Гіпоксія (Гокс) розглядається як ключовий фактор у патогенезі пухлини та як один з головних чинників злоякісної прогресії. Існують експериментальні та клінічні докази того, що гіпоксична фракція солідних пухлин стимулює їх ріст та метастатичний потенціал і зменшує чутливість до іонізуючої радіації та певних хіміотерапевтичних препаратів [1, 2]. Продемонстровано низкою досліджень, що низька величина парціального тиску кисню (рО2), тобто

високий рівень Гокс та підвищення рівня експресії

Гокс-асоційованих білків у пухлині вказують на несприятливий перебіг захворювання [3, 4]. На підставі клінічних спостережень висловлені пропозиції щодо використання Гокс-регульованих білків у якості прогностичних маркерів [5–7].

Гокс оцінюється на підставі прямого вимірювання величини рО2 у пухлині за допомогою полярографічних мікроелектродів, що служить своєрідним золотим стандартом визначення статусу оксигенації біологічних тканин [8, 9]. У той же час цей метод має певні обмеження, головне з яких пов’язане з недоступністю ба-

гатьох пухлин для введення мікроелектродів. Існують імуногістохімічні (ІГХ) методи оцінки Гокс за допомогою визначення експресії низки Гокс-регульованих білків, зокрема HIF-1 (гіпоксія-індукований фактор 1-), CA-9 (карбоангідраза-9), Glut-1 (транспортер глюкози-1), які позначаються як ендогенні маркери Гокс [9], Використовуються також екзогенні маркери, до яких належить пімонідазол, який після введення в організм накопичується у тканинах з низьким рівнем оксигенації та метаболізує у субстанцію, яка фіксується ІГХ-методом [11].

Використання ендогенних маркерів набуло широкого розповсюдження, але вони не завжди регулюються виключно Гокс і тому не завжди чітко корелюють з рівнем останньої у тканині і не здатні розрізнити гостру Гокс від хронічної [10]. Застосування пімонідазолу, який фіксує наявність важливої з точки зору реакції пухлини на терапію так званої радіобіологічної гіпоксичної фракції пухлинних клітин, обмежується необхідністю його внутрішньовенного введення до оперативного втручання або взяття біопсії [10, 11].

В останні десятиріччя поширення набула ядерно-магнітно-резонансна (ЯМР) спектроскопія як зручний та інформативний метод дослідження in vitro та in vivo. Останній метод в поєднанні з ЯМР-зображенням широко застосовується в біології та медицині і дає можливість неінвазивно визначати місце знаходження та об’єм пухлини, здійснювати моніторинг динаміки цілої низки важливих метаболітів і при їх зміні оцінювати ефективність запровадженої терапії та попереджати рецидиви [12– 14]. Більшість робіт з ЯМР-спектроскопії in vivo стосується досліджень хворих на рак молочної залози, передміхурової залози [15], товстої кишки [16], з пухлинами мозку [15], нейробластомою [17], саркомою м’яких тканин [18], пухлинами голови та шиї [19].

При дослідженнях in vitro метод 31Р ЯМР-спектроскопії дозволяє проаналізувати рівень у клітині всіх фосфоровмісних сполук, включаючи фракцію водорозчинних фосфоліпідів, при цьому 1Н ЯМР-спектри дають можливість оцінити рівні таких важливих сполук, як лактат, холін та холінпохідні сполуки, які є та-

кож маркерами пухлинної прогресії [20–22]. За допомогою метаболічних показників є можливість оці- нити біоенергетичний статус пухлинної тканини, а оскільки метаболічний обмін у тканині адаптується до рівня її оксигенації, то зміни цих показників свідчать про рівень Гокс [23, 24]. Об’єктом досліджень при 31Р ЯМР-спектроскопії in vitro можуть слугувати перхлорні екстракти тканин або клітин, самі клітини, кров, а також екстракти клітин або тканин, отриманих за допомогою органічних розчинників.

