ЛИМФАНГИОГЕНЕЗ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕЙ

ВВЕДЕНИЕ

Первые сведения о существовании лимфатиче­ ских сосудов появились еще в XVII ст. В 1627 г. была опубликована книга известного итальянского хи­ рурга Гаспаро Азелли, в которой среди других ана­ томических данных были впервые описаны лим­ фатические («молочные») сосуды брыжейки тон­ кой кишки у собаки. Долгое время лимфатическую систему считали пассивным переносчиком жиров и других веществ, источником клеток, обеспечи­ вающих иммунитет, а также дренажной системой, способствующей возвращению избытка тканевой жидкости в кровь.

Согласно современным представлениям лимф­

ангиогенез является процессом образования новых лимфатических сосудов, который происходит в нор­ мальных и патологически измененных тканях и ор­ ганах под воздействием паракринных регуляторов. Лимфангиогенез активируется во время эмбриональ­ ного и раннего постнатального периода развития. Во взрослом организме временная инициация это­ го процесса наблюдается при воспалении, регенера­ ции тканей и заживлении ран. В отличие от эмбрио­ генеза, когда первые лимфатические сосуды образу­ ются из кардиальной вены, во взрослом организме лимфангиогенез осуществляется за счет формирова­ ния отростков уже имеющихся лимфатических сосу­ дов. При этом реализация лимфангиогенеза не зави­ сит от образования новых кровеносных сосудов. От­ крытие лимфангиогенных факторов и расшифровка механизмов их действия позволили c новых пози­ ций взглянуть на патогенез ряда воспалительных за­ болеваний (включая астму), лимфедемы, лимфан­ гиоматоза, диабета, ожирения и других. Примеча­ тельно, что даже название капитальной монографии («The Lymphatic Continuum Revisited»), которая уви­ дела свет в мае 2008 г. [1], свидетельствует о пересмот­ ре интереса к проблемам лимфологии.

В последнее время начали активно раскрывать­

ся сложные механизмы, регулирующие образова­ ние и рост лимфатических сосудов. В значительной мере этому способствовало развитие методов, по­

зволяющих идентифицировать и выделять эндоте­ лиальные клетки лимфатических сосудов (ЭКЛС). Новейшие успехи молекулярной лимфологии (от­ крытие лимфангиогенных цитокинов, рецепторов ЭКЛС, факторов транскрипции, генов и белковых маркеров лимфангиогенеза) свидетельствуют о по­ добии процессов образования новых лимфатиче­ ских и кровеносных сосудов. Как оказалось, регуля­ торами лимфангиогенеза и ангиогенеза могут высту­ пать одни и те же молекулы, например фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или матриксная металло­ протеиназа­2. Более того, недавно было показано, что антиангиогенный препарат рецентин (AZD2171) также ингибирует лимфангиогенез [2].

Феномен диссеминации опухолевых клеток (ОК) по лимфатическим сосудам известен давно, но мно­ гие аспекты, касающиеся механизмов попадания ОК внутрь сосудов, миграции с лимфотоком и про­ лиферации в лимфатическом узле, до недавнего вре­ мени оставались неизвестными. Процесс лимфан­ гиогенеза имеет решающее значение для инициа­ ции лимфогенного метастазирования. Многие из недавно открытых лимфангиогенных факторов (как прямого, так и опосредованного действия) способ­ ны обеспечивать проникновение ОК в интра­ и/или перитуморальные лимфатические капилляры (ЛК) и стимулировать перемещение ОК по лимфатиче­ ской системе, блокируя при этом их гибель. Вместе с тем накапливается все больше данных о том, что продукция отдельных лимфангиогенных факторов или высокая плотность ЛК могут служить критери­ ями, прогнозирующими появление метастазов.

Цель данной лекции — дать читателю представ­ ление об общих принципах формирования опухоль­ ассоциированных ЛК, о ключевых молекулярных и клеточных компонентах лимфангиогенеза. Будут также рассмотрены особенности лимфогенного ме­ тастазирования солидных опухолей. За рамками ана­ лиза остались вопросы разработки лекарственных препаратов, способных блокировать лимфангио­ генез и развитие лимфогенных метастазов, которые освещены в ряде недавних обзорных работ [3, 4].

МОЛЕкУЛы И кЛЕТкИ, УчАСТВУющИЕ В ЛИМФАНГИОГЕНЕЗЕ

Начало изучению механизмов лимфангиогене­ за было положено установлением факта, что специ­ фическим рецептором для VEGF C­типа является белок VEGFR­3, который у взрослого человека экс­ прессируется преимущественно в ЭКЛС [5]. Позже был выявлен еще один лиганд VEGFR­3 — VEGF D­типа, а также показана способность VEGF­C и VEGF­D специфически связываться с рецептор­ ным белком VEGFR­2 [6]. Опыты по блокированию лиганд­индуцированной активации VEGFR­3 в пе­ риод эмбриогенеза убедительно свидетельствуют о необходимости VEGFR­3 для образования новых лимфатических сосудов [7]. Долгое время главным медиатором образования новых ЛК считался рецеп­ тор VEGFR­3, а не VEGFR­2, который опосредует стимуляцию ангиогенеза. Однако теперь установ­ лено, что VEGFR­2 и VEGFR­3 принимают участие в регуляции как ангиогенеза, так и лимфангиогене­ за (рис. 1). Оба фактора VEGF­C и VEGF­D спо­ собны инициировать лимфангиогенез in vivo [8, 9]. Причем для реализации их лимфангиогенных эф­ фектов необходим двухэтапный процессинг про­ VEGF­C и про­VEGF­D с участием плазмина и про­ протеинконвертаз.

Рис. 1. Лиганд­рецепторные взаимодействия различных представителей семейства VEGF и их возможное участие в стимуляции ангиогенеза и лимфангиогенеза в опухолях. PlGF — плацентарный фактор роста

Помимо VEGFR­3 и VEGFR­2, VEGF­C спосо­ бен специфически взаимодействовать с нейропили­ ном­2 и α9β1­интегрином, которые также присут­ ствуют на поверхности ЭКЛС [10, 11]. Считается, что нейропилин­2 может поддерживать миграцию ЭКЛС, образуя комплексы с рецепторами VEGFR­3 и VEGFR­2. Антитела против нейропилина­2, ко­

торые препятствуют связыванию VEGF­C, подав­ ляют миграцию, но не пролиферацию ЭКЛС [12]. Следует отметить, что такое действие антител про­ тив нейропилина­2 лишь частично зависит от акти­ вации рецептора VEGF­C.

