Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника

Одной из основных причин смертности в промышленно развитых странах являются злокачественные новообразования. При этом, согласно данным Международного агентства по изучению рака, к 2020 г. прогнозируется повышение заболеваемости злокачественными опухолями до 15 млн и возрастание смертности до 9 млн человек в год [16]. Анализ статистических данных о злокачественных новообразованиях в России за период с 1999 по 2004 г. показывает, что заболеваемость злокачественными опухолями яичника за этот период имела прирост 14,9% и переместилась по уровню смертности с 6–7-го места в 1999 г. на 5-е в 2004 г., заняв 3-е место по величине прироста [11].

К основным свойствам всех злокачественных опухолей относят повышенную способность к пролиферации, утрату способности к полной дифференцировке и апоптотической гибели, а также инвазивный рост и метастазирование [5]. Благодаря им неоплазма имеет преимущество перед нормальными клетками во время роста и выживания.

Если в здоровой ткани существует баланс между процессами пролиферации и гибели клетки, то в ткани опухоли имеет место автономная и неограниченная пролиферация клеток. При этом в трансформированных клетках возникает устойчивость к индукции апоптоза [9]. В результате генетических мутаций снижается способность трансформированных клеток активировать программу апоптоза, что, с одной стороны, способствует прогрессированию опухолевого процесса, а с другой — может стать причиной множественной лекарственной устойчивости [1]. В связи с этим в последнее время уделяется большое внимание изучению молекулярных маркеров, характеризующих апоптоз и пролиферацию при различных злокачественных новообразованиях [7, 8].

Ведущую роль в развитии апоптоза и регуляции клеточной пролиферации играет природный (Wt)

тип гена-онкосупрессора p53 и кодируемый им ядерный белок р53 [3]. Последний модулирует экспрессию генов, которые отвечают за репарацию ДНК, деление клеток и апоптоз [1, 19]. В значительной части злокачественных опухолей выявляют мутации в хромосоме 17 в области локализации генасупрессора р53 [4, 21].

Bcl-2 является одним из основных компонентов системы защиты клетки против факторов, вызывающих апоптоз. Известно, что Bcl-2 ингибирует р53-зависимый и независимый апоптозные метаболические пути. При этом способствует образованию в митохондриях ионных каналов, стабилизируя этим митохондриальную цитохром-оксидазу С и связывает белки, участвующие в апоптозе. Цитохром-оксидаза С способна инициировать активацию каскада каспаз и, как следствие, деградацию ДНК и апоптоз.

С состоянием основных регуляторных систем программированной клеточной гибели связаны неопластические, репаративные и пролиферативные процессы в тканях. Показано, что нарушение механизмов пролиферации — одна из главных особенностей опухолевых клеток. А уровень пролиферативной активности определяет агрессивность и злокачественность опухолевого процесса [7].

Целью работы была оценка маркеров апоптоза и пролиферации опухолевой ткани при раке яичника (РЯ) в динамике прогрессирования опухоли.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужили гистологические препараты операционно-биопсийного материала первичной опухоли 83 первичных больных РЯ. По стадиям (ст.) заболевания (FIGO, 1976) больных распределили следующим образом: Iст. была у 4 (4,8%), II — у 6 (7,2%), III — у 40 (48,2%), IV — у

33 (39,8%). В зависимости от гистологической структуры опухоли в исследуемой группе 29 (35%) были отне-

сеныксерозному гистотипу, 23 (28%)— муцинозному, 16 (19%) — эндометриоидному, 13 (16%) — мезонеф-

роидному и 2 (2%) — неклассифицируемому.

Образцы опухолевой ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин. Гистологические препараты окрашивали обычными способамии проводили иммуногистохимические исследования.