Добре відомо, що існує міцний взаємозв’язок між

біоенергетикою та оксигенацією в пухлинній тканині. Вивчаючи біоенергетику та метаболічний статус тканини фібросаркоми (FsaII) мишей за допомогою 31Р ЯМР-спектроскопії, було встановлено, що співвідношення Pi/PCr, Pi/βNTP корелюють з медіаною рО2

[24] і є загальновизнаними для оцінки енергетичного

статусу і рівня Гокс у тканині, збільшення яких свідчить про погіршення стану її оксигенації [25]. Проте оскільки у клінічній практиці, як правило, фахівці мають справу з розвиненими пухлинами, у яких рівні PCr і/або βNTP часто знижуються до не вимі- рюваних величин, що є взагалі характерним для пухлинної тканини, для оцінки біоенергетичного статусу тканини і рівня її Гокс вельми цінним є такий метаболічний показник, як PME/Pi, який є дуже чутливим до рівня тканинної оксигенації. Більше того, визначена достовірна кореляція (р < 0,001) між середнім

значенням рО2 і відповідним значенням цього співвідношення, що вперше було встановлено в експерименті з фібросаркомою FSaII у мишей [24].

Метою даної роботи була спроба оцінити стан оксигенації тканини раку шлунка (РШ) за допомогою 31Р ЯМР-спектроскопії з використанням співвідношення PME/Pi у якості показника рівня Гокс пухлини та виявити взаємозв’язок між величиною цього співвідношенням та перебігом захворювання.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Було обстежено 118 хворих із діагнозом первинний РШ, яких піддавали тільки хірургічному втручанню. Пухлинну та слизову тканину шлунка, яку видаляли на певній відстані від краю пухлини, отримували під час операції. Оцінка рівня Гокс проводилася за допомогою ЯМР-спектроскопії в перхлорних екстрактах тканини. Клінічні характеристики хворих на РШ наведені у табл. 1.

Крім того, у якості своєрідного контролю достовірності визначення рівня Гокс пухлини за допомогою співвідношення PME/Pi була використана тканина раку шийки матки (РШМ) (34 хворих), тому що ця пухлина характеризується високим рівнем Гокс. Всі дослідження проведені у період 2004– 2007 рр. Матеріал був наданий відділеннями абдомі- нальної онкології та гінекології Інституту онкології АМН України (нині ДУ «Національний інститут раку») та Київською міською онкологічною лікарнею МОЗ України. Всі хворі були поінформовані про обстеження та дали свою згоду.

ЯМР-спектроскопія. 31Р ЯМР-спектри перхлорних екстрактів (ПХЕ) реєстрували на спектрометрі Bruker 400 MHz (Widebore Ultrashield, AV-400 electronics, ФРН), використовуючи 5 мм кювети. 31Р ЯМР-спектри вимірювали при 161,976 MHz, зі спектральною шириною в 64724,9 Hz, 90° шириною імпульсу, лінійним розширенням 10 Hz. Кількість сканів у середньому по спектрах складала 1024. Тринатрієва сіль метилендифосфонієвої кислоти (Sigma) слугувала внутрішнім стандартом. Усі 31Р хімічні зрушення у спектрах були співвіднесені до сигналу фосфокреатину (РСr), який був позначений як 0,0 ppm.

Таблиця 1 Характеристика хворих, включених у дослідження

*За винятком характеристики за віком.

Резонансні сигнали фосфорвмісних сполук на 31Р ЯMР-спектрах перхлорних екстрактів пухлинної тканини мають наступний порядок розміщення: фосфомоноефіри (PME): фосфоетаноламін (PE) і фосфохолін (PC), нуклеозид монофосфат (АМФ), та фосфорильовані інтермедіати гліколізу; фосфор неорганічний (Pi); фосфодиефіри (PDE): гліцерофосоетаноламін (GPE) і гліцерофосфохолін (GPC); фосфокреатин (PCr); γ-NТP і нуклеозид дифосфат β-фосфат; α-NТP і нуклеозид дифосфат, α-фосфат разом з іншими різними сполуками, такими як NADPH/NADP+ і NADH/NAD+; дифосфодиефіри, вірогідно уридін дифосфоглюкоза; та βNTP (АТФ). β-фосфатний резонанс нуклеозид трифосфата (NТP) використовується для оцінки рівня АТФ [24]. Області спектральних сигналів на спектрах вимірювалися інтегральним способом, які обчислював

прилад. 31Р ЯМР-спектри були отримані в Центрі загального користування НАН України на базі Інституту металофізики НАН України.