Роль интегринов, в частности гетеродимера α9β1, в регуляции лимфангиогенеза связывают с адге­ зией, миграцией и выживанием ЭКЛС. В отличие

от рецепторов факторов роста, интегрины лише­ ны собственной киназной активности, но способ­ ны активировать регуляторные сигналы, образуя комплексы фокальной адгезии с внутриклеточ­ ными киназами и адаптерными белками. Как ока­ залось, белки внеклеточного матрикса, такие как коллаген и фибронектин, способны через актива­

цию β1­интегрина существенно усиливать фосфо­ рилирование киназы VEGFR­3. Интересно, что все животные,«нокаутированные» (то есть лишен­ ные обеих аллелей гена) по α9­интегрину, погибают в первые 2 нед после рождения с признаками лимфе­ демы и хилоторакса [13]. Активация специфичного для ЭКЛС фактора транскрипции PROX1 приводит к повышению экспрессии α9β1­интегрина, VEGFR3 и подвижности ЭКЛС in vivo. Более того, данный интегрин способствует миграции клеток, индуци­ рованной VEGF­C и VEGF­D, путем прямого свя­ зывания с указанными цитокинами [11]. При этом антитела против α9β1­интегрина подавляют клеточ­ ную подвижность, индуцированную VEGF­C, что подтверждает значимость α9β1­интегрина для реа­ лизации процессов лимфангиогенеза. Аналогичную роль играют некоторые другие интегрины (α1β1, α2β1 и α4β1). Вместе с тем получены свидетельства разли­ чий в интегрин­опосредуемой регуляции лимфан­ гиогенеза и ангиогенеза. Установлено, например, что αV­интегрины, которые, как известно, являют­ ся значимыми регуляторами ангиогенеза, не уча­ ствуют в образовании новых ЛК [14].

В результате связывания специфических лиган­

дов с VEGFR­3 активируется киназа этого рецеп­ тора, что приводит к стимуляции пролиферации и миграции ЭКЛС, опосредованной MAP­киназой p42/p44 [15]. При опухолевом лимфангиогенезе от­ мечается выбрасывание филоподий ЭКЛС в на­ правлении ОК, которые продуцируют VEGF­C, и таким образом осуществляется миграция ЭКЛС. Кроме того, в результате активации рецептора VEGFR­3 происходит фосфорилирование и ак­ тивация киназ Akt и JNK1/2, которые блокиру­ ют апоптоз и поддерживают жизнеспособность ЭКЛС [15, 16]. Выживанию клеток, опосредован­ ному VEGFR­3, может также содействовать кина­ за MKK4 [16]. Следует отметить, что на поверхно­ сти ЭКЛС выявляются гетеродимерные комплексы VEGFR­3/VEGFR­2, что в значительной степени затрудняет идентификацию внутриклеточных ре­ гуляторных сигналов, инициируемых собственно VEGFR­3.

К индукторам лимфангиогенеза также относят­ ся VEGF­A, щелочной фактор роста фибробластов (bFGF), инсулиноподобные факторы роста (IGF­I и IGF­II), фактор роста гепатоцитов (HGF), тромбо­ цитарный фактор роста (PDGF) и некоторые другие (табл. 1). J.A. Nagy и соавторы [17] сообщили о фор­ мировании новых лимфатических сосудов у бести­ мусных животных после трансфекции геном VEGF­A в составе аденовирусного вектора. Следовательно,

VEGF­A является не только главным стимулятором ангиогенеза, но и лимфангиогенным фактором.

Таблица 1 Лимфангиогенные факторы и их специфические рецепторы

FGFR-3 — рецептор bFGF 3 типа; IGF-1R – рецептор IGF 1 типа; IL-7R — рецептор интерлейкина-7; GHR – рецептор гормона роста; CALCRl – рецептор, подобный рецептору кальцитонина; другие сокращения см. в тексте.

В то же время между указанными биологически­ ми эффектами этого цитокина существуют опреде­ ленные отличия. Например, для образования у бести­ мусных животных новых кровеносных сосудов необ­ ходимо постоянное присутствие VEGF­A, тогда как для последующего развития сформированных ЛК это не обязательно [17]. Кроме того, действие VEGF­A на ЛК может быть опосредованным (см. рис. 1), на­ пример, при участии макрофагов, которые проду­ цируют лимфангиогенные факторы, либо путем по­ вышения экспрессии VEGF­C. Вывод об участии VEGF­A в реализации механизмов лимфангиогене­ за подтверждают также данные, полученные на моде­ ли рака молочной железы (РМЖ) [18]. Оказалось, что нейтрализующие анти­VEGF­A­антитела способны существенно снижать плотность ЛК в опухоли и об­ разование метастазов в лимфатических узлах.

PDGF, как известно, высвобождается тромбо­ цитами и регулирует пролиферацию и миграцию клеток мезенхимального происхождения. Кроме того, этот фактор роста повышает проницаемость сосудов. Опыты с использованием «нокаутирован­ ных» мышей показали абсолютную необходимость PDGF для нормального эмбрионального развития. Приводятся [19] следующие доказательства прямо­ го участия PDGF в лимфангиогенезе: 1) антагонисты VEGF­C/D или VEGFR­3 не могут блокировать об­ разование новых лимфатических сосудов, индуциро­ ванное PDGF­BB; 2) PDGF способствует миграции ЭКЛС; 3) на поверхности ЭКЛС выявляются рецеп­ торы PDGF (α­ и β­PDGFR); 4) PDGF­BB стимули­ рует фосфорилирование киназ Akt, Src, Erk в ЭКЛС и 5) ЛК, формирующиеся при действии PDGF, так­ же экспрессируют PDGFR. Следует остановиться на двух важных моментах. Во­первых, понятно, что лим­ фангиогенные факторы не функционируют изолиро­ ванно, а способны модулировать действие друг друга, в том числе через трансактивацию соответствующих рецепторов. Во­вторых, существование такой слож­ ной системы регуляции образования новых ЛК ука­ зывает на то, что ингибирование активности только одного из группы лимфангиогенных факторов вряд ли будет достаточным для блокирования лимфангио­ генеза с терапевтической целью.

Поскольку ЛКфактическинесодержатперицитов или гладкомышечных клеток, главной мишенью для лимфангиогенных факторов служат ЭКЛС. В процес­ се лимфангиогенеза, помимо ЭКЛС, участвуют ОК и клетки стромы, которые продуцируют VEGF­C/D, а также ассоциированные с опухолью макрофаги [20]. Кстати, макрофаги, с одной стороны, могут стимули­ ровать пролиферацию ЭКЛС, а с другой — способны к трансдифференцировке и последующему встраива­ нию в стенку образующегося ЛК [21].

