ПОЗИТИВНА СЕЛЕКЦІЯ CD34+-КЛІТИН ТА АУТОЛОГІЧНА ТРАНСПЛАНТАЦІЯ ОЧИЩЕНИХ ПЕРИФЕРИЧНИХ ГЕМОПОЕТИЧНИХ ПОПЕРЕДНИКІВ ПІСЛЯ ВИСОКОДОЗОВОЇ ХІМІОТЕРАПІЇ У ХВОРИХ НА ЗЛОЯКІСНІ ПУХЛИНИ

ВСТУП

Високодозова хіміотерапія (ХТ) з наступним відновленням гемопоезу хворого шляхом реінфузії власних стовбурових клітин крові стала важливим етапом у покращанні результатів лікування онкологічних та онкогематологічних хворих [1]. Розвиток рецидиву є однією з проблем, що ускладнює широке впровадження аутологічної трансплантації гемопоетичних попередників. Введення аутологічного трансплантата може супроводжуватися реінфузією пухлинних клітин, що контамінують клітинну суміш. Результати досліджень з маркування генів довели реальність подібного сценарію [10]. Технології очистки, які селективно видаляють пухлинні клітини із трансплантата, можуть покращити виживання, вільне від рецидиву, для хворих, щодо яких планується виконання трансплантаційної процедури. Довгий час одним із перспективних напрямків оптимізації аутологічної трансплантації вважалися технології негативної деплеції [11]. Для мінімізації кількості залишкових клітин пухлини в трансплантаті, окрім хіміопрепаратів, використовували різноманітні антипухлинні антитіла. Обмеження у використанні такої процедури зумовлені гетерогенністю експресії антигенів-мішеней клітин пухлини у різних пацієнтів [7]. Останнім часом запропоновано інший метод, сутність якого полягає в позитивній селекції CD34+-клітин з аферезного продукту або аспірату кісткового мозку [3]. За позитивної селекції CD34+-клітин від неопластичних клітин з фенотипом CD34–, гетерогенність пухлинної популяції за іншими ознаками не має істотного значення і не є фактором, що обмежує ефективність очистки транс-

плантата. Таким чином, реінфузія фракції CD34+– клітин дозволяє знизити ризик повернення в організм хворого патологічних елементів і є достатньою для поновлення гемопоезу, зруйнованого попередньою високодозовою ХТ.

Дотепер клінічно апробовано 3 напрямки для здійснення CD34-позитивної селекції клітинної суміші в клінічній практиці. Один із них — метод CellPro дозволяє досягти середньої концентрації CD34+-клітин у 42% за надзвичайно широкого інтервалу коливань в окремих процедурах очистки (4,3–76,6%) [4]. Імовірно, саме внаслідок недостатньої чистоти кінцевої фракції селекціонованих клі- тин медіана логарифму деплеції залишкової пухлини була відносно низькою та складала 1,41 з коливаннями від 0,69 до 2,13. Інший метод базується на використанні системи Isolex 300 і дозволяє досягти значно більшої чистоти фракції CD34+-клітин. Leung і співавтори повідомили про медіану концентрації CD34+-клітин у 92% за очистки у такий спосіб клітинного продукту для аутологічної трансплантації стовбурових клітин периферичної крові для лі- кування хворих на нейробластому з групи високого ризику [8]. Автори досягли й достатньо високої відтворюваності результатів обробки суміші з коливанням концентрації необхідних клітин в 49–99% та суттєвого зменшення контамінації залишковими елементами пухлини, що у середньому змінилася на 3 логарифми. Найновіша технологія позитивної селекції CD34+-клітин, що дозволяє досягти надзвичайно високого ступеня очистки трансплантата для клінічного застосування, полягає у здійсненні магнетично-активованого клітинного сортуван-

ня. При проведенні CD34-позитивної селекції для здійснення аутологічної трансплантації стовбурових гемопоетичних клітин (СГК) метод дозволяє досягти чистоти фракції CD34+-клітин до 95,7% зі збереженням загальної кількості CD34+-клітин у 69,5% від вихідного [9].

