МІКРОГЕТЕРОГЕННІСТЬ Α-КИСЛОГО ГЛІКОПРОТЕЇДУ ПРИ ОНКОЛОГІЧНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ ТА ЗАПАЛЬНИХ ПРОЦЕСАХ

ВСТУП

Альфа (α)-1-кислий глікопротеїд (АГП), або орозомукоїд — білок сироватки крові, що відноситься до групи білків гострої фази запалення. Молекулярна маса АГП — 41–43 кДа, він містить близько 45% вуглеводів і має дуже високий негативний заряд. Поліпептидний ланцюг АГП складається із 183 амінокислот, підтримується двома дисульфідними зв’язками між залишками цистеїну і включає п’ять залишків аспарагіну, що зв’язані з N-гліканами комплексного типу [1]. У крові орозомукоїд присутній у вигляді декількох молекулярних форм, ідентичних за первинною послідовністю поліпептидної частини, але різних за складом вуглеводних ланцюгів і відповідно за біологічною активністю [2].

АГП синтезується в основному у печінці та част-

ково в інших органах, у тому числі в осередках пухлинного росту [3]. Нещодавно показано, що АГП може синтезуватись мієлоцитами та секретуватись вторинними гранулами поліморфноядерних нейтрофілів [4]. Відомо, що у нормі синтезується АГП, який містить бі-, трита тетраантенні N-глікани, a при запальних процесах превалює АГП з біантенними гліканами [5]. Онкологічні захворювання супроводжуються підвищенням вмісту поліантенних гліканів внаслідок підвищення експресії 1,4- та 1,6-розгалужених трита тетраантенних структур [6]. Орозомукоїд, що секретується активованими нейтрофілами, має більшу молекулярну масу за рахунок підвищення фукозильованості його гліканів та наявності полілактозамінних залишків [4]. Таким чином, кількість і співвідношення глікоформ АГП, що циркулюють у крові, залежать від джерел його син-

тезу та можуть повною мірою відображати патологічний процес у організмі людини.

Мета роботи — порівняння вмісту АГП та його глікозильованості при різних онкологічних захворюваннях та запальних процесах.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Обстежено 71 хворого віком від 20 до 68 років, з них 45 — з онкологічною патологією, 26 — з запальними процесами різного генезу. До першої групи увійшли 8 хворих на гострі лейкемії (ГЛ) та 15 — на хронічні лейкемії (ХЛ): 9 — на хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ) та 6 — на хронічний мієлолейкоз (ХМЛ). У 4 пацієнтів діагностована множинна міє- лома; у 2 — В-клітинна лімфома; у 16 обстежених діагностовані солідні злоякісні пухлини панкреатодуоденальної зони (ПДЗ). Другу групу становили 17 пацієнтів, у яких діагностовано гострий вірусний гепатит (ГВГ); 6 — з синдромом системної запальної відповіді (SIRS) та 3 — гострою позагоспітальною пневмонією. У всіх пацієнтів виключено супутню патологію. У контрольну групу увійшли 26 практично здорових осіб відповідного віку (жінки і чолові- ки), що не мали гострозапальних явищ на початок дослідження.

Вміст АГП визначали методом ракетного елект-

рофорезу в 1% агарозному гелі, що містив моноспецифічну поліклональну антисироватку до цього глікопротеїду (рис. 1). Антисироватку до АГП отримували імунізацією кролів внутрішньошкірно препаратом білка фірми «Sigma» (G9885-5MG) за розробленою схемою. Специфічність одержаних антитіл доводили методами імуноелектрофорезу та імуноблотінгу. Для оцінки співвідношення глікоформ АГП