Обсуждая вопрос о клеточных механизмах фор­ мирования новых ЛК, следует отметить участие в этом процессе предшественников ЭКЛС, которые могут с периферической кровью поступать в опухо­ левые очаги из костного мозга. Впервые о существо­ вании таких клеток­предшественников сообщили

P. Salven и соавторы [22]. Они показали, что суб­ популяция СD34­положительных клеток содержит клетки, которые коэкспрессируют маркер стволо­ вых клеток CD133 и рецептор VEGFR­3. В присут­ ствии лимфангиогенных факторов происходит диф­ ференцировка предшественников ЭКЛС в зрелые VEGFR­3+CD133– ЭКЛС. Субпопуляцию СD14­ положительных моноцитов также можно рассмат­ ривать в качестве клеток­предшественников, по­ скольку после стимуляции in vitro на них появля­ ются маркеры ЭКЛС.

МЕТОДы ВыяВЛЕНИя ЛИМФАНГИОГЕННыХ ФАкТОРОВ И ЭкЛС

Не останавливаясь на инструментальных неин­ вазивных методах исследования лимфатических сосудов и лимфатических узлов1, рассмотрим ла­ бораторные методы, применяемые для выявления лимфангиогенных факторов и ЭКЛС. Для оценки по­ казателей лимфангиогенеза у онкологических боль­ ных чаще всего используется ряд методов, основан­ ных на взаимодействии антиген — антитело (имму­ ногистохимия, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и проточная цитометрия (ПЦ)), а так­ же метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Высокочувствительные варианты иммуногисто­ химического анализа позволяют с помощью моно­ клональных антител выявлять VEGF­C, VEGF­D, VEGFR­3, а также характерные для ЭКЛК антиге­ ны в срезах опухолевой ткани, в отпечатках и маз­ ках, полученных при тонкоигольной аспирацион­ ной биопсии. При этом удается не только иденти­ фицировать указанные молекулы, но и установить их тканевую и клеточную локализацию. Сегодня в мире используется много коммерческих препара­ тов антител против VEGF­C, VEGF­D или VEGFR­3 с разной чувствительностью и специфичностью, что не позволяет стандартизировать метод.

1Особенности методов лимфосцинтиграфии, магнитно-резонансного исследования, компьютерной томографии, ультразвукового сканирования, инфракрасной спектроскопии и лимфангиографии детально обсуждаются в уже цитируемой монографии [1] на стр. 13–36.

Биомаркер LYVE­1, позволяющий дифферен­ цировать лимфатические и кровеносные капилля­ ры, был открыт в 1999 г. [23]. Большая часть иссле­ дований, посвященных изучению лимфангиогенеза в опухолевой ткани, была проведена с применени­ ем анти­LYVE­1 антител. Однако снижение экспрес­ сии LYVE­1 в некоторых тканях при воспалительных реакциях, а также отсутствие этого маркера в отдель­ ных опухольассоциированных ЭКЛС показывает, что для более адекватной оценки лимфангиогенеза необ­ ходимоиспользовать LYVE­1 вкомбинациисдругими маркерами ЭКЛС [24]1. В последнее время выявлено более 30 белков, экспрессия которых является харак­ терной для клеток, формирующих эндотелий лимфа­ тическихиликровеносныхсосудов. Некоторыеизэтих маркерных молекул приведены в табл. 2.

Для оценки плотности ЛК чаще других (поми­ мо LYVE­1) используют такие биомаркеры, как по­ допланин2 и Prox­1 либо их комбинации с другими специфическими для ЭКЛС молекулами в зависи­ мости от типа исследуемой ткани. Их выявление мо­ жет иметь прогностическое значение для онкологи­ ческих больных (см. следующий раздел). В то же вре­ мя, использование биомаркеров лимфангиогенеза и ангиогенеза позволило получить из кожи челове­ ка культуры ЭКЛС и эндотелиальных клеток кро­ веносных сосудов (ЭККС). Поскольку ЭКЛС со­ храняют свои фенотипические признаки при дли­ тельном культивировании и их можно выращивать в виде трехмерных культур, стало возможным из­ учать интимные механизмы лимфангиогенеза без применения экспериментальных животных.

1В указанной работе приведено много других полезных рекомендаций по использованию иммуногистохимического анализа для оценки лимфангиогенеза у онкологических больных.

2Рекомендуется использовать антитела D2-40, которые выявляют резистентный к фиксации эпитоп подопланина с высокой специфичностью и чувствительностью (соответственно 98,8 и 97,3%) [25].

К существенным недостаткам метода иммуно­ гистохимии следует отнести субъективизм оцен­ ки конкретного врача­морфолога и использование различных критериев учета антиген­положительных клеток, что затрудняет сравнение результатов, по­ лученных разными исследователями.

Метод ELISA позволяет проводить точную коли­ чественную оценку содержания исследуемого бел­ ка в биологических пробах. Достаточно информа­ тивным показателем в оценке прогноза заболевания считается определение (как правило, дооперацион­ ное) уровня лимфангиогенных факторов в сыворот­ ке крови онкологических больных. Например, по­ казано, что повышенный уровень VEGF­C в крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого, па­ пиллярной карциномой щитовидной железы или ра­ ком пищевода коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах [26–28]. Имеется сообщение о выявлении подобной коррелятивной зависимости в отношении сывороточного VEGF­D у больных ра­ ком предстательной железы [29]. Более того, в слу­ чаях рака пищевода или желудка у больных с высо­ кой концентрацией VEGF­C в крови прогноз более неблагоприятен, а риск рецидивирования повышен [30, 31]. Интересно, что средний уровень VEGF­C в сыворотке крови больных с меланомой кожи [32], у которых метастазы были выявлены вблизи пер­ вичного очага, оказался намного меньше такового у больных с отдаленными метастазами.

Применительно к лимфангиогенезу метод ПЦ позволяет выявлять популяции клеток, экспресси­ рующих антигены ЭКЛК либо антигены, которые специфичны для предшественников таких клеток. Получение суспензии одиночных клеток из солид­ ных опухолей связано с определенными (хотя и пре­ одолимыми) трудностями. При этом не представля­ ется возможным отдифференцировать интра­ и пе­ ритуморальные ЛК. Наиболее перспективным, на

Таблица 2

Биомаркеры ЭКЛС и ЭККС

*Экспрессия в опухоль-ассоциированных, но не нормальных ЭКЛС.

**Экспрессия в предшественниках ЭККС.

наш взгляд, является выявление с помощью ПЦ раз­ личных предшественников ЭКЛК, циркулирующих в периферической крови, хотя с данной целью метод пока используется редко. Однако практическое зна­ чение ПЦ может возрасти, если будет установлена корреляция между уровнем циркулирующих пред­ шественников ЭКЛК и клинико­патологическими характеристиками опухоли либо выживаемостью онкологических больных.