ПХЕ тканини. Для отримання ПХЕ тканину видаляли і негайно занурювали у рідкий азот. Потім її розтирали в рідкому азоті до порошковидного стану, давали трохи відтаяти. Подалі проводили екстракцію за допомогою холодної 1,2 н HClO4. Холодну деіоні- зовану воду додавали в певному обсязі та інкубували

нювати та порівнювати гіпоксичний стан пухлин усіх обстежених хворих. Тому для отримання повної інформації щодо рівня Гокс у пухлинах усіх хворих, використали метаболічне співвідношення PME/Pi, яке може бути визначеним у кожному випадку, що дає змогу порівнювати між собою всі отримані зразки пухлинних тканин щодо рівня їх Гокс.

Pi

на льоду при постійному помішуванні. Центрифугували для видалення клітинного дебрісу. Потім рН ПХЕ доводили до 7,6–8,0 за допомогою 5 н розчину КОН, центрифугували для видалення КСІО4 преципітату. Дивалентні іони видаляли за допомогою Chelex 10 мг/5 мл (Sigma, США). Зразки фільтрували, ліофілізували та зберігали при –20 °С. Перед реє-

страцією ЯМР-спектрів, зразки розчиняли в 1,0 мл

D2O, центрифугували і переносили в ЯМР-пробірки для аналізу.

Статистична обробка. Проводили відповідну ста-

PME

PDE

à

βNTP

тистичну обробку отриманих результатів: кореляційний аналіз з використанням коефіцієнтів Pearson

(r) та Spearman (rho). Прогностичне значення показників оцінювали за допомогою пропорційної моделі Сох з використанням коефіцієнта ризику смертності (hazard ratio) та теста χ2. Виживаність хворих визначалася за методом Каplan — Maіer, розбіжності між кривими виживаності аналізували за допомогою теста log-

PME

5 0 –5 –10 [ppm]

βNTP

á

Pi

rank. Статистична значимість прийнята при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз спектрів ПХЕ тканини PШ встановив,

PDE

βNTP

що вміст PCr та βNTP був значно знижений в тканині РШ (у 3,2 та 2,5 раза відповідно) щодо слизової оболонки, яка оточує пухлину. Типові 31Р ЯМР-спектри представлені на рис. 1. Таке зниження рівнів PCr і βNTP відбувалося з одночасним зростанням сигналу Pi, що втілилось у зміні відповідних співвідношень: Pi/PCr було збільшеним у пухлині у 4,5 раза порівняно з нормальною слизовою оболонкою, Pi/βNTP — у 3 рази. Підвищення цих співвідношень свідчить про погіршення стану оксигенації і, таким чином, про значне підвищення рівня Гокс у пухлині. При проведенні кореляційного аналізу було встановлено, що між співвідношенням Pi/βNTP та PME/βNTP у тканині РШ існує дуже тісний взаємозв’язок (p = 0,0001). Щодо співвідношення Pi/PCr, то для проведення кореляційного аналізу не було достатньо даних, тому що на 31Р ЯМР-спектрах тканини РШ багатьох хворих сигнали PCr були невимірно малими або зовсім не реєструвалися (у 78% випадків). Дещо кращий стан спостерігався для сигналу βNTP, який можливо було спостерігати на спектрах у 52% випадків. Таке становище є характерною особливістю розвинених пухлини, особливо пухлин людини, але не дає можливості використовувати загальноприйняті 31Р ЯМР-співвідношення, такі як Pi/PCr, Pi/βNTP (або PCr/Pi, βNTP/Pi), PME/βNTP і, таким чином, оці-

5 0 –5 –10 [ppm]

Рис. 1. 31Р ЯМР-спектри ПХЕ тканини РШ (а) та оточуючої її слизової оболонки (б) (подані копії спектрів з оригінальних записів, хворий Б.Л.C.)

