ДОСЛІДЖЕННЯ РОЛІ IL-2 ПРИ ГОСТРІЙ ЛІМФОБЛАСТНІЙ ЛЕЙКЕМІЇ У ДІТЕЙ

ВСТУП

При розвитку злоякісного процесу, зокремагострої лімфобластноїлейкемії(ГЛЛ) удітей, завждиєзагроза порушення будь-яких із етапів системної та локальної імунної відповіді. У загальному переліку різних причин, які сприяють цьому (саме захворювання, цитостатична терапія, що застосовується, харчування, психологічні фактори та інше), одне із провідних місць належить розвитку дисбалансу в імунній системі з неоднозначною реалізацією її біологічної функції. Інтерлейкіни, як її складова, безпосередньо беруть участь у патологічних процесах і можуть індукувати один і той самий імунологічний ефект, що дає можливість класифікувати їх в окремі групи [1, 5, 8, 9]. Наявність чи відсутність деяких цитокінів може значно змінити первинний результат цитокінової дії. Значна більшість цитокінів має плеотропну дію, впливаючи на клітини різних систем різними способами [2, 6].

До групи інтерлейкінів, які є основними індук-

торами цитотоксичної активності різних кілерних клітин, у першу чергу відноситься IL-2. Вивченню IL-2 присвячено чимало робіт, що пояснюється не тільки його вираженою здатністю індукувати активність практично всіх клонів цитотоксичних клітин, але й тим, що він є першим інтрелейкіном, у якого виявили цю здатність [1, 4, 7]. На сьогодні результати досліджень щодо участі IL-2 у розвитку ГЛЛ у ді- тей є незначними. Недостатньо вивчена активність цього медіатора та його біологічна роль у регуляції імунної відповіді при даній хворобі. Не відомо також, чи може IL-2 бути прогностичним імунологічним маркером перебігу ГЛЛ у дітей.

Мета проведеного дослідження — вивчити ди-

наміку змін концентрації IL-2 у сироватці крові ді- тей, хворих на ГЛЛ, а також з’ясувати його біологічну роль на різних етапах перебігу процесу.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Під спостереженням перебувало 87 дітей, у яких було діагностовано ГЛЛ і які отримали інтенсивну терапію за протоколами ГЛЛ-ДГЛЛУ-93, 95 (модифікований протокол німецької групи Berlin-

Frankfurt-Münstеr, ALL-BFM-90, 95). З них — 49 хлопчиків (56,3%), дівчаток — 38 (43,7%). Меді- ана віку пацієнтів складала 6 років 7 міс (коливання від 3 міс до 15 років 2 міс), зокрема, медіана віку хлопчиків була 4 роки 9 міс (коливання від 3 міс до 13 років 7 міс) і дівчаток — 5 років 5 міс (коливання від 7 міс до 14–15 років 2 міс). Дітей основної групи розподіляли також на окремі вікові категорії: 1–5 років (n = 29), 6–10 років (n = 27) та 11–14 років (n = 31).

Діагноз ГЛЛ базувався на результатах клінічного, гематологічного, цитологічного та імунофенотипового досліджень клітин крові та кісткового мозку. Дослідження IL-2 у сироватці крові дітей, хворих на ГЛЛ, здійснювалося перед початком цитостатичного лікування, під час програмної терапії, на етапі повного її завершення та в різні терміни довготривалої ремісії, а також при виникненні рецидиву захворювання. Частина хворих обстежувалася повторно декілька разів на різних етапах лікування та термінах довготривалої ремісії. Усього проведено 116 досліджень. Контрольну групу склали діти віком від 1 до 14 років (n = 83), які були практично здорові.

Рівень сироваткового IL-2 визначався імунохемілюмінісцентним методом (Immulite 1000, США) з використанням стандартних тест-одиниць (принцип твердофазового хемілюмінісцентного імуноферментного аналізу). Для проведення дослідження цим методом відбирали кров хворого з вени у звичайну пробірку та відділяли сироватку. Для проведення одного тесту використовували 200 мкл сироватки крові, яку поміщали у чисту пластикову пробірку, а пізніше у штатив. Штатив для пробірок з взірцями сироватки хворого разом з тест-одиницями поміщали на завантажувальний ланцюг, за допомогою якого пробірки потрапляли в інкубаційну карусель з реактивами. У подальшому 25 мкл сироватки автоматично аспірувалося та змішувалося з хемілюмі- нісцентним субстратом. За допомогою люмінометра відбувалося зчитування результату.