ПЦР предназначена для выявления в образце тка­ ни заданной мРНК, а модификация этого метода, на­ зываемая «ПЦР в реальном времени», позволяет опре­ делять содержание мРНК количественно. Следует отметить высокую специфичность выявления продук­ тов амплификации за счет использования специаль­ но подобранных праймеров, а также быстроту мето­ да. С помощью метода ПЦР в реальном времени была выявлена корреляция между экспрессией VEGF­C в опухолевой ткани пищевода и наличием метаста­ зов в лимфатических узлах [33]. Следует, однако, за­ метить, что анализ методом ПЦР не позволяет опре­ делить, в каких именно клетках экспрессируется вы­ являемый ген (ОК или примыкающие к ним клетки нормальных тканей). Кроме того, как известно, экс­ прессия гена на уровне мРНК не всегда отражает ре­ альное содержание его белкового продукта.

ЗНАчЕНИЕ ЛИМФАНГИОГЕНЕЗА ДЛя МЕТАСТАЗИРОВАНИя

Процесс метастазирования включает в себя кас­ кад последовательных и взаимосвязанных этапов: инвазию злокачественных клеток вглубь окружаю­ щих тканей, стимуляцию лимфангиогенеза и ан­ гиогенеза, проникновение ОК в лимфатические и кровеносные сосуды (интравазация), продвиже­ ние ОК с током лимфы или крови, задержку в бли­ жайших или в отдаленных органах и тканях в ре­ зультате адгезии к сосудистому эндотелию, выход ОК из сосудов (экстравазация), адаптацию к усло­ виям нового микроокружения, образование и рост вторичного (метастатического) опухолевого узла. Приблизительно 80% солидных опухолей форми­ руют метастазы преимущественно путем проник­ новения ОК в лимфатическую систему, и только 20% — через кровеносные сосуды. Как правило, карциномы метастазируют лимфогенным (и зна­ чительно реже — гематогенным) путем, тогда как саркомы образуют вторичные опухолевые узлы главным образом после попадания ОК в кровенос­ ное русло. Через лимфатические сосуды чаще всего распространяются клетки при таких формах злока­ чественных новообразований как рак предстатель­ ной железы, меланома, РМЖ, рак желудка и тонкой кишки, а также опухоли головы и шеи [34]. Извест­ но, что задержка ОК, которые мигрируют лимфо­ генным путем, чаще всего происходит в одном или нескольких регионарных лимфатических узлах, на­ зываемых «сторожевыми» (СЛУ), первых на пути оттока лимфы. Более того, образование метастазов

в регионарных лимфатических узлах считается од­ ним из прогностических маркеров и важным кри­ терием для выбора стратегии лечения [35].

На рис. 2 представлены основные этапы лимфо­ генного метастазирования.

Рис. 2. Основные этапы лимфогенного метастазирования: А — образование первичного опухолевого узла; Б — рост опухоли и секреция лимфогенных факторов; В — лимф­ ангиогенез в интра­ и перитуморальной зоне; Г — отделе­ ние ОК от первичной опухоли и их миграция в направлении лимфатических капилляров; Д — интравазация ОК в лим­ фатическую систему; Е— циркуляция ОКвлимфатическом сосуде с током лимфы; Ж — оседание ОК в субкапсулярном синусе лимфатического узла (1, 2 — приносящие и вынося­ щие лимфатические сосуды); З — формирование и рост ме­ тастазов в лимфатическом узле (адаптировано по [36]).

Как можно видеть, они подобны соответствую­ щимэтапамгематогенногометастазирования. Однако, сравнивая 2 способа диссеминации ОК, следует отме­ тить, что лимфогенный путь представляется более бла­ гоприятнымдляраспространенияиколонизации ОК. Во­первых, при отсутствии перицитов, гладкомышеч­ ных клеток и базальной мембраны характерным при­ знаком новых ЛК является повышенная проницае­ мость стенки капилляра [37]. Во­вторых, миграция по сосудистому руслу одиночных ОК и их кластеров осу­ ществляется намного эффективнее, благодаря больше­ му диаметру ЛК по сравнению с кровеносными капил­ лярами (20–120 vs 7–9 мкм). И, в­третьих, в лимфати­ ческих сосудах практически отсутствуют стрессовые эффекты так называемой силы гидродинамического сдвига, которая действует в системе циркуляции кро­ ви. Благодаря этому значительно повышается выжи­ вание клеток с метастатическим фенотипом в услови­ ях их субстрат­независимой диссеминации.

Ранее считалось, что лимфогенное метастазирова­ ниепредставляетсобойлишьпассивныйпроцесс, при котором ОК, случайно попав в лимфатические сосу­ ды, имеющиеся вблизи первичного опухолевого оча­ га, с током лимфы заносятся в лимфатические узлы. Однако данные последних лет убедительно свидетель­ ствуют, что стимуляция лимфангиогенеза и последую­ щая интравазация ОК в лимфатические сосуды яв­ ляются важным условием для метастазирования ОК в лимфатические узлы. Существенную роль в этих

процессахиграют, соответственно, лимфангиогенные факторы и протеиназа MMP­2. Эксперименты с ис­ пользованием рекомбинантного белка sVEGFR­3­Ig, вектора с малыми интерферирующими РНК против гена VEGF­C или антител против VEGF­D свидетель­ ствуют о непосредственной связи между экспресси­ ей VEGF­C или VEGF­D и образованием метастазов [38–40]. Кроме того, экспрессия VEGF­C в клетках хирургически удаленных опухолей желчного пузыря достоверно (p < 0,001) коррелирует с образованием лимфогенных метастазов и худшей выживаемостью после операции [41]. Выявлена связь между уровнем мРНК и белка VEGF­C в ткани рака желудка и инва­ зией ОК в лимфатические сосуды, а также формиро­ ванием метастазов в лимфатических узлах [42]. Боль­ ные с высоким уровнем экспрессии VEGF­C имели значительно худший показатель 5­летней выживае­ мости. Более того, уровень VEGF­C оказался неза­ висимым прогностическим фактором риска смерти у больных раком желудка [42]. В другой работе [43] экспрессия VEGF­C была зарегистрирована у 72,3% пациентов с немелкоклеточным раком легкого, а ре­ цептора VEGFR3 — в 52,6% случаев. При этом ко­ экспресия VEGF­C и VEGFR3 достоверно (p < 0,05) коррелировала свыявлением ОКвлимфатических со­ судах и метастазов в лимфатических узлах. У больных с VEGF­C­позитивными опухолями легкого прогноз был более неблагоприятным по сравнению с теми, у кого VEGF­C в ткани опухоли отсутствовал. Резуль­ таты экспериментов по изучению прогностического значения VEGF­C или VEGF­D при разных формах солидных опухолей суммированы в табл. 3.

Другой механизм участия лимфангиогене­

за в процессах метастазирования состоит в стиму­ ляции образования новых ЛК в СЛУ [44] (рис. 3).