проводили перехресний афінний імуноелектрофорез (ПАІЕ) у 1% агарозному гелі у присутності у першому напрямку лектину Canavalia ensiformis (ConA) або Phaseolus vulgaris (PHA-L) («Лектинотест», Украї- на), у другому напрямку — антитіл до АГП. Для всіх варіантів електрофорезу використовували трис-вероналовий буфер (рН 8,6). Взаємодія АГП з ConA зумовлює появу трьох піків, що характеризують ступінь спорідненості до лектину (рис. 2). При цьому пік 1(АГП-1) представлений молекулами АГП, що не зв’язуються з лектином, пік 3 (АГП-3) — молекулами із сильною спорідненістю до лектину, а пік 2 (АГП-2) — проміжний варіант із слабкою спорідненістю. Прийнято, що фракція АГП-3 містить 2 та більше біантенних N-гліканів, АГП-2 — 1 сайт з біантенним гліканом та інші 4 — з трьохта тетраантенними; АГП-1 містить лише поліантенні структури [7]. PHA-L має спорідненість до розгалужених N-гліканів і, навпаки, не зв’язує біантенні структури [8]. При взаємодії АГП з PHA-L утворюється два піка: АГП-1 – фракція, що не зв’язується і АГП-2 — фракція, що зв’язується з лектином (див. рис. 2).

Рис. 1. Ракетний імуноелектрофорез у гелі, що містить антисироватку до АГП (10 мкл/см2): лунки 1–4 — контрольні розчини, що містять відповідно 0,25, 0,32, 0,43 та 0,63 мг АГП; лунки 5–8 — розведена у 30–40 разів сироватка хворих

ã ä å

Рис. 2 . ПАІЕ АГП з Con A ( а , б , в ) та PHA- L (г, д, е): а, г — сироватка крові осіб контрольної групи; б, д – пацієнтів 1-ї групи; в, е — 2-ї групи.

У лунку вносили 10 мкл сироватки. Електрофорез у першому напрямку здійснювали у присутності ConA (1 мг/мл) або PHA-L (2 мг/мл), у другому напрямку — у присутності антисироватки до АГП (6 мкл/см2).

1, 2, 3 – фракції АГП-1, АГП-2, АГП-3 за взаємодією з ConA.

1а, 2а – фракції АГП-1, АГП-2 за взаємодією з PHA-L

Кількісне визначення білка проводили за виміром площі преципітаційного піка, статистичну обробку — за допомогою ліцензійної прикладної комп’ютерної програми «Statgraf» на ПК Intel Pentium ІІІ. Вірогідність відмінностей визначали за

допомогою критерію Стьюдента та для малих виборок — U-критерію Уілкоксона.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вміст АГП достовірно підвищується (p < 0,001) у всіх групах хворих порівняно із контрольною групою (рис. 3). Це можна оцінювати як адекватну реакцію організму на патологічні процеси, що направлена на відновлення гомеостазу. Найбільший рівень АГП відзначено у пацієнтів з SIRS, що може бути зумовлено проявами поліорганної недостатності. У хворих на пневмонію та ГВГ рівень АГП становив 1,66 ± 0,22 та 1,49 ± 0,17 мг/мл відповідно, що у 2 рази вище, ніж у контрольній групі. При злоякісних новоутвореннях лімфоїдної тканини рівень АГП достовірно вище, ніж при солідних пухлинах ПДЗ. Враховуючи сучасні дані про секрецію АГП активованими нейтрофілами, вважається, що за наявності перших вони є додатковим джерелом АГП.

Рис. 3. Вміст АГП у сироватці крові пацієнтів з онкозахворюваннями та із гострим запаленням

* Достовірна різниця порівняно з показниками контрольної групи (р < 0,001).

При порівнянні вмісту АГП у хворих з різними формами лейкемії, лімфомою та множинною мієломою (рис. 4) достовірної різниці між вмістом АГП при ХЛ та ГЛ не виявлено. При ХЛЛ, ХМЛ, лімфомі середній вміст АГП становив відповідно 2,40 ± 0,21 та 2,30 ± 0,21 мг/мл, тоді як при множинній міє- ломі – лише 1,37 ± 0,16 мг/мл (p < 0,05), що може бути зумовлено наявністю у випадках останньої генералізації пухлинного процесу. При загостренні лейкемічного процесу з приєднанням аутоімунного компонента у вигляді гемолізу та тромбоцитопенії вміст орозомукоїду значно вище порівняно із лейкеміями без аутоімунних ускладнень.

