS OF THE PLATELET GROWTH FACTOR BB IN MYELOFIBROSIS