Рис. 3. Лимфогенное и гематогенное метастазирование опухолей: 1 — лимфангиогенез в первичном опухолевом узле; 2 — лимфангиогенез в регионарном лимфатическом узле; 3 — сторожевой лимфатический узел; 4 — отдален­ ный лимфатический узел; 5 — правый лимфатический проток; 6 — печень; 7 — кость; 8 — головной мозг; 9 — легкие; 10 — ангиогенез в первичном опухолевом узле. Тонкими стрелками указано направление тока лимфы, толстыми стрелками — тока крови

Таблица 3 Примеры корреляции между уровнем VEGF-C/-D, плотностью

лимфатических капилляров, выявлением метастазов в лимфатических узлах и прогнозом

*При одновременном определении с плотностью кровеносных микрососудов.

На экспериментальных моделях было показано, что процесс может активироваться еще до момента по­ падания ОК в лимфатический узел, и в роли основ­ ных инициаторов лимфангиогенеза в СЛУ высту­ пают лимфангиогенные факторы, продуцируемые клетками первичной опухоли. Образование новых ЛК внутри и вокруг подмышечных лимфатических узлов у больных РМЖ было подтверждено недавно в одной из работ [45].

Предполагается, что активация лимфангиогене­ за в СЛУ благоприятствует дальнейшему метастази­ рованию в отдаленные органы и ткани. Однако этот вопрос продолжает оставаться малоизученным. Ис­ следования в эксперименте свидетельствуют, что индукция новых ЛК способствует появлению мета­ стазов не только в лимфатических узлах, но и в лег­ ком [46, 47]. На основании этих и некоторые дру­ гих данных справедливо заключить, что формиро­

вание метастазов в лимфатических узлах может быть плацдармом для последующей колонизации мета­ статическими ОК легкого, печени, мозга и других органов. Более того, при солидных опухолях опре­ деленных локализаций резекция опухоли, прове­ денная одновременно с удалением региональных лимфатических узлов (в случае выявления в них метастатических очагов), является стандартом ле­ чения, которое обеспечивает повышение продол­ жительности жизни больных без рецидивов и отда­ ленных метастазов.

Общеизвестно, что определенные типы опухо­ лей преимущественно метастазируют в определен­ ные органы или ткани. Например, метастазы РМЖ чаще всего выявляют в костях, печени, легком или мозге, метастазы меланомы — в легком, метастазы рака толстой и прямой кишки — в печени, а мета­ стазы опухолей предстательной железы — в костях. Остается неясным, зависит ли такая избиратель­ ность от путей диссеминации ОК в организме. В он­ кологии уже больше столетия существует теория «се­ мян и почвы», согласно которой опухоль метаста­ зирует в органы с наиболее благоприятными для ее роста условиями. Альтернативная точка зрения при­ дает решающее значение анатомическим особен­ ностям локализации первичного опухолевого оча­ га. Например, у больных раком толстой и прямой кишки ОК чаще всего проникают именно в печень по портальной системе (более чем у 55% больных) [48]. Скорее всего оба представления о преимуще­ ственном месте расположения метастазов следует признать обоснованными.

В последнее время получены данные, проливаю­ щие свет на один из механизмов реализации теории

«семян и почвы». Оказалось, что органоспецифи­ ческому метастазированию содействуют рецепто­ ры хемокинов, экспрессирующиеся на поверхности ОК. Как известно, хемокины представляют собой семейство секретируемых цитокинов, необходи­ мых для активации нейтрофилов и моноцитов и их привлечения в очаг воспаления. Установлено, что клетки РМЖ человека экспрессируют рецептор хе­ мокинов CXCR4, тогда как его специфический ли­ ганд CXCL12 продуцируется клетками тканей (кост­ ный мозг, легкое и лимфатические узлы), в которых чаще всего выявляют метастазы РМЖ [49]. При этом в системе in vitro клетки РМЖ способны мигриро­ вать по направлению к CXCL12, а антитела, нейтра­ лизующие CXCR4, ингибируют образование мета­ стазов в лимфатических узлах у экспериментальных животных. Клетки СЛУ продуцируют и другие (на­ пример CCL21) специфические хемокины, привле­ кающие к ним ОК из первичной опухоли, что кор­ релирует с наличием метастазов в СЛУ [50]. Важные аспекты механизма, связанного с хемотаксической активностью хемокинов, были недавно раскрыты

J.D. Shields и соавторами [51]. Показано, что секре­ тируемые клетками перевиваемых опухолевых ли­ ний хемокины CCL19 и CCL21 способствуют при­

влечению ОК к эндотелию лимфатических сосудов. Такая направленная миграция ОК обеспечивается за счет распознавания градиента концентрации хе­ мокинов их рецептором CCR7, имеющимся на ОК. Следовательно, клетки первичной опухоли (то есть

«семена») способны участвовать в подготовке «поч­ вы» для формирования будущих метастазов. Такой вывод подтверждается данными клинических ис­ следований. Установлена связь между повышенной экспрессией хемокинового рецептора CCR7 на клет­ ках опухолей толстой и прямой кишки, метастазиро­ ванием в лимфатические узлы и снижением у таких больных показателей выживаемости [52].

Взаимодействие ОК с ЭКЛС не ограничивается только секретируемыми факторами, как, например VEGF, хемокины или другие цитокины. Молекулы адгезии, экспрессирующиеся на апикальной поверх­ ности ЭКЛС, усиливают способность ОК мигриро­ вать внутри сосуда по направлению к лимфатиче­ ским узлам [53]. Среди структур, непосредственно участвующих в таких межклеточных взаимодействи­ ях, особый интерес вызывает рецептор маннозы, специфичный для ЭКЛС, а также CLEVER­1, при­ сутствующий как на ЭКЛС, так и на ЭККС. Меха­ низмы узнавания ЭКЛС, способствующих миграции ОК, заслуживают дальнейшего исследования.

Состояние лимфатических узлов — наиболее важный критерий для определения категории рис­ ка у больных c I/II стадией солидных новообразо­ ваний. При этом отсутствие метастазов в регио­ нарных лимфатических узлах (включая СЛУ) рас­ сматривается как особенно значимый фактор для отнесения случая к низкой категории риска. Выяв­ ление микрометастазов в регионарных лимфатиче­ ских узлах имеет неблагоприятное прогностическое значение в случаях РМЖ, меланомы, рака толстой и прямой кишки, пищевода, желудка, легкого, го­ ловы и шеи, органов женской половой сферы и не­ которых других (цит. по [54]). Другим ухудшающим прогноз фактором является инвазия лимфатических сосудов, особенно у больных с отсутствием мета­ стазов в лимфатических узлах. Выявление инвазии лимфатических сосудов коррелирует с выживаемо­ стью больных РМЖ, раком желудка, мочевого пу­ зыря и предстательной железы. В последнее время плотность лимфатических сосудов также стали рас­ сматривать в качестве фактора прогноза, на чем мы остановимся детальнее.

