ИНДУКЦИЯ P53-ЗАВИСИМОГО АПОПТОЗА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ В-КЛЕТОЧНЫМ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ

ВВЕДЕНИЕ

Важную роль в функционировании клеток играет система репарации нуклеиновых кислот, которая активируется в ответ на повреждение геномной ДНК при действии различных генотоксических агентов, в том числе ионизирующего излучения (ИИ). Ключевыми ферментами для ее запуска являются внутриядерные киназы — АТМ (ataxia-telangiectasia mutated), DNA-PK (DNA protein inase) и A (atax- ia telangiectasia and ad3-related protein), которые фосфорилируют различные белки, прежде всего белок р53 [1]. Фосфорилированный р53 поступает в PML-тельца (внутриядерные образования, описанные у больных промиелоцитарным лейкозом), где вступает во взаимодействие с активатором транскрипции СВР-PML, что вызывает ацетилирование р53 [2]. Такая посттрансляционная модификация белка удлиняет период его полураспада и приводит к накоплению р53 в ядре без существенного повышения уровня транскрипции, а также значительно повышает его активность как активатора экспрессии различных генов [3]. Мишенями р53 являются гены белков р21 (ингибитор циклинзависимой киназы) [4], BAX [5], BCL-2 [6]. Скоординированное функционирование этих и ряда других белков вызывает остановку клеточного цикла, что дает возможность репарировать генетические повреждения, а при невозможности осуществить процессы репарации — индуцирует р53-зависимый апоптоз [7].

Способность к индукции р53-зависимого апоптоза во многом определяет поведение опухолевой клетки при различных видах новообразований [8]. Мутации гена р53 относятся к наиболее частым при опухолевом процессе. При хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ) В-клеточной природы мутации гена р53

(делеция хромосомы р17), которые выявляются у 10–15% больных, являются самостоятельным негативным фактором прогноза заболевания [9]. Помимо этого, у больных ХЛЛ дисфункцию р53 могут вызвать делеции гена АТМ (делеции 11q22-23 хромосомы, отмечают у 5–8% больных), а также гиперэкспрессия гена MDM2, что приводит к повышению содержания в клетке соответствующего белка, который взаимодействует с р53 и способствует его убиквитинзависимой деградации в протеосомах [10, 11].

Группой исследователей под руководством

. Stanovic [12] был предложен функциональный подход к исследованию нарушений в системе р53-зависимого апоптоза у больных ХЛЛ. Он основывается на оценке жизнеспособности клеток и содержания внутриклеточных белков (р53, р21, MDM2) при воздействии ИИ. Нарушения в любом звене системы р53 приводит к развитию резистентности клеток к индукции апоптоза, а по характеру экспрессии отдельных белков можно установить уровень генетических нарушений.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении частоты нарушений р53-зависимого апоптоза у больных ХЛЛ, находившихся на стационарном лечении в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Научного центра радиационной медицины АМН Украины, и оценке характера выявленных нарушений.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 45 больных В-ХЛЛ, 35 мужчин и 10 женщин в возрасте от 42 до 78 лет (средний возраст 56,1 + 8,8 года). Диагноз устанавливали на основании клинико-гематологических критериев

[13–15] и иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови. В исследование взяты пациенты с содержанием субстратных лимфоидных клеток (CD5+CD20+CD23+HLA-D+CD22low) в периферической крови не менее 80%.

Полученные мононуклеары периферической крови культивировали на протяжении ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в питательной среде PMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамина, пенициллина и стрептомицина. Облучали опытные культуры в дозе

5 Гр в течение 110 с с помощью источника цезий-137 (аппарат для облучения препаратов крови IBL437C CIS Bio International, Франция), продолжали культивирование в тех же условиях и оценивали жизнеспособность клеток через 24, 48 и 72 ч методом окрашивания трипановым синим. Через 10 ч после облучения часть клеток (2 x 106) лизировали для последующего вестерн-блот анализа. Лизис проводили в течение 30 мин в холодном литическом буфере, содержащем 25 мM ris HCl, pH 7,5; 5 мM EDA, 1 мM PMSF, 100 мкг/мл апротинина, 200 мкг/мл леупептина, 50 мM NaF, (Sigma, Германия) и 1% детергента NP-40. Супернатант центрифугировали при 15 000 об./мин в течение 15 мин при температуре 9 °C. Полученные экстракты ресуспендировали в равном объеме 2-кратного буфера для электрофореза, прогревали на водяной бане и проводили вертикальный электрофорез в 5% полиакриламидном геле по Laemmli [16]. После переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану определеляли экспрессию белков методом вестерн-блот анализа и усиленной хемилюминесценции (ECL). Использовали следующие моноклональные антитела (МкАТ): анти-MDM2 (клон HMDM2-323), анти-р21 (клон СР74), анти-р53 (клон Р5813), а также кроличьи антитела против фосфорилированного р53 (все реагенты производства «Sigma», США).

Статистическую обработку полученных данных

проводили с использованием программы SPSS 13.0 (SPSS, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большая часть опухолевых В-лимфоцитов периферической крови у больных ХЛЛ, как известно, находится в фазе покоя G0 и резистентна к митогенной стимуляции [17]. Поэтому при оценке клеточного ответа на действие ИИ мы ориентировались на количество погибших клеток, а не на показатели задержки клеточного цикла.