Для проведення аналізу кореліцяйних взаємоз’вязків між IL-2 та окремими показниками клі-

тинного та гуморального імунітету у дітей, хворих на ГЛЛ, проводили кількісне визначення CD3+-, CD3+CD4+-, CD3+CD8+-, CD8+CD28+-,

CD8+CD28–-, CD16/56+-, CD19+-лімфоцитів (метод проточної лазерної цитофлюориметрії, Faxcalibur, Bekton and Dickinson, США) та вміст імуноглобулі- нів IgA, IgM, IgG у сироватці крові (метод кінетичної нефелометрії, Beckman, США).

Статистичну обробку отриманих результатів проведено за програмою «Statistica 5,5» (StatSoft, Tulsa, OK, USA).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Перед початком програмної терапії ГЛЛ у дітей різного віку середня концентрація IL-2 у сироватці крові в середньому складала 129,61 ± 1,32 pg/ml при індивідуальних коливаннях 97,74–135,64 pg/ml і значно відрізнялася від такої у дітей контрольної групи (10,06 ± 0,82 pg/ml; р < 0,05) (табл. 1). Слід відзначити, що у дітей віком від 1 до 5 років основної групи середній рівень IL-2 у сироватці крові на даному етапі дослідження був найвищим (127,41 ± 1,23 pg/ml) порівняно з іншими віковими категоріями дітей. Зокрема, у дітей 6–10 років середній вміст цього цитокіна складав 118,34 ± 1,56 pg/ml, а у підлітків 11–14 років — 117,11 ± 0,84 pg/ml. Нами не виявлено суттєвої різниці між концентраціями IL-2 у сироватці крові дітей з ГЛЛ різного віку перед початком цитостатичного лікування (р > 0,05).

Під час проведення поліхіміотерапії середній рівень IL-2 у сироватці крові дітей основної групи значно знизився порівняно з попереднім етапом дослідження і в середньому становив 15,7 ± 0,37 pg/ml при індивідуальних коливаннях 13,54–33,42 pg/ml. Найвищим він виявився у дітей з ГЛЛ віком 6–10 років (18,09 ± 0,65 pg/ml) і суттє- во відрізнявся від такого у дітей контрольної групи (9,51± 0,72 pg/ml). Нами не виявлено суттєвої різниці між концентраціями IL-2 у сироватці крові дітей основної групи з огляду на вік (p > 0,05). Після завершення цитостатичного лікування середній рівень IL-2 у сироватці крові дітей з ГЛЛ за всіма віковими категоріями в динаміці дещо зріс і в середньому становив 23,07 ± 0,44 pg/ml. Характерно,

що порівняно із попереднім етапом дослідження, суттєвої різниці у показниках даного інтерлейкіна у сироватці крові дітей основної групи не виявлено (р > 0,05). Проте порівняно із такими показниками у дітей контрольної групи спостерігалася суттєва різниця (р < 0,05).

На різних етапах довготривалої ремісії середня концентрація IL-2 у сироватці крові дітей з ГЛЛ була низькою і в середньому складала 23,61± 0,52 pg/ml (табл. 2). Упродовж усього періоду спостереження середній вміст цього цитокіну у сироватці крові ді- тей основної групи суттєво відрізнявся від такого у дітей контрольної групи (р < 0,05). Особливо ця різниця була помітною на етапі довготривалої ремісії з терміном 3–5 років. Щодо характеристики вмісту IL-2 у сироватці крові дітей з ГЛЛ у віковому аспекті, встановлено, що він був вищим у 6–10-річних дітей. Цей показник у середньому складав 25,16 ± 0,45 pg/ml при індивідуальних коливаннях 17,61–35,52 pg/ml. В інших вікових групах середня концентрація IL-2 у сироватці крові була такою: у дітей 1–5 років — 23,50 ± 0,38 pg/ml; у підлітків 11–14 років — 22,53 ± 0,45 pg/ml відповідно. Динаміка змін концентрації IL-2 у сироватці крові дітей з ГЛЛ показана на рисунку.

Рисунок. Динаміка змін концентрації IL-2 у сироватці крові дітей з ГЛЛ

Нами вивчено кореляційні взаємозв’язки між рівнем сироваткового цитокіну та окремими показниками клітинного та гуморального імунітету у ді- тей, хворих на ГЛЛ.

Таблиця 1 Показники концентрації IL-2 (pg/ml) у сироватці крові дітей з ГЛЛ перед початком лікування та на різних етапах програмної терапії

*Достовірна відмінність по відношенню до дітей контрольної групи.

Показники концентрації IL-2 (pg/ml) у сироватці крові дітей з ГЛЛ у різні терміни довготривалої ремісії

Таблиця 2

*Достовірна відмінність по відношенню до дітей контрольної групи.

За отриманими даними на різних етапах програмної терапії та термінах довготривалої ремі- сії спостерігався переважно слабкий кореляційний зв’язок з від’ємним значенням між сироватковим IL-2 та окремими субпопуляціям Т-лімфоцитів (табл. 3).