Поскольку при увеличении плотности ЛК по­ вышается вероятность проникновения ОК в лим­ фатическую систему, следует ожидать, что суще­ ствует корреляция между плотностью ЛК и часто­ той образования метастазов в лимфатических узлах. Например, Q. Li и соавторы [43] выявили достовер­ ную зависимость между плотностью ЛК в ткани опу­ холи (немелкоклеточный рак легкого) и стадией за­ болевания, проникновением ОК в лимфатические сосуды, а также образованием лимфогенных мета­ стазов. Для больных немелкоклеточным раком лег­

кого с метастазами в лимфатических узлах и с худ­ шим показателем общей выживаемости, количество ЛК в зоне, которая окружает опухоль, значительно превышало таковое у больных без метастазов и с бо­ лее благоприятным прогнозом [55]. Другие приме­ ры выявления коррелятивной связи между повы­ шенной плотностью ЛК и негативным прогнозом приведены в табл. 3.

Возможны 2 пути лимфогенной диссеминации ОК: либо через ЛК, предсуществующие в окруже­ нии опухолевого узла, либо через ЛК, которые фор­ мируются внутри него. Вопрос о функциональной значимости интратуморальных ЛК до сих пор оста­ ется дискуссионным. Предполагалось, что инт­ ратуморальные ЛК не могут участвовать в транс­ порте ОК с лимфотоком, поскольку они находятся в сдавленном состоянии из­за повышенного гид­ ростатического давления внутри опухоли. Однако в ряде работ сообщается о выявлении четкой кор­ реляционной зависимости между плотностью инт­ ратуморальных ЛК и наличием метастазов в лимфа­ тических узлах и/или неблагоприятным прогнозом. В частности, при опухолях головы и шеи, раке под­ желудочной железы, папиллярном раке щитовидной железы, раке почки или меланоме образование ЛК происходит внутри опухолевого узла. Пролифера­ тивная активность ЭКЛС, которая оценивалась с по­ мощью моноклональных антител против ядерного антигена Ki­67, а также наличие внутри ЛК опухоле­ вых эмболов свидетельствуют об участии новых ЛК в диссеминации ОК. Более того, у пациентов с плос­ коклеточным раком головы и шеи плотность интра­ туморальных (но не перитуморальных) ЛК рассмат­ ривается в качестве независимого фактора небла­ гоприятного прогноза [56]. В то же время, согласно данным, полученным M.I. Koukourakis и соавтора­ ми [57], интратуморальные ЛК отсутствуют при раке легкого. Хорошо развитые ЛК у таких больных, а так­ же при раке эндометрия, выявляют лишь в зоне, ко­ торая окружает опухоль [57, 58].

Вырабатывая лимфогенные факторы, ОК ини­ циируют лимфангиогенез не только внутри опухо­ ли, но и в ее ближайшем окружении. Лимфоген­ ные факторы также обладают сосудорасширяющи­ ми свойствами в отношении перитуморальных ЛК [38]. Все это свидетельствует о важности перитумо­ рального лимфангиогенеза для распространения ме­ тастатических ОК. Такая ситуация характерна для больных РМЖ, меланомой, раком желудка, шейки матки и предстательной железы. Причем в послед­ нем случае [59] была установлена корреляция между плотностью перитуморальных ЛК и уровнем 5­лет­ ней безрецидивной выживаемости. Напротив, ряд авторов [60, 61] показали, что активация перитумо­ рального лимфангиогенеза является маркером бо­ лее благоприятного течения заболевания и боль­ шей продолжительности жизни онкологических больных. Таким образом, проблема участия интра­ и перитуморальных ЛК в метастазировании окон­

чательно не решена и продолжает оставаться пред­ метом интенсивных исследований.

Что касается становления локального иммун­ ного ответа на антигены оседающих в СЛУ ме­ тастатических ОК, то существенная роль в этих процессах отводится СЛУ. Известно несколько иммуносупрессирующих механизмов, реализую­ щихся на разных этапах метастазирования. Один из них связан с поступлением в СЛУ ряда цитокинов, продуцируемых клетками первичного опухолевого узла. Важно, что перенесенные с током лимфы ци­ токины проявляют свои эффекты еще до колониза­ ции лимфатических узлов ОК. В частности, показа­ но, что у больных РМЖ или с меланомой содержание IL­10 в СЛУ значительно превышает таковое в других регионарных лимфатических узлах у тех же больных [62, 63]. При этом IL­10 может ингибировать про­ тивоопухолевую активность моноцитов, в том чис­ ле за счет подавления продукции IL­12. IL­10 также способен блокировать секрецию Th1­клетками та­ ких цитокинов как гамма­интерферон и TNF­альфа и предохранять ОК от лизиса, вызванного цитоток­ сическими Т­лимфоцитами. Кроме того, IL­10 спо­ собствует увеличению локальной продукции других регуляторов иммунного ответа, например, TGF­β и простагландина E2, которые участвуют в подавле­

нии антиген­презентирующей активности дендрит­

ных клеток. Другой механизм индуцированной им­ муносупрессии в СЛУ связан с лимфоцитами, ин­ фильтрирующими ткань опухоли. Оказалось, что CD8+CD28– Т­лимфоциты способны ингибировать пролиферацию и цитотоксическое действие цитоток­ сических Т­лимфоцитов [64]. Причем CD8+CD28– Т­лимфоциты выявляют только в СЛУ, которые со­ держат микрометастазы и не обнаруживают в ин­ тактных лимфатических узлах. Таким образом, иммуносупрессию, которая имеет место в СЛУ, сле­ дует рассматривать в качестве важного фактора, спо­ собствующего формированию метастазов в лимфа­ тических узлах. ОК не только стимулируют лимфан­ гионез в опухоли и дренирующих ее лимфатических узлах, но и обеспечивают в последних эффективное подавление локального иммунного ответа. При этом образование новых лимфатических сосудов и имму­ носупрессия нередко происходят до выявления ме­ тастатических очагов в регионарных лимфатических узлах, что согласуется с гипотезой о формировании первичной опухолью в СЛУ так называемой предме­ тастатической ниши.