При оценке пролиферативной активности использовали моноклональные антитела (МкАТ,

«Novocastra» и «Dako») к антигену ядер пролиферирующих клеток PCNA и к негистонному белку Ki-67, который определяется в ядрах клеток во время поздней G-фазы, S, G2 и M, но не в G0 —фазе клеточного цикла. Пролиферативную активность опухоли оценивали как процент Ki-67+-клеток от общего числа опухолевых клеток. Для оценки индекса проли-

ферации по PCNA высчитывали процент клеток, в ядрах которых выявляли экспрессию PCNA.

В иммуногистохимической оценке экспрессии mtp53 использовали мышиные МкАТ к р53, клон DO-7, IgG2b (M7001 «DakoCytomation») в разведении 1 : 100 при времени экспозиции 60 мин. Критерием положительной реакции считалась окраска 10% и более ядер опухолевых клеток. Bcl-2 выявляли

с помощью МкАТ к Bcl-2, клон Bcl-2/100/D5, IgGi (NCL-bcl-2 «Novocastra») в разведении 1 : 80 при инкубации 60 мин. Положительной считалась реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10% опухолевых клеток.

Полученные в ходе исследования результаты подвергнуты обработке с использованием непараметрических статистических методов. Значимость различий между группами определяли с использованием H-критерия Крускала — Уоллиса. Силу связи между признаками устанавливали ранговой корреляцией Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований было установлено, что на I клинической стадии заболевания количество Ki-67+-клеток невелико и составляет порядка 5,4 ± 0,63%(таблица). Расположение этих клеток не имеет выраженных закономерностей. Ki-67+-клетки располагаются разрозненно и, как правило, единичны. Однако имеется устойчивая тенденция к увеличению таких клеток в мелких железах. В группе РЯ II ст. указанные тенденции сохранялись. При прогрессировании неоплазмы (РЯ III ст.) выявляли тенденцию к усилению экспрессии Ki-67 (см. таблицу).

Таблица Средние значения индексов пролиферации у больных РЯ

на различных клинических стадиях заболевания (М ± m)

*Различие с данными на предыдущей клинической стадии статистически значимо (p = 0,0001).

Исследование РЯ IV ст. показало сохранение высокой пролиферативной активности: экспрессия Ki-67 в ряде случаев достигала 58% (рис. 1).

Рис. 1. Высокое содержание Ki-67+-клеток. Ув. х 150

Данные литературы относительно уровня экспрессии Ki-67 при РЯ достаточно разноречивы [18]. При этом установлено, что индекс Ki-67 неодинаков при разных гистологических формах РЯ и коррелирует со степенью дифференцировки опухоли при серозном РЯ [8].

С.В. Петров и соавторы [10] указывают, что при иммуногистохимической оценке пролиферативной активности неоплазмы при РЯ реакция на антиген ядер пролиферирующих клеток PCNA выявляется в виде диффузной и/или зернистой окраски ядер раковых клеток. В тканевых образцах PCNA наиболее часто отмечают в папиллярных новообразованиях, в мелких железах и участках инвазивного роста (рис. 2).

Рис. 2. Высокое содержание PCNA+-клеток в железах эндометриоидного РЯ. Ув. х 100

На I и II клинических стадиях заболевания уровень PCNA демонстрирует значительные колебания от 18 до 32%.

В отдельных случаях вообще не выявляли PCNA- положительных клеток. При прогрессировании новообразования (III–IV ст.) количество PCNA- положительных клеток значительно возрастает (см. таблицу), достигая в ряде случаев 100% (рис. 3).

Рис. 3. Экспрессия PCNA в 100% клеток РЯ IV ст. Ув. х 100

Таким образом установлено, что пролиферативная активность клеток овариального рака неодинакова на различных клинических стадиях заболевания. В группе больных РЯ на III клинической стадии показатели экспрессии PCNA и Ki-67 достоверно и существенно (р = 0,0001) превышали таковые в группе на I–II клинических стадиях и продолжали возрастать на IV клинической стадии заболевания. Это позволяет утверждать, что при прогрессировании РЯ появляются клоны клеток с высокой пролиферативной активностью.