У цій роботі проаналізовано ефективність перших в Україні процедур селекції попередників із периферичної крові з використанням системи магнетично-активованого сортування клітин (CliniMACS) та результати трансплантації очищеної CD34-позитивної фракції периферичних гемопоетичних клітин після високодозової ХТ хворому на нейробластому з групи високого ризику.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Трансплантація очищеної CD34-позитивної фракції периферичних гемопоетичних клітин була виконана на базі Київського центру трансплантації кісткового мозку (КЦТКМ) після високодозової ХТ хворій дитині віком 4 роки з діагнозом нейробластома позачеревної порожнини з ураженням кісткового мозку, стадія IV, T2N0M1. Процедура здійснена у відповідності до принципів Хельсинської декларації з прав людини 1975 р., після отримання інформованої згоди батьків. До високодозової ХТ хворий отримував лікування за протоколом «Neuroblastomastudie NB 97», результат якого був незадовільним (після третього курсу стандартної ХТ зберігалось ураження кісткового мозку, після четвертого — визначено залишкову пухлину в позачеревній порожнині). Хворому була виконана туморадреналектомія зліва, 2 додаткові курси ХТ. Схему подальшого лікування

з використанням мієлоаблативних доз цитостатиків та аутологічної трансплантації очищеної фракції CD34+-клітин наведено на рисунку.

Після останнього курсу стандартної ХТ проведено мобілізацію СГК за допомогою Г-КСФ («Нейпоген», «Хоффман-ля Рош», Швейцарія) у дозі 10 мкг/кг/день та 3 щоденні процедури лейкоцитоферезу під час фази гемопоетичного відновлення за допомогою сепаратора Кобе Спектра («Cobe», США). Продукт 1-го лейкоцитоферезу залишали у резерві, 2-го та 3-го — піддавали передтрансплантаційному процесінгу та використовували в якості трансплантата.

Позитивна селекція CD34+-клітин здійснювалась у відділі гематології на трансплантології Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) одразу після отримання продукту лейкоцитоферезу. Сутність методу полягає у розділенні суміші клітин на фракції у магнітному полі за допомогою використання імуномагнітної мітки, специфічної для клі- тин, які становлять інтерес для терапії. Для позитивної селекції клітин, що несуть на своїй поверхні антиген CD34, до клітинної суміші додається маркер — анти-CD34 моноклональні антитіла (МкАт), що поєднані з магнітною часткою. МкАт зв’язуються з антигеном, надаючи таким чином CD34+-клітині магнітного маркеру. Для цього лейкоцитоферезний продукт переводили в мішки об’ємом 600 мл («Baxter», США), доводили до стандартного об’єму 95 мл шляхом центрифугування та видалення надлишку плазми, додавали 7,5 мл анти-CD34 МкАт (клон АС 101) з магнітною міткою («Myltinyi Biotec», Німеччина) і інкубували при кімнатній температу-

Рисунок. Дизайн дослідження з оцінки ефективності використання селекції CD34+-клітин для передтрансплантаційного процесінгу аутотрансплантату для лікування хворого на нейробластому

рі протягом 30 хв за умов повільного перемішування. Продукт двічі відмивали в 0,5% розчині альбуміну людини та 1 ммоль ЕДТА в PBS для видалення надлишку антитіл. Далі використовували інструмент CliniMACS згідно з інструкцією виробника («Myltinyi Biotec»). При здійсненні процедури селекції клітинна суміш проходить скрізь колонку з феромагнітним матриксом. Циклічна робота клі- тинного сортеру дозволяє періодично генерувати в колонці потужне магнітне поле. Мічені клітини затримуються в колонці, немічені проходять крізь неї без затримки, що сприяє сепарації клітинної сумі- ші. Демагнітизація колонки вивільняє клітини, які становлять інтерес, окремою фракцією. Для цього одноразовий сет («Myltinyi Biotec») з’єднували з гемотрансфузійним фільтром («Pall Incorporated»), заправляли в інструмент CliniMACS і промивали PBS для видалення повітря із системи. Мішок з продуктом, міченим антитілами, приєднували до системи. Селекція здійснювалася в автоматичному режимі під контролем мікропроцесора. Через 30 хв фракцію CD34+-клітин об’ємом 45 мл було вивільнено в окремий мішок.