ЗАкЛючЕНИЕ

Анализ приведенных в лекции данных свидетель­ ствует о том, что за последнее десятилетие достиг­ нут определенный прогресс в раскрытии механиз­ мов, которые регулируют образование новых лим­ фатических сосудов. В частности, были выявлены основные цитокины, которые непосредственно или опосредованно стимулируют миграцию, пролифера­ цию и выживание ЭКЛС (VEGF­C/D, bFGF, IGF,

HGF, PDGF), а также маркерные белки (LYVE­1, подопланин, Prox­1 и другие), с помощью которых можно дифференцировать ЭКЛС и ЭККС. Важно, чтобы биомаркеры ЭКЛС определялись в комбина­ ции, а ЛК учитывались как внутри, так и по пери­ ферии опухолевого узла. Были также получены дан­ ные об участии лимфангиогенеза в диссеминации ОК в регионарные лимфатические узлы и отдален­ ные органы или ткани. Более того, была установле­ на корреляционная связь между высоким уровнем VEGF­C/D или плотностью ЛК и выявлением мета­ стазов, а также меньшей продолжительностью жиз­ ни больных с солидными опухолями разного гене­ за. Дальнейшее выяснение роли лимфангиогенеза в метастазировании опухолей важно как для прогно­ за онкологического заболевания, так и для разработ­ ки новых лекарственных препаратов, обладающих антиметастатической активностью.

ЛИТЕРАТУРА

1. The Lymphatic Continuum Revisited. Rockson SG, Ed. Ann N Y Acad Sci 2008; 1131, 243 pp.

2. Heckman CA, Holopainen T, Wirzenius M, et al. The tyrosine kinase inhibitor cediranib blocks ligand­induced vascular endothelial growth factor receptor­3 activity and lymphangiogenesis. Cancer Res 2008; 68: 4754–62.

3. Stacker SA, Hughes RA, Williams RA, Achen MG. Current strategies for modulating lymphangiogenesis signalling pathways in human disease. Curr Med Chem 2006; 13: 783–92.

4. Facchetti F, Monzani E, La Porta CA. New perspectives in the treatment of melanoma: anti­angiogenic and anti­ lymphangiogenic strategies. Recent Patents Anticancer Drug Discov 2007; 2: 73–8.

5. Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF­C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR­3) and KDR (VEGFR­2) receptor tyrosine kinases. EMBO J 1996; 15: 290–8.

6. Taipale J, Makinen T, Arighi E, et al. Vascular endothelial growth factor receptor­3. Curr Top Microbiol Immunol 1999; 237: 85–96.

7. Makinen T, Jussila L, Veikkola T, et al. Inhibition of lymphangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF receptor­3. Nat Med 2001; 7: 199–205.

8. Enholm B, Karpanen T, Jeltsch M, et al. Adenoviral expression of vascular endothelial growth factor­C induces lymphangiogenesis in the skin. Circ Res 2001; 88: 623–9.

9. Rissanen TT, Markkanen JE, Gruchala M, et al. VEGF­D is the strongest angiogenic and lymphangiogenic effector among VEGFs delivered into skeletal muscle via adenoviruses. Circ Res 2003; 92: 1098–106.

10. Karpanen T, Heckman CA, Keskitalo S, et al. Functional interaction of VEGF­C and VEGF­D with neuropilin receptors. FASEB J 2006; 20: 1462–72.

11. Vlahakis NE, Young BA, Atakilit A, Sheppard D. The lymphangiogenic vascular endothelial growth factors VEGF­C and ­D are ligands for the integrin alpha9beta1. J Biol Chem 2005; 280: 4544–52.

12. Caunt M, Mak J, Liang WC, et al. Blocking neuropilin­2 function inhibits tumor cell metastasis. Cancer Cell 2008; 13: 331–42.

13. Huang XZ, Wu JF, Ferrando R, et al. Fatal bilateral chylothorax in mice lacking the integrin alpha9beta1. Mol Cell Biol 2000; 20: 5208–15.

14. Garmy-Susini B, Makale M, Fuster M, Varner JA. Methods to study lymphatic vessel integrins. Methods Enzymol 2007; 426: 415–38.

15. Makinen T, Veikkola T, Mustjoki S, et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF­C/D receptor VEGFR­3. EMBO J 2001; 20: 4762–73.

16. Salameh A, Galvagni F, Bardelli M, et al. Direct recruitment of CRK and GRB2 to VEGFR­3 induces proliferation, migration, and survival of endothelial cells through the activation of ERK, AKT, and JNK pathways. Blood 2005; 106: 3423–31.

17. Nagy JA, Vasile E, Feng D, et al. Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well as angiogenesis. J Exp Med 2002; 196: 1497–506.

18. Whitehurst B, Flister MJ, Bagaitkar J, et al. Anti­ VEGF­A therapy reduces lymphatic vessel density and expression of VEGFR­3 in an orthotopic breast tumor model. Int J Cancer 2007; 121: 2181–91.

19. Cao Y. Direct role of PDGF­BB in lymphangiogenesis and lymphatic metastasis. Cell Cycle 2005; 4: 228–30.

20. Schoppmann SF, Birner P, Stockl J, et al. Tumor­ associated macrophages express lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphangiogenesis. Am J Pathol 2002; 161: 947–56.

21. Maruyama K, Ii M, Cursiefen C, et al. Inflammation­ induced lymphangiogenesis in the cornea arises from CD11b­ positive macrophages. J Clin Invest 2005; 115: 2363–72.

22. Salven P, Mustjoki S, Alitalo R, et al. VEGFR­3 and CD133 identify a population of CD34+ lymphatic/vascular endothelial precursor cells. Blood 2003; 101: 168–72.

23. Banerji S, Ni J, Wang S-X, et al. LYVE­1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph­specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol 1999; 144: 789–801.

24. Van der Auwera I, Cao Y, Tille JC, et al. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. Br J Cancer 2006; 95: 1611–25.

25. Evangelou E, Kyzas PA, Trikalinos TA. Comparison of the diagnostic accuracy of lymphatic endothelium markers: Bayesian approach. Mod Pathol 2005; 18: 1490–7.

26. Tamura M, Oda M, Tsunezuka Y, et al. Chest CT and serum vascular endothelial growth factor­C level to diagnose lymph node metastasis in patients with primary non­small cell lung cancer. Chest 2004; 126: 342–6.

27. Yu XM, Lo CY, Lam AK, et al. Serum vascular endothelial growth factor C correlates with lymph node metastases and high­ risk tumor profiles in papillary thyroid carcinoma. Ann Surg 2008; 247: 483–9.

28. Krzystek-Korpacka M, Matusiewicz M, Diakowska D, et al. Up­regulation of VEGF­C secreted by cancer cells and not VEGF­A correlates with clinical evaluation of lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Cancer Lett 2007; 249: 171–7.

29. Kaushal V, Mukunyadzi P, Dennis RA, et al. Stage­specific characterization of the vascular endothelial growth factor axis in prostate cancer: expression of lymphangiogenic markers is associated with advanced­stage disease. Clin Cancer Res 2005; 11: 584–93.

30. Kimura H, Kato H, Tanaka N, et al. Preoperative serum vascular endothelial growth factor­C (VEGF­C) levels predict recurrence in patients with esophageal cancer. Anticancer Res 2008; 28: 165–9.