р53 — полифункциональный белок, основная функция которого реализуется в ядре. Ген р53 постоянно транскрибируется и транслируется, однако сам белок быстро деградирует в протеосомах и в клетках большинства тканей находится на пороге детекции [13]. Мутантный тип mt p53 — долгоживущий протеин, его период полураспада — до 24 ч. Считается, что иммуногистохимическая положительная реакция полностью зависит главным образом от наличия мутантного типа mt 53 [11]. Мутантная форма белка р53 уже не выполняет своих функций и деление клеток ставится неуправляемым процессом [12]. Полагают, что мутации р53 могут как инициировать канцерогенез (синдром Ли — Фраумени) или определять его начальные этапы, так и возникать в процессе роста опухоли, обеспечивая ее новые агрессивные свойства [3]. Мутантный р53 определяется при многих злокачественных образованиях, таких как опухоли легкого (70%), молочной железы (20%), желудка (60%) [21]. В злокачественных эпителиальных опухолях яичника экспрессия р53 может достигать 80% [17, 22].

Результаты проведенного нами исследования по оценке экспрессии антигена р53 атипическими эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ представлены на рис. 4. Установлено, что при прогрессировании РЯ увеличивается количество атипических эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих р53. При этом достоверность различий между группами статистически значимая (р= 0,0001) и корреляция со стадией положительная

высокая (r = 0,6092). Полученные результаты позволяют предполагать, что в процессе прогрессирования первичной опухоли либо нарастают мутации гена р53, либо имеет место отбор р53+ опухолевых клеток, обеспечивающих более агрессивное течение. Наряду с р53 наиболее последовательно изучается в апоптозе роль гена bcl-2. В свою очередь белок р53 снижает активность Bcl-2, что, возможно, запускает апоптоз в клетках с поврежденной ДНК. Установлено, что Bcl-2 подавляет Fas-зависимый апоптоз [2]. Изучены механизмы, благодаря которым Bcl-2 реализует свою антиапоптотическую функцию [15]. Данные относительно уровня экспрессии белка Bcl-2 и возможностей использования его в качестве прогностического фактора у больных с солидными опухолями достаточно противоречивы [1].

Рис. 4. Содержание атипических эпителиальных клеток яичника, экспрессирующих р53, при прогрессировании РЯ

Результаты проведенного нами исследования по оценке экспрессии антигена Bcl-2 атипическими эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ представлены на рис. 5.

Рис. 5. Содержание атипических эпителиальных клеток яичника, экспрессирующих Bcl-2, при прогрессировании РЯ

Показано, что при прогрессировании РЯ количество клеток опухоли, экспрессирующих Bcl-2, увеличивается. Достоверность различий между стадиями статистически значимая (р = 0,0001), и корреляция со стадией положительная высокая (r = 0,6255).

Для опухолевых клеток характерны генетические изменения, ведущие к ослаблению различных путей апоптоза, в частности ингибирование проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С и AIF вследствие изменения экспрессии белков семейств Bcl-2. Для клеток РЯ показано подавление аутофагии — другого способа программированной гибели клеток, связанного с лизосомальной деградацией белков [5]. Считается, что гиперэкспрессия

Bcl-2 приводит к неопластическому процессу. В то же время показано, что низкий уровень этого белка коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы [23] и его гиперэкспрессия является благоприятным прогностическим признаком при РЯ [6]. Существует также мнение, что экспрессия Bcl-2 не всегда блокирует апоптоз [14]. Вероятно, в разных типах опухолей проявляется разная роль Bcl-2.

Таким образом, на основании выше изложенного можно предполагать, что в процессе прогрессирования РЯ в первичном опухолевом узле, возможно, имеет место отбор р53+ неопластических клеток, характеризующихся высокой пролиферативной активностью и гиперэкспрессией онкопротеина Bcl-2.