Результати попередніх експериментальних дослі- джень [26], їх аналіз та співставлення з іншими методами та показниками дозволили використовувати співвідношення PME/Pi для оцінки рівня Гокс у тканині РШ. Для підтвердження правомірності використання співвідношення PME/Pі у роботі з клі- нічним матеріалом був проведений також кореляційний аналіз між цим співвідношенням та загальновизнаним метаболічним співвідношенням для оцінки енергетичного статусу та рівня Гокс у тканині, а саме з Pi/βNTP, отриманим зі спектрів ПХЕ тканини РШ, на яких відзначався сигнал βNTP. Отримана достовірна зворотня кореляція між цими співвідношеннями: Pi/βNTP та PME/Pi (r = –0,38; p = 0,046).

Визначено, що медіана співвідношення PME/Pi

для тканини РШ дорівнює 1,40, тоді як для слизової оболонки, розміщеної на певній відстані від пухлини (за межами обов’язкового оперативного видалення) — 2,4. Це співвідноситься з даними літератури, які вказують, що рівень оксигенації в злоякісних пухлинах людини значно вищий за такий, визначений для експериментальних пухлин, де вона коливається близько 1,0 (також за даними, отриманими

за допомогою 31Р ЯМР-спектроскопії ПХЕ тканин). У табл. 2 наведені значення медіани співвідношення PME/Pi згідно з клініко-патологічними характеристиками РШ, з яких видно, що коливання медіани не є значними. Якщо порівнювати медіани різних метаболічних 31Р ЯМР-співвідношень у пухлинній тканині з такими в оточуючій її «нормальній» слизовій оболонці шлунка, які наведені в табл. 3, видно, що в пухлинній тканині вони значно відрізня-

няльний аналіз спектрів пухлинних тканин хворих на РШ і хворих на РШМ. Остання тканина, як добре відомо, є пухлиною, що знаходиться в стані глибокої Гокс, яка виявлена за допомогою мікроелектродної техніки [27]. На відміну від 31Р ЯМР-спектрів РШ, на спектрах тканини РШМ характерним є більш сильний сигнал Pi, не такий виразний сигнал PME і майже відсутні сигнали РDЕs (рис. 2).

PME

ються (від 1,4 до 2,4 раза).

Таблиця 2 Значення співвідношення PME/Pi у тканині РШ згідно з клініко-

патологічними характеристиками

Pi

5 Pi PME

PDE

PDE

à

βNTP

0 –5 –10 [ppm]

á

βNTP

Таблиця 3 Метаболічні 31Р-співвідношення у тканині РШ та слизовій

5 0 –5 –10 [ppm]

Рис. 2. 31Р ЯМР-спектри ПХЕ тканини РШ (а) та тканини РШМ (б), (подані копії спектрів з оригінальних записів, хворі Б.В.В. та П.Н.В. відповідно)

При аналізі 31Р ЯМР-спектрів обох тканин було

оболонці шлунка (СОШ), яка оточує пухлину

Таким чином, на підставі визначення співвідношення PME/Pi можна зробити висновок, що межа розподілу між умовно «добре» та «бідно» оксигенованими пухлинами дорівнює 1,4 (0,8–5,32) для всіх обстежених хворих, що відповідає медіані вищевказаного співвідношення. У хворих, у яких співвідношення PME/Pi < 1,4, пухлини «гіпоксичні», тоді як у хворих, у яких PME/Pi > 1,4, — пухлини задовільно оксигеновані. Встановлено, що «гіпоксичні» пухлини шлунка складають 44%, а «оксигеновані» — 56%.