Розподілення глікоформ АГП за спорідненістю до лектинів ConA та PHA-L наведено у таблиці. За даними у нормі співвідношення АГП-1 : АГП-2 : АГП-3 становить 42,5 : 49,3 : 8,2. Зміна ConA-зв’язуючої здатності АГП більш виражена при ГВГ та пухлинах ПДЗ. Слід відзначити, що і при ГВГ, і при пухлинах ПДЗ виявляють різке зниження вмісту фракції АГП-3 практично до повного її зникнення при пухлинних процесах. Лише у 2 пацієнтів з досліджених 16 з пухлинами ПДЗ виявлена ця фракція, у інших

14 — відсутня (див. рис. 2б). Виходячи із специфічності ConA, можна зробити висновок про значне зменшення кількості двохантенних гліканів та пропорційне йому підвищення вмісту трита тетраантенних структур у складі орозомукоїду при пухлинах ПДЗ. Утворення розгалужених N-гліканів залежить від активності GlcNAc-трансферази V (GnT-V) та N-ацетилглюкозамінілтрансферази ІІІ (GnT-ІІІ), що ініціюють у транс-Гольджі утворення GlcNAcβ- 1,6Man- та GlcNAcβ-1,4Man-зв’язків і генерують, таким чином, структурне розходження зрілих N-глі- канів [9]. Можна припустити, що підвищення вмісту поліантенних гліканів у складі орозомукоїду при пухлинах ПДЗ може бути наслідком підвищеної активності цих ферментів.

Рис. 4. Вміст АГП (г/л) у сироватці крові пацієнтів зі злоякісними новоутвореннями

* Достовірна різниця порівняно з показниками контрольної групи (р < 0,001).

Тенденцію до зменшення фракції АГП-3 відзначали і у інших хворих 1-ї та 2-ї групи. Оскільки при захворюваннях кровотворної тканини та запальних станах не відзначено статистично достовірної різниці порівняно з нормою, використовували індекс зв’язування, що враховує не лише мікрогетерогенність орзомукоїду, але і його концентрацію. Цей індекс обчислювали як відношення вмісту АГП у піках 2 та 3 (%) до його концентрації у сиворотці крові. За наведеними даними індекс зв’язування у пацієнтів з лейкемією у 3–4 рази (достовірно) нижче порівняно із нормою (див. таблицю). Таку від-

мінність відзначають і у пацієнтів з іншими дослідженими патологічними процесами. Серед обстежених найвищий індекс зв’язування (0,42) відзначено при мієломах. Таким чином, зміна співвідношення глікоформ АГП є більш чутливим та специфічним показником розвитку патологічного процесу, ніж визначення його концентрації у крові, а індекс зв’язування є більш інформативним, ніж співвідношення глікоформ АГП, особливо при аналізі даних у пацієнтів з лейкеміями.

Зміна глікозильованості АГП за умов запальних процесів та онкозахворювань підтверджена при дослідженні взаємодії АГП з лектином PHA-L. За нормою, превалюючою фракцією орозомукоїду є АГП-2, на його долю приходиться 86,56% загального АГП (див. таблицю). Отримані дані узгоджуються з результатами інших дослідників, що більша частина АГП печінки містить N-глікани з трьома та більше антенами [1]. Результати порівняння спорідненості АГП за умов патологічних станів показали, що при ПДЗ, ВГВ та SIRS має місце достовірне підвищення АГП-2, а за умов пневмонії та ХМЛ – зниження цієї фракції . Враховуючи специфічність PHA-L, можна стверджувати, що у хворих на ПДЗ, ВГВ або SIRS збільшується кількість розгалужених N-гліканів у структурі АГП, а на пневмонію та лейкемію — навпаки знижується.