31. Wang TB, Deng MH, Qiu WS, Dong WG, et al. Association of serum vascular endothelial growth factor­C and lymphatic vessel density with lymph node metastasis and prognosis of patients with gastric cancer. World J Gastroenterol 2007; 28: 1794–8.

32. Vihinen PP, Hilli J, Vuoristo MS, et al. Serum VEGF­C is associated with metastatic site in patients with malignant melanoma. Acta Oncol 2007; 46: 678–84.

33. Loges S, Clausen H, Reichelt U, et al. Determination of microvessel density by quantitative real­time PCR in esophageal cancer: correlation with histologic methods, angiogenic growth factor expression, and lymph node metastasis. Clin Cancer Res 2007; 13: 76–80.

34. Kaiserling E, Krober S, Geleff S. Lymphatic vessels in the colonic mucosa in ulcerative colitis. Lymphology 2003; 36: 52–61.

35. Pepper MS, Tille JC, Nisato R, Skobe M. Lymphangiogenesis and tumor metastasis. Cell Tissue Res 2003; 314: 167–77.

36. Nathanson SD. Insights into the mechanisms of lymph node metastasis. Cancer 2003; 98: 413–23.

37. Ji RC, Kato S. Lymphatic network and lymphangiogenesis in the gastric wall. J Histochem Cytochem 2003; 51: 331–8.

38. He Y, Rajantie I, Pajusola K, el al. Vascular endothelial cell growth factor receptor 3­mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via lymphatic vessels. Cancer Res 2005; 65: 4739–46.

39. Chen Z, Varney ML, Backora MW, el al. Down­regulation of vascular endothelial cell growth factor­C expression using small interfering RNA vectors in mammary tumors inhibits tumor lymphangiogenesis and spontaneous metastasis and enhances survival. Cancer Res 2005; 65: 9004–11.

40. Stacker SA, Caesar C, Baldwin ME, et al. Vascular endothelial growth factor­D promotes the metastatic spread of cancer via the lymphatics. Nature Med 2001; 7: 186–191.

41. Nakashima T, Kondoh S, Kitoh H, et al. Vascular endothelial growth factor­C expression in human gallbladder cancer and its relationship to lymph node metastasis. Int J Mol Med 2003; 11: 33–9.

42. Duff SE, Li C, Jeziorska M, et al. Vascular endothelial growth factors C and D and lymphangiogenesis in gastrointestinal tract malignancy. Br J Cancer 2003; 89: 426–30.

43. Li Q, Dong X, Gu W, et al. Clinical significance of co­ expression of VEGF­C and VEGFR­3 in non­small cell lung cancer. Chin Med J (Engl) 2003; 116: 727–30.

44. Achen MG, Stacker SA. Molecular control of lymphatic metastasis. Ann NY Acad Sci 2008; 1131: 225–34.

45. Van den Eynden GG, Van der Auwera I, Van Laere SJ, et al. Induction of lymphangiogenesis in and around axillary lymph node metastases of patients with breast cancer. Br J Cancer 2006; 95: 1362–6.

46. Skobe M, Hawighorst T, Jackson DG, et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF­C promotes breast cancer metastasis. Nat Med 2001; 7: 192–8.

47. Krishnan J, Kirkin V, Steffen A, et al. Differential in vivo and in vitro expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)­C and VEGF­D in tumors and its relationship to lymphatic metastasis in immunocompetent rats. Cancer Res 2003; 63: 713–22.

48. Scheele J, Stangi R, Altendorf-Hofmann A. Hepatic metastases from colorectal carcinoma: impact of surgical resection on the natural history. Br J Surg 1990: 77: 1241–6.

49. Muller A, Homey B, Soto H, et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 2001; 410: 50–6.

50. Takeuchi H, Fujimoto A, Tanaka M, et al. CCL21 chemokine regulates chemokine receptor CCR7 bearing malignant melanoma cells. Clin Cancer Res 2004; 10: 2351–8.

1. Renyi-Vamos F, Tovari J, Fillinger J, et al.Lymphangiogenesis correlates with lymph node metastasis, prognosis, and angiogenic phenotype in human non­small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2005; 11: 7344–53.

2. Kyzas PA, Geleff S, Batistatou A, et al. Evidence for lymphangiogenesis and its prognostic implications in head and neck squamous cell carcinoma. J Pathol 2005; 206: 170–7.

3. Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, et al. LYVE­1 immunohistochemical assessment of lymphangiogenesis in endometrial and lung cancer. J Clin Pathol 2005; 58: 202–6.

4. Stefansson IM, Salvesen HB, Akslen LA. Vascular proliferation is important for clinical progress of endometrial cancer. Cancer Res 2006; 66: 3303–9.

5. Kuroda K, Horiguchi A, Asano T, et al. Prediction of lymphatic invasion by peritumoral lymphatic vessel density in prostate biopsy cores. Prostate 2008; 68: 1057–63.

6. Straume O, Jackson DG, Akslen LA. Independent prognostic impact of lymphatic vessel density and presence of low­ grade lymphangiogenesis in cutaneous melanoma. Clin Cancer Res 2003; 9: 250–6.

7. Wong SY, Haack H, Crowley D, et al. Tumor­secreted vascular endothelial growth factor­C is necessary for prostate cancer lymphangiogenesis, but lymphangiogenesis is unnecessary for lymph node metastasis. Cancer Res 2005; 65: 9789–98.

8. Woo SU, Bae JW, Yang JH, et al. Overexpression of interleukin­10 in sentinel lymph node with breast cancer. Ann Surg Oncol 2007; 14: 3268–73.

9. Lee JH, et al. Quantitative analysis of melanoma­induced cytokine­mediated immunosuppression in melanoma sentinel nodes. Clin Cancer Res 2005; 11: 107–12.

10. Filaci G, Fenoglio D, Fravega M, et al. CD8+CD28– T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and cytotoxic functions infiltrate human cancers. J Immunol 2007; 179: 4323–34.

    1. Shields JD, Fleury ME, Yong C, et al. Autologous

       chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell 2007; 11: 526–38.

    2. Günther K, Leier J, Henning G, et al. Prediction of lymph node metastasis in colorectal carcinoma by expression of chemokine receptor CCR7. Int J Cancer 2005; 116: 726–33.

    3. Farnsworth RH, Achen MG, Stacker SA. Lymphatic endothelium: an important interactive surface for malignant cells. Pulm Pharmacol Ther 2006; 19: 51–60.

    4. Takeuchi H, Kitajima M, Kitagawa Y. Sentinel lymph node as a target of molecular diagnosis of lymphatic micrometastasis and local immunoresponse to malignant cells. Cancer Sci 2008; 99: 441–50.