Для того, щоб пересвідчитися, що співвідношення PME/Pi дійсно відображає рівень оксигенації у пухлині РШ і, що тканина РШ є дійсно досить добре оксигенованою, був проведений порів-

виявлено, що медіана співвідношення PME/Pi для тканини РШМ досить низька, навіть менша за одиницю, а індивідуальні значення за даними розкиду не перевищують 1,0 порівняно з тканиною РШ, що підтверджує дані про високий рівень Гокс у тканині РШМ (табл. 5). Крім того, з метою порівняння рівня оксигенації в цих обох пухлинах був застосований ІГХ-метод з використанням ендогенного маркеру Гокс — СА-9. У табл. 4 наведено розподіл хворих на пухлини обох локалізацій відносно рівня експресії СА-9 у пухлинній тканині, з якої видно, що хворих на РШ, у яких відзначався високий рівнь експресїї значно менше, і це також вказує на підтвердження положення про існування досить задовільної оксигенації в тканині РШ. Для обох тканин були також встановлені медіани кількості клітин (у %), які експресують СА-9, та їх розкид. Виявилося, що медіана кількості клітин, які експресують СА-9, у тканині РШ значно менша, ніж у РШМ, і розкид їх у бік невеликих величин значно більший (див. табл. 5).

Таблиця 4 Порівняльний аналіз хворих на РШ та РШМ за кількістю

пухлинних клітин, у яких ІГХ-методом виявлено експресію СА-9

ка Гокс у первинній пухлині (PME/Pi < 1,0) має місце негативний перебіг захворювання і загроза смерті зростає більше, ніж вдвічі.

*Пухлини, клітини яких експресують СА-9, розподілені на 3 групи згідно з класифікацією Mayer і співавторів [28].

Таблиця 5 Співвідношення PME/Pi та кількість клітин у тканині РШ та РШМ,

у яких ІГХ-методом виявляється експресія СА-9

За даними 31Р ЯМР-спектроскопії індивідуаль-

Таблиця 6

Співвідношення PME/Pi як прогностичний фактор для хворих на РШ з категорією N0 (тільки хірургічне лікування)

Аналізуючи виживаність хворих на РШ відносно співвідношення PME/Pi (рис. 3), тобто залежно від рівня Гокс у первинній пухлині, було виявлено, що тривалість життя хворих, в первинній пухлині значення яких PME/Pi < 1,4 (глибока Гокс), коротша, ніж в групі хворих, у пухлинах яких PME/Pi > 1,4.

ні значення співвідношення PME/Pi для тканини РШМ не перевищують 1,0. Тому з метою порівняння кількості клітин (у %), які експресують СА-9 у цих новоутвореннях, була відібрана група хворих на РШ, в первинній пухлині яких спостерігався теж досить високий рівень Гокс (PME/Pi < 1,0). Виявилося, що в тканині РШ за таких умов Гокс більше ніж 60,7% клітин експресують СА-9 (р < 0,05), тоді як в інших групах значних розбіжностей виявлено

100

Виживаність, %

75

50

25

<1,4

>1,4

ð = 0,029

не було, а саме, коли 1,0 < PME/Pi < 1,4 — 39,4% і PME/Pi > 1,4 — 48,1%. Таким чином, можна констатувати, що співвідношення PME/Pi відображає стан оксигенації тканини, а ендогенний маркер Гокс СА-9 виявляється показовим тільки тоді, коли в тканині спостерігається наявність глибокої Гокс. При аналізі отриманих даних було виявлено 3 умовні групи хворих на РШ за співвідношенням PME/Pi щодо рівня Гокс у пухлині: PME/Pi < 1,0, 1,0 < PME/Pi < 2,0 та PME/Pi > 2,0, які складали 29, 58 та 13% хворих. При співставленні рівнів Гокс у первинних пухлинах хворих на РШ, оцінених за допомогою співвідношення PME/Pi, з перебігом захворювання виявилося, що такий взаємозв’язок існує: хворі, у яких значення PME/Pi < 1,0, тобто з умовно «глибокою» внутрішньопухлинною Гокс, мали особливо несприятливий прогноз перебігу захворювання, а саме в цій умовній групі вмирає кожен другий хворий, тоді як у групі з показниками 1,0 < PME/Pi < 2,0 вмирає кожен з трьох, при співвідношенні PME/Pi > 2,0 — 2 хворих з 5.