Виявлені також значні відмінності у загальному характері глікозильованості при порівнянні груп пацієнтів з пухлинами ПДЗ та лейкеміями. Так, у хворих з пухлинами ПДЗ достовірно підвищується вміст розгалужених структур орозомукоїду, тоді як у пацієнтів з лейкеміями такі зміни не відзначають. Ймовірно, що у першому випадку переважаюча частка АГП, циркулюючого у крові, представлена пулом, синтезованим у гепатоцитах, тоді як при захворюваннях кровотворної тканини присутній також АГП, синтезований лейкоцитами [4]. Слід відзначити, що у багатьох випадках встановлюють не чітке відокремлення фракції, що не зв’язується PHA-L (див. рис. 2д). Це може вказувати на ще більш суттєві зміни у глікозуванні орозомукоїду, які пов’язані зі зміною фукозильованості або сіальованості цього глікопротеїду [10]. Вважається, що подальші до-

Таблиця

Вміст АГП та співвідношення лектинзв’язуючих фракцій АГП у сироватці крові обстежених пацієнтів (%)

Примітка. Достовірність різниці порівняно з показниками контрольної групи: *р < 0,001, **р < 0,05, ***р < 0,01.

слідження мікрогетерогенності орозомукоїду є перспективним напрямком пошуку специфічних діагностичних маркерів патологічних станів.

ВИСНОВКИ

1. Рівень АГП підвищується у 2–4 рази у сироватці крові у пацієнтів з гострими запальними процесами та онкозахворюваннями різного гістогенезу.
2. При злоякісних новоутвореннях лімфоїдної тканини (лейкемії, лімфоми) рівень АГП достовірно вищий, ніж при солідних пухлинах ПДЗ і при множинній мієломі.
3. У пацієнтів із ГВГ та пухлинами ПДЗ має місце достовірне підвищення вмісту поліантенних структур у складі АГП.
4. Відсутність глікоформи АГП, що сильно зв’язується з ConА, є характерною особливістю при пухлинах ПДЗ.
5. PHA-L-зв’язуюча здатність АГП при гострих пневмоніях достовірно нижче як порівняно із нормою, так із SIRS.

ЛІТЕРАТУРА

1. Willem VD, Brinkman-Van der Linden, Els CM, et al. Glycosylation of α1-Acid Glycoprotein (Orosomucoid) in Health and Disease: Occurrence, Regulation and Possible Funtional Implications. Tren Glycos Glycotechnol 1998; 10 (53): 235–45.

2. Олейников ВА, Ковнер МА, Куделина ИА и др. Роль углеводной части a-кислого гликопротеина в структурной организации его полипептидной цепи. Исследование методами спектроскопии кругового дихроизма и комбинационного рассеяния. II съезд биофизиков России. Тезисы. Москва, 1999 (раздел 1: Структура и динамика белков и их комплексов).

3. Fournier T, Medjoubi-N N, Porquet D. α-Acid Glycoprotein Levels in Human Immunodeficiency Virus-Infected Subjects on Antiretroviral Regimens. Biochim Biophys Acta. 2000; 1482: 157–71.

4. Theilgaard-Mönch K, Jacobsen L, Rasmussen T, et al. Highly glycosylated α1-acid glycoprotein is synthesized in myelocytes, stored in secondary granules, and released by activated neutrophils. J Leuk Biol 2005; 78: 462–70.

5. Handerson T, Pawelek J. β1,6-branched Oligosaccharides and Coarse Vesicles: A Common, Pervasive Phenotype in Melanoma and Other Human Cancers. Cancer Res 2003; 63 (17): 5363–9.

6. Dennis JW, Granovsky M, Warren CE. Glycoprotein glycosylation and cancer progression. Biochim Biophys Acta 1999; 1473: 21–34.

7. Orczyk-Pawiłowicz M, Hirnle L, Kątnik-Prastowska I. Alterations of N-glycan branching and expression of sialic acid on amniotic fluid alpha-1-acid glycoprotein derived from second and third trimesters of normal and prolonged pregnancies. Clin Chim Acta 2006; 367 (1–2): 86–92.

8. Антонюк ВО. Лектини (глава у монографії). Львів: Кварт, 2005. 550 с.

9. Kobata A, Amano J. Altered glycosylation of proteins produced by malignant cells, and application for the diagnosis and immunotherapy of tumors. Immunol Cell Biol 2005; 83: 429–39.

10. Ryden I, Pahlsson P, Lindgren S. Diagnostic Accuracy of α1-Acid Glycoprotein Fucosylation for Liver Cirrhosis in Patients Undergoing Hepatic Biopsy Clin Chem 2002; 48: 2195–201.