Визначення кількості клітин в продукті лейкоци-

тоферезу, продукті селекції, оцінка їх життєздатності та кріоконсервування за вмісту DMSO 10% в рідкому азоті при температурі –196 °С виконувалося згідно з загальновизнаною методикою, відповідно до стандартної процедури КЦТКМ.

Експресію антигену CD34 визначали з використанням прямої імунофлуоресцентної техніки на проточному цитофлуориметрі FACScan («Becton Dickinson», США) з аргоновим лазером зі збудженням хвилі довжиною 488 нм за протоколом Milan- Mullhouse [6] за допомогою програмного забезпечення LYSYS II. Цитофлуориметричні дослідження проводили у відділі імунології НЦРМ.

Мієлоаблативна ХТвключаламельфалан180мг/м2, карбоплатін 1500 мг/м2 та етопозид 40 мг/кг в/в. Для реінфузії ізольовану фракцію CD34+-клітин швидко розморожували та без відмивання вводили хворому через центральний венозний катетер через 48 год після закінчення мієлоаблативної ХТ.

Крім клінічного протоколу, для визначення можливостей обробки трансплантата з альтернативних джерел та опрацювання методики здійснено позитивну селекцію CD34+-клітин із зразка кордової крові, що зберігався протягом 20 міс у рідкому азоті. Після швидкого розморожування та дворазового відмивання клітинної суміші від DMSO у PBS/ EDTA буфері («Myltinyi Biotec») проведено процедуру сортування із застосуванням інструменту CliniMACS, визначення кількості клітин у суміші, оцінку їх життєздатності та вмісту CD34+-клітин за методикою описаною вище.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проаналізовано результати 3 магнетичних селекцій клітинних сумішей. У двох випадках здійснював-

ся передтрансплантаційний процесінг СГК, отриманих із периферичної крові методом аферезу, для клінічного застосування. Отриманий продукт очищеної фракції CD34+-клітин був застосований для аутологічної трансплантації після високодозової ХТ хворому на нейробластому за протоколом наведеним на рисунку. Після проведення стандартної ХТ та мобілізації СГК периферичної крові хворому віком 4 роки, вагою 19 кг, під час виходу з нейтропенії здійснено аферез із заготівлею 2,0 × 106 CD34+-клітин/кг маси тіла. Ця доза не підлягала подальшій обробці, була заморожена та слугувала резервом на випадок невдачі селекції. За недостатньої кількості клітин, заготовлених у процесі передтрансплантаційного процесінгу, або інших технічних проблем при маніпуляціях зі стовбуровими клітинами необроблений клітинний продукт надав би можливість здійснити трансплантацію і виконати загальний план лікування. Наявність клітин резерву уможливила подальше здійснення дослі- дження з очищення трансплантата. Протягом 2 послідовних днів здійснювалася позитивна селекція CD34+-клітин із щоденного аферезного продукту із застосуванням інструменту CliniMACS та антиCD34 МкАт з магнітною міткою. Передтрансплантаційний процесінг виконували одразу після отримання аферезного продукту перед заморожуванням клітинної суміші. Формалізовані показники результатів аферезу та ефективності очищення клітинної суміші наведені в таблиці.