Слід зазначити, що кореляції рівня Гокс пухлини у хворих на РШ з категоріями Т і М (система TNM) та стадіями процесу не спостерігалося. Це співпадає з відомим положенням, що Гокс пухлини не залежить від розміру новоутворення, гістологічної форми, ступеня диференціювання, обсягу некротичних ділянок, клінічної стадії, і тому її рівень може розглядатися як незалежний фактор прогнозу перебігу захворювання [29]. У той же час був встановлений важливий взаємозв’язок між високим рівнем Гокс у первинній пухлині та наявністю метастазів у лімфатичних вузлах хворих на РШ (табл. 6). У хворих, які не мають метастазів у лімфатичних вузлах (група хворих з категорією N0), але спостерігається глибо-

0

0 50 100 150 200

Тижні

Рис. 3. Криві загальної виживаності хворих на РШ залежно від співвідношення PME/Pi пухлинної тканини (оцінка виживаності за методом Каплана — Майєра)

Слід зазначити, що у 88% хворих на РШ, які померли, значення PME/Pi в первинній пухлині було

< 1,4, тобто спостерігалася більш глибока Гокс. Необхідно при цьому відзначити, що з 118 хворих, які були прооперовані, 62 хворих (53%) отримували післяопераційну хіміотерапію. Ці дані вказують на те, що наявність глибокої Гокс у пухлинній тканині вказує на несприятливий перебіг захворювання незалежно від того, чи була після операції застосована у цих хворих хіміотерапія, чи ні.

ВИСНОВКИ

1. РШ людини є помірно-гіпоксичною пухлиною. За використаними показниками стану оксигенації можна виділити 3 групи пухлин: глибока Гокс — 29% новоутворень, помірна — 58% та слабка — 13%.

2. Рівень Гокс пухлини не корелює з традиційними клінічними характеристиками пацієнтів та пухлини.

3. У групі хворих з категорією N0 і наявністю глибокої Гокс в первинній пухлині (PME/Pi < 1,0) має місце негативний перебіг захворювання і зростає ризик смерті.

4. Глибока Гокс РШ є несприятливим прогностичним фактором незалежно від методу післяопераційного лікування.

5. Визначення величини співвідношення PME/Pi у пухлинній тканині за допомогою 31Р ЯМРспектроскопії є інформативним методом оцінки рівня Гокс пухлини та може бути застосовано у клінічній практиці.

ЛІТЕРАТУРА

1. Brown JM, Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res 1998; 58: 1408–16.

2. Hoeckel M, Vaupel P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biological, and molecular aspects. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 266–76.

3. Vaupel P, Thews O, Kelleher DK, et al. Current status of knowledge and critical issues in tumor oxygenation. Results from 25 years research in tumor pathophysiology. Adv Exp Med Biol 1998; 454: 591–602.

4. Airley RE, Loncaster J, Davidson S, et al. Glucose transporter Glut-1 expression correlates with tumor hypoxia and predicts metastasis-free survival in advanced carcinoma of the cervix. Clin Cancer Res 2001; 7: 928–34.

5. Loncaster JA, Harris AL, Davidson SE, et al. Carbonic anhydrase (CA IX) expression, a potential new intrinsic marker of hypoxia: correlations with tumor oxygen measurements and prognosis in locally advanced carcinoma of the cervix. Cancer Res 2001; 61: 6394–9.

6. Le Q-T, Kong C, Lavori PW, et al. Expression and prognostic significance of a panel of tissue hypoxia markers in head-and- neck squamous cell carcinomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2007; 69: 167–75.

7. Airley RE, Loncasster J, Raleigh JA, et al. GLUT-1 and CAIX as intrinsic markers of hypoxia in carcinoma of the cervix: relationship to pimonidazole binding. Int J Cancer 2003; 104: 85–91.

8. Stone HB, Brown JM, Phillips TL, et al. Oxygen in human tumors: correlations between methods of measurement and response to therapy. Radiat Res 1993; 136: 422–34.

9. Hoeckel M, Schlenger K, Knoop C, et al. Oxygenation of carcinomas of the uterine cervix: evaluation by computerized O2 tension measurements. Cancer Res 1991; 51: 6098–102.

10. Evans SM, Koch CJ. Prognostic significance of tumor

    oxygenation in humans. Cancer Lett 2003; 195: 1–16.

11. Bussink J, Kaanders JHAM, van der Kogel AJ. Tumor hypoxia at the microregional level: clinical relevance and predictive value of exogenous and endogenous hypoxic cell markers. Radiother Oncol; 67: 3–15.