Водночас зв’язок між рівнем цитокіну та кількістю CD8+CD28–-лімфоцитів периферичної крові дещо відрізнявся, оскільки як і під час протипухлинної терапії, так і на етапі її завершення, він був тісним (rxy = –0,73 та rxy = –0,60). Однак у різні пері- оди довготривалої ремісії ступінь кореляції знижу-

вався, а її напрямок змінювався. Особливо це було

помітно у ранні терміни повного одужання дітей

Таблиця 4 Концентрація IL-2 у сироватці крові при рецидивах ГЛЛ у дітей

*Достовірна відмінність по відношенню до дітей контрольної групи.

За отриманими даними середній рівень IL-2 у ді- тей при рецидиві ГЛЛ був значно нижчим порівняно із таким, що спостерігався перед початком лікування у хворих із відповідним варіантом захворювання у перший гострий період (р < 0,05). Необхідно зазначити, що при рецидиві В-ГЛЛ, незалежно від терміну його виникнення, середня концентрація IL-2

основної групи (rxy = 0,14).

була вищою (19,47 ± 0,20 pg/ml) порівняно із такою

при рецидиві Т-ГЛЛ (17,14 ± 0,17 pg/ml). Однак, не-

Відмінності також стосувалися й окремої субпопуляції лімфоцитів — CD16/56+ (див. табл. 3). Під час проведення програмної терапії даного гемобластозу у дітей, на етапі її завершення, а також у ранні терміни довготривалої ремісії кореляційний зв’язок між сироватковим IL-2 та CD16/CD56+– лімфоцитами периферичної крові був слабким, переважно з від’ємним значенням. У пізні терміни довготривалої ремісії кореляція показників була помірною при незмінному її напрямку.

Щодо співвідношення між рівнем сироваткового IL-2 та імуноглобулінів (IgA, IgM, IgG) слід відзначити, що під час проведення інтенсивної фази цитостатичного лікування та підтримувальної терапії кореляційний зв’язок був незначним (див. табл. 3). Проте на етапі повного завершення програмної терапії та впродовж усього періоду спостереження у різні терміни довготривалої ремісії кореляція зростала до сильної, набуваючи при співставленні IL-2 / IgM, IL-2 / IgG протилежного напрямку. Аналогічну закономірність спостерігали при аналізі кореляційних зв’язків між сироватковим IL-2 та CD19+– лімфоцитами периферичної крові.

Нами не встановлено суттєвої різниці у зв’язку

між концентрацією ІL-2 та окремими показниками клітинного і гуморального імунітету у дітей, хворих на ГЛЛ, з огляду на вік (р > 0,05).

Вивчено також концентрацію IL-2 у сироватці крові дітей при рецидивах ГЛЛ з урахуванням варі- анта захворювання (табл. 4).

зважаючи як на термін виникнення рецидиву хвороби, так і її варіант, рівень IL-2 у сироватці крові дітей основної групи суттєво відрізнявся від такого у дітей контрольної групи (р < 0,05).

Нами також проведено аналіз кореляційних зв’язків між абсолютною кількістю бластних клі- тин у периферичній крові та концентрацією IL-2 у дітей, хворих на ГЛЛ (табл. 5).

Таблиця 5 Кореляційні зв’язки між кількістю бластних клітин у

периферичній крові та концентрацією IL-2 у хворих на ГЛЛ дітей

Як свідчать отримані результати, сильний кореляційний зв’язок із додатнім значенням виявлено перед початком програмної терапії у перший гострий пері- од. При рецидиві захворювання сила і напрямок цього взаємозв’язку були незмінними. Нами не виявлено суттєвої різниці у силі зв’язку між різною абсолютною кількістю бластних клітин у периферичній крові та концентрацією IL-2 у сироватці крові. За даними доступної літератури при різних неопластичних процесах, у тому числі й при ГЛЛ у дітей, може спостері- гатися знижена продукція IL-2 лімфоцитами периферичної крові, що нерідко корелює із зниженням активності кілерних клітин [4, 7, 9]. Проте достовірне зниження продукції IL-2 спостерігається, як пра-

Таблиця 3

Кореляційні взаємозв’язки між концентрацією IL-2 та окремими показниками клітинного та гуморального імунітету у хворих на ГЛЛ дітей

вило, у пізній стадії захворювання. Інші автори також засвідчують, що зниження концентрації IL-2 у сироватці крові хворих на ГЛЛ дітей спостерігається у пізній стадії при відсутності достовірних змін на ранній стадії захворювання [2, 5, 8]. Інші вчені засвідчують важливу роль IL-2 та IL-2-рецептора (СD25) в генерації цитотоксичних Т-лімфоцитів у дітей з ГЛЛ. Секреція цитокіну IL-2 супроводжувалася експресією СD25 в основному на мембранах Т-лімфоцитів [3, 6, 7]. Ці дані підтверджуються результатами, отриманими при дослідженні концентрації IL-2 у сироватці крові дітей з даною формою лейкемії. Вона була суттєво вищою під час програмної терапії та нижчою після її завершення порівняно зі здоровими дітьми [2, 7, 9].