Таблиця Характеристики аферезного продукту та показники ефективності очищення клітинної суміші перед аутологічною трансплантацією

Таким чином, загалом, після позитивної селекції було отримано 2,02 × 106 CD34+-клітин/кг маси тіла реципієнта, що було достатньо для здійснення аутологічної трансплантації з використанням виключно клітинного продукту процесінгу. Цей продукт було заморожено, хворий отримав мієлоаблативну ХТ та реінфузію власних селекціонованих CD34+-клітин. Негативних ефектів процедури селекції не відзначено. Екстрагематологічна токсичність терапії за шкалою ВООЗ характеризувалася мукозітом III–IV ступеня та ентеропатією І ступеня. Приживлення трансплантата відбулося в звичайні строки із досягненням кількості нейтрофілів

у периферичній крові, що перевищувала 0,5 × 109/л, на день +11, тромбоцитів > 20 × 109/л на день +16. Після відновлення кістково-мозкового кровотворення хворий знаходиться в стані повної ремісії протягом 2 років. Складно спекулювати щодо того, чи призвело в даному випадку використання в якості трансплантата очищеної фракції СГК з фенотипом CD34+ до покращання довгострокових результатів лікування. Але експеримент підтвердив надійність методу позитивної селекції, його відтворюваність. Слід очікувати, що модифікована процедура аутотрансплантації надасть перевагу у безрецидивному виживанні, оскільки завдяки збільшенню частки CD34+-клітин у трансплантаті більше ніж у 500 разів було суттєво зменшено вірогідність контамінації продукту клітинами пухлини.

У роботі повідомляється про перший в Украї- ні досвід клінічного використання магнетичної клітинної селекції для здійснення трансплантації. У доступній літературі існують публікації про подібні дослідження з включенням суттєво більшої кількості хворих. Група Chou і співавтори досягли високої медіани чистоти продукту після обробки із застосуванням інструменту CliniMACS та анти-CD34 МкАт з магнітною міткою (81,5% CD34+-клітин) [2], про ще більший середній відсоток (97,6%) CD34+-клітин у кінцевій клітинній суміші для здійснення аутотрансплантації при нейробластомі після аналогічної обробки повідомили Handgretinger та співавтори [5].

Можливим поясненням дещо нижчого покажчика чистоти кінцевого продукту в нашому дослі- дженні може бути особливість застосованих антитіл для оцінки кількості CD34+-клітин у клітинній суміші методом проточної цитофлуорометрії. У нашій роботі був застосований клон діагностичних антиCD34 МкАт анти-HPCA II класу, що збігаються за епітопом з’єднання з магнетично-міченими антиCD34-антитілами, які були використані для позитивної селекції. Таким чином, за умов слабкої експресії антигену на клітинах, які відповідали нашим інтересам, після обробки анти-CD34 МкАт з магнітною міткою суттєва кількість епітопів рецептора CD34 була зайнятою, що могло привести до неефективного забарвлення цих клітин діагностичними анти-CD34 МкАт. На вірогідність такого сценарію вказує той факт, що загальна кількість клі- тин у кінцевому продукті близько збігалася з кількістю CD34+-клітин у вихідній клітинній суміші — аферезному продукті (див. таблицю). Тому для вдосконалення процедури було вирішено в подальшому використовувати інший клон діагностичних антиCD34 антитіл, зокрема анти-HPCA III, що реагують з III класом епітопів антигену CD34.

Для перевірки цієї гіпотези та визначення можливостей обробки трансплантата з альтернативних джерел було здійснено позитивну селекцію CD34+– клітин, що містяться в пуповинній крові. Особливістю цього експерименту було те, що обробляли зра-

зок, який було розморожено після тривалого збері- гання у рідкому азоті. Об’єм зразка складав 160 мл, вміст лейкоцитів — 1,4 × 109/л, життєздатність клі- тин — 95%. З урахуванням накопиченого досвіду, досягнуто значно кращої чистоти кінцевого продукту. Вміст CD34+-клітин у клітинній суміші після процесінгу з 0,02% вихідного рівня сягнув 69,12%.