12. Cheng LL, Burns MA, Taylor JL, et al. Metabolic characterization of human prostate cancer with tissue magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res 2005; 65: 3030–4.

13. Knopp MV, Tengg-Kobligk von H, Choyke PL. Functional magnetic resonance imaging in oncology for diagnosis and therapy monitoring. Mol Cancer Therapeutics 2003; 2: 419–26.

14. Evelhoch J, Garwood M, Vigneron D, et al. Expanding the use of magnetic resonance in the assessment of tumor response to therapy: workshop report. Cancer Res 2005; 65: 7041–5.

15. Kwock L, Smith JK, Castillo M, et al. Clinical role of proton magnetic resonance spectroscopy in oncology: brain, breast and

phosphorus magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res 2003;

63: 9042–7.

1. Baek H-M, Chen J-H, Nalcioglu O, et al. Proton MR spectroscopy for monitoring early treatment response of breast cancer to neo-adjuvant chemotherapy. Ann Oncol 2008; 19: 1022–4.

2. Rofstad EK, DeMuth P, Fenton BM, et al. 31P nuclear magnetic spectroscopy studies of tumor energy metabolism and its relationship to intracapillary oxyhemoglobin saturation status and tumor hypoxia. Cancer Res 1988; 48: 5440–6.

3. Vaupel P, Okunieff P, Kallinowski F, et al. Correlation between 31P-NMR spectroscopy and tissue O2 tension measurements in a murine fibrocarcoma. Radiat Res 1989; 120: 477–93.

4. Li S-J, Wehrle JP, Rajan SS, et al. Response of radiation- induced fibrosarcoma-1 in mice to cyclophosphamide monitored by in vivo 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res 1988; 48: 4736–42.

5. Bubnovskaya L, Mikhailenko V, Kovelskaya A, Osinsky S. Bioenergetic status and hypoxia in Lewis lung carcinoma assessed by 31P NMR spectroscopy: correlation with tumor progression. Experimental Oncol 2007; 29: 207–11.

6. Hoeckel M, Schlenger K, Aral B, et al. Assotiation between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix. Cancer Res 1996; 56: 4509–15.

7. Mayer A, Hockel M, Vaupel P. Carbonic anhydrase IX expression and tumor oxygenation status do not correlate at the microregional level in locally advanced cancers of the cervix. Clin Cancer Res 2005; 11: 7220–5.

8. Wouters BG, Weppler SA, Koritzinsky M, et al. Hypoxia as a target for combined modality treatments. Eur J Cancer 2002; 38: 240–57.

prostate cancer. Lancet Oncol 2006; 10: 859–68.

1. Kasimos JN, Merchant TE, Gierke LW, et al.

   31P magnetic

   1,0 < PME/Pi < 2,0 and PME/Pi > 2,0 that has not only

   prognostic significance (p < 0,05), but may be as additional

   resonance spectroscopy of human colon cancer. Cancer Res 1990;

   50: 527–32.

2. Lindskog M, Spenger C, Klason T, et al. Proton magnetic resonance spectroscopy in neuroblastoma: current status, prospects

   criterion for choice of treatment methods. It was confirmed that 31P metabolic ratio PME/Pi may be used as reliable

   parameter for assessment of tissue hypoxia.

   and limitations. Cancer Lett 2005; 228: 247–55.

3. Dewhirst MW, Poulson JM, Yu D, et al. Relation between pO2, 31P magnetic resonance spectroscopy parameters and treatment outcome in patients with high-grade soft tissue sarcomas treated with thermoradiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 61: 480–91.

4. Maldonado X, Alonso J, Giralt J, et al. 31Phosphorus magnetic resonance spectroscopy in the assessment of head and neck tumors. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998; 40: 309–12.

5. Leach MO. Introduction to in vivo MRS of cancer: new perspectives and open problems. Anticancer Res 1996; 16: 1503–14.

6. Zakian KL, Shukla-Dave A, Meyers P, et al. Identification of prognostic markers in bone sarcomas using proton-decoupled