Поскольку изученные маркеры пролиферации и апоптоза имеют непосредственное отношение к радиои химиочувствительности неоплазмы [2], полученные результаты могут быть использованы при выборе оптимальных схем лечения и оценке прогноза РЯ на различных клинических стадиях заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абраменко ИВ, Фильченков АА. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии. Вопр онкол 2003; 49: 21–30.
2. Акимов АА, Иванов СД, Хансон КП. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований. Вопр онкол 2003; 49: 261–9.
3. Копнин БП. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия 2000; 65: 5–33.
4. Копнин БП. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. В кн: Канцерогенез. / Под ред ДГ Заридзе / Москва: Медицина, 2004: 125–56.
5. Копнин БП. Современные представления о механизмах злокачественного роста. В: Материалы Х Российского онкологического конгресса. Москва, 2006: 99–102.
6. Мильчаков ДЕ. Клинико-морфологическая характеристика серозного рака яичников у женщин (на примере Кировской обл). [Автореф дис … канд мед наук]. СанктПетербург, 2007. 19 с.
7. Пожарисский КМ, Леенман ЕН. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний Арх патол 2000; (5): 3–11.
8. Полушкина ИН. Биомолекулярные маркеры как факторы прогноза при серозном раке яичников III–IV стадии. [Автореф дис … канд мед наук]. Москва, 2002. 39 с.
9. Райхлин НТ, Райхлин АН. Регуляция и проявление апоптоза в физиологических условиях и в опухолях. Вопр онкол 2002; 48: 159–71.
10. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред СВ Петрова, НТ Райхлиной / Казань: Титул, 2004. 451 с.
11. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 г. Под ред МИ Давыдова, ЕМ Аксель. Вестник РОНЦ им ИН Блохина, 2006; 17: 97.
12. Cloven NG, Kyshtoobayeva A, Burger RA, et al. In vitro chemoresistance and biomarker profiles are unique for histologic subtypes of epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 2004; 92: 160–6.
13. Ichihara A, Tanaka K. Roles of proteasomes in cell growth. Mol Biol Rep 1995; 21: 49–52.
14. Kuwashima Y, Kobayashi Y, Kawarai A, et al. Expression of bcl-2 and apoptotic DNA fragmentation in human endometrial adenocarcinoma cells. Anticancer Res 1996; 16: 3221–4.
15. Mitselou A, Ioachim E, Kitsou E, et al. Immunohistochemical study of apoptosis — related bcl-2 protein and its correlation with proliferation indices (Ki-67, PCNA), tumor suppression genes (p53, pRb), the oncogene c-erb-B2, sex steroid hormone receptors and other clinico-pathological features, in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium. In vivo 2003; 17: 469–78.
16. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 1999; 49: 33–64.
17. Pieretti M, Hopenhayn-Rich C, Khattar NH, et al. Heterogeneity of ovarian cancer: relationships among histological group, stage of disease, tumor markers, patient characteristics, and survival. Cancer Invest 2002; 20: 11–23.
18. Reitmaier M, Rudlowski C, Biesterfeld S, et al. Comparative studies on the biological significance of the marker for proliferation Ki-67-Antigen and PSNA in primary ovarian carcinoma. Zentralbl Gynacol 2000; 122: 361–7.
19. Schmitt СA, Love SW. Apoptosis and therapy. G Path 1999; 187: 127–37.
20. Soussi T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Res 2000; 60: 1777–88.
21. Soussi T, Dehouche K, Béroud C. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis. Hum Mutat 2000; 15: 105–13.
22. Terada K, Mattson D, Goo D, Shimizu D. DNA aneuploidy is associated with increased mortality for stage I endometrial cancer. Gynecol Oncol 2004; 95: 483–7.
23. Zhang GJ, Kimijima I, Abe R, et al. Apoptotic index correlates to bcl-2 and p53 protein expression, histological grade and prognosis in invasive breast cancers. Anticancer Res 1998;18: 1989–98.