Ми вважаємо досягнутий показник чистоти субоптимальним, принаймні, він знаходиться в межах коливань результатів окремих процедур CD34- позитивної селекції в дослідженнях інших авторів. Так, розкид чистоти очищеної суміші за показником вмісту CD34+-клітин у згаданої раніше групи Chou [2] становив 62,5–98,1%. Причинами, що могли дещо знизити ефективність очистки та зумовити 69% результат, можуть бути, по-перше, зміни експресії антигенів на поверхневих мембранах клітин, що тривало зберігалися при ультранизьких температурах і, по-друге, знижена внаслідок зберігання стійкість клітин до механічних навантажень під час селекції, зокрема додаткових центрифугувань та перемішувань суміші. Слід також зазначити, що в аферезному продукті присутні CD34+-клітини зі значною варіабельністю експресії антигену, що включають як стовбурові клітини, так і гемопоетичні попередники зі зниженою експресією CD34. Після селекції у продукті були представлені тільки клі- тини з високим рівнем експресії антигену, що ві- дображує не тільки особливості протоколу Milan- Mullhouse, але, імовірно, й поріг чутливості власне процедури селекції магнетично-мічених клітин за допомогою інструменту CliniMACS. Про технічну бездоганність проведеної процедури процесінгу свідчить практична відсутність CD34+-клітин у негативній фракції — решті клітин, що залишилася після селекції клітин інтересу.

ВИСНОВКИ

1. Результати аналізу свідчать про ефективність методу магнетичної селекції СГК, відтворюваність та безпечність процедури трансплантації гемопоетичних клітин-попередників, очищених за допомогою інструменту CliniMACS та анти-CD34 МкАт з магнітною міткою.

2. Використання методу магнетичної селекції СГК слід вважати перспективним напрямком покращання результатів лікування онкологічних хворих.

ЛІТЕРАТУРА

1. Бебешко ВГ, Мінченко ЖМ, Цвєткова НМ та ін. Проблеми трансплантації кісткового мозку в Україні. Трансплантологія 2001; 2 (1): 16–22.

2. Chou T, Sano M, Ogura M, et al. Isolation and transplantation of highly purified autologous peripheral CD34+ progenitor cells: purging efficacy, hematopoietic reconstitution following high dose chemotherapy in patients with breast cancer: results of a feasibility study in Japan. Breast Cancer 2005; 12: 178–88.

3. Civin CI, Trischmann T, Kadan NS, et al. Highly purified CD34 positive cells reconstitute hematopoiesis. J Clin Oncol 1996; 14: 2224–33.

4. Handgretinger R, Greil J, Schurmann U, et al. Positive selection and transplantation of peripheral CD34+ progenitor cells: feasibility and purging efficacy in pediatric patients with neuroblastoma. Hematother 1997; 6: 235–42.

5. Handgretinger R, Lang P, Ihm K, et al. Isolation and transplantation of highly purified autologous peripheral CD34+ progenitor cells: purging efficacy, hematopoietic reconstitution and long-term outcome in children with high-risk neuroblastoma. Bone Marrow Transplantation 2002; 29: 731–6.

6. Johnsen HE, Knudsen LM. Nordic flow cytometry standarts for CD34+ cell enumeration in blood products: Report from the second Nordic workshop. J Hematother 1999; 5: 237–45.

7. Kremens B, Combaret V, Favrot MC, et al. Evaluation of a modified immunomagnetic procedure for the purging of neuroblastoma cells from bone marrow. Evaluation eines modifizierten immunomagnetischen Verfahrens zur Entfernung von Neuroblastomzellen aus Knochenmark. Monatsschr Kinderheilkd 1990; 138: 331–6.

8. Leung W, Chen AR, Klann RC, et al. Frequent detection of tumor cells in hematopoietic grafts in neuroblastoma and Ewing’s sarcoma. Bone Marrow Transplantation 1998; 22: 971–9.

9. Miltenyi S. CD34+ selection: the basic component for graft engineering. Oncologist 1997; 2: 410–3.

10. Rill DR, Santana VM, Roberts WM, et al. Direct demonstration that autologous bone marrow transplantation for solid tumors can return a multiplicity of tumorigenic cells. Blood 1994; 84: 380–3.

11. Seeger RC, Vo DD, Ugelstad J, Reynolds CP. Removal of neuroblastoma cells from bone marrow with monoclonal antibodies and magnetic immunobeads. Progr Clin Biol Res 1986; 211: 285–93.