Слід зазначити, що принципово важливим в оцін-

ці значення медіатора IL-2 при ГЛЛ у дітей виявилися дані, за якими IL-2 є біфункціональним модулятором і може стимулювати функціональну активність не тільки кілерних, але й інших клітин з рецепторами до відповідного ліганда [1, 4, 5]. Вважають, що саме тому на етапі формування супресії вплив на клітинисупресори IL-2 призводить до прогресування хвороби. Ці дані можуть бути прямим доказом можливої участі IL-2 в імуностимуляції неопластичного процесу.

Таким чином, за нашими даними значне зростання концентрації IL-2 у сироватці крові хворих на ГЛЛ дітей спостерігалося у дебюті хвороби. Аналіз співвідношення між рівнем сироваткового ІL-2 та бластними клітинами периферичної крові засвідчує їх прямий кореляційний зв’язок середньої сили. Однак на етапі цитостатичного лікування, повного його завершення, а також у різні терміни довготривалої ремісії виявлено зменшення продукції даного медіатора, яка суттє- во відрізнялася від такої у дітей контрольної групи (p

< 0,05). Слід відзначити, що незалежно від терміну ви-

никнення рецидиву ГЛЛ у дітей виявлено зростання рівня ІL-2 у сироватці крові. Аналіз співвідношення між даним цитокіном і бластними клітинами при рецидиві хвороби засвідчує про зменшення кореляційного зв’язку, порівняно із таким, який спостерігався у дебюті хвороби у перший гострий період. На нашу думку, така динаміка змін зумовлена недостатньою кількістю бластних клітин у периферичній крові на момент констатування рецидиву ГЛЛ. Заслуговує на увагу, що ІL-2 не може самостійно реалізувати свою біологічну функцію при ГЛЛ у дітей. Аналіз співвідношення між сироватковим ІL-2 та окремими показниками клітинного і гуморального імунітету свідчить про зміну сили і напрямку зв’язку, враховуючи етап програмної терапії та термін довготривалої ремісії. Отже, отримані результати демонструють неоднозначну роль ІL-2 при ГЛЛ у дітей. Динаміка його змін вказує на те, що цей медіатор може бути прогностичним імунологічним маркером щодо перебігу ГЛЛ.

ВИСНОВКИ

У дітей, хворих на ГЛЛ, спостерігається збільшення концентрації IL-2 у сироватці крові. Особливо це помітно як у дебюті ГЛЛ, так і при виникненні рецидиву. Свої біологічні функції IL-2 реалізовує при безпосередній взаємодії з клітинною та гуморальною ланками імунітету, особливо із CD16/56+-, CD8+28–, та СD19+-лімфоцитами периферичної крові, а також сироватковими IgA, IgM та IgG. Зміна концентрації IL-2 у сироватці крові в динаміці хвороби дає підстави вважати даний медіатор прогностичним імунологічним маркером перебігу ГЛЛ у дітей.

ЛІТЕРАТУРА

1. Бережная НМ, Чехун ВФ. Система интерлейкинов и рак. Киев: ДИА, 2000. 224 с.

2. Bellanti JA, Kadlec JV, Escobar-Gutierrer A. Cytokines and the immune response. Pediatr Clin North Am 1999; (73): 163–7.

3. Borish L, Rosenwasser LJ. Update on citokines. J Allergy Clin Immunolog 2001; 97 (6): 1719–34.

4. Houssiau FA, Schandene L, Stevens M, et al. A cascade of cytokines is responsible for IL-9 expression in human T-cell. Involement of IL-2, IL-4 and IL-10. J Immunol 1999; 154 (5): 2624–30.

5. Ihle JN. Cytokine receptor signaling. Nature 1999; (7): 591–4.

6. Junquan T, Deleuran B, Gesser B, et al. Regulation of human T lymphocytes chemotaxis in vitro by TY-cell-derived cytokines IL-2, INF-γ, IL-4, IL-10 and IL-13. J Immunol 1999; 154 (5): 3742.

7. Kishimoto T, Taga T, Akira S. Cytokine signal transduction. Cell 2004; (6): 253–62.

8. Stevens DL. Cytokines: an updateed compendium. Current Opin Inf Dis 2005; (8): 175–80.

9. Zhang XL, Komada Y, Zhou YW, et al. Inhibition of interleukin-2 receptor (CD25) expression induced on T-cells from children with acute lymphoblastic leukemia. Cancer Immunol Immunother 1997; (4): 41–9.