В контрольных необлученных культурах мор-

фологическая характеристика клеток существенно не менялась, а число погибших клеток достоверно не различалось в различные сроки наблюдения (p > 0,05). Клеточный субстрат был представлен в основном лимфоцитами малого и среднего размера. После облучения, начиная с 24 ч после начала опыта, в культурах появлялись клетки с фрагментацией ядра, зернистостью в цитоплазме (остатки ядерной

субстанции), апоптотические тельца. Одновременно возрастало количество погибших клеток, что устанавливали по их окраске трипановым синим. Разница между числом погибших клеток в контрольных и опытных культурах была достоверной (p < 0,001) во все сроки наблюдения (рис. 1).

Рис. 1. Жизнеспособность лимфоидных клеток больных В-ХЛЛ в различные сроки после воздействия ИИ (опыт) по сравнению с необлученными культурами (контроль)

Для каждого из больных рассчитывали вероятность различий в жизнеспособности клеток в контрольных и опытных культурах по критерию χ2 (таблица). Для большинства обследованных больных (34 человека; 75,6%) эти различия были достоверными (p < 0,001).

Таблица Жизнеспособность клеток в контрольных и облученных

облучения, ч

культурах клеток больных ХЛЛ в зависимости от достоверности различий при парном сравнении

У 4 больных (8,9%) клетки оставались резистентными к индукции апоптоза, и число погибших клеток было низким как в контроле, так и в опыте, причем на протяжении эксперимента оно достоверно не изменялось. Еще у 7 больных (15,5%) процент погибших клеток был одинаково высоким как в контроле, так и при воздействии ИИ. Таким образом, у 34 больных отмечали адекватный (нормальный) клеточный ответ на облучение, тогда как у 11 больных он был нарушен (атипичный ответ).

Исследование экспрессии белков проводили в лизатах клеток через 10 ч после облучения, когда индукция р53 достигает максимума [3].

У больных с нормальным характером клеточного ответа на облучение экспрессия фосфорилирован-

ного и нефосфорилированного р53 в клетках контрольных культур не определялась, но появлялась после облучения (рис. 2).

Рис. 2. Результаты исследования экспрессии фосфорилированного белка р53 в клеточных лизатах при помощи вестерн-блот анализа. Дорожки 1, 3, 5 — лизаты контрольных клеток. Дорожки 2, 4, 6 — лизаты клеток через 10 ч после облучения

Результатом активности р53 как фактора транскрипции является индукция экспрессии ряда генов-мишеней. Мы проводили определение белкового продукта одного из них, а именно белка р21. Он принимает участие в регуляции клеточного цикла, которая во многом определяется присутствием спефицических белков — циклинов. Циклины образуют комплексы с циклинзависимыми киназами (Cd), в составе которых выполняют регуляторную функцию, а киназы — ферментативную. Клеточный цикл связан с последовательной активацией различных Cd. Их активность проявляется в комплексе с циклинами, а также регулируется низкомолекулярными ингибиторами, к которым относится и белок р21. р21 входит в состав семейства р21WAF1/Clip1 и принимает участие в угнетении перехода клетки из фазы G1 в фазу S. Белок р21 связывается с комплексами циклин Е/Cd2, циклин D/Cd4 и циклин А/Cd2. Кроме того, р21 угнетает функцию ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и белка b, необходимого для пролиферации клеток [18].

У больных с адекватным клеточным ответом на облучение экспрессия р21 не отличалась от характера экспрессии р53: отсутствовала в контрольных клетках и появлялась после воздействия ИИ (рис. 3).

Рис. 3. Результаты определения экспрессии белка р21 в клеточных лизатах при помощи вестерн-блот анализа. Дорожки 1, 3, 5 — лизаты контрольных клеток. Дорожки 2, 4, 6 — лизаты клеток через 10 ч после облучения

В подгруппе больных с отсутствием индукции апоптоза под действием ИИ (4 человека) выявлено 2 типа экспрессии исследуемых белков. У 2 больных белки р53 и р21 отсутствовали в контрольных культурах и не индуцировались в опытных. В данном случае можно предположить наличие делеции 17р хромосомы с инактивацией второй аллели гена р53 или менее вероятно — мутаций гена АТМ, нарушающих его киназную активность [19]. Еще у 2 больных выявлена гиперэкспрессия белка р53 как в контроле, так и в опыте (рис. 4).

Рис. 4. Результаты определения экспрессии белка р53 в клеточных лизатах при помощи вестерн-блот анализа. Дорожки 1, 3 — лизаты контрольных клеток. Дорожки 2, 4 — лизаты клеток через 10 ч после облучения

Это свидетельствует об увеличении периода полураспада р53 в результате мутаций, которые нарушают конформационную структуру белка [20]. Кроме того, у этих больных не произошла индукция р21 (белок не выявлен в контрольных или опытных культурах клеток). Это связано с тем, что мутантный белок, хотя он и присутствует в значительном количестве, не может регулировать экспрессию геновмишеней, так как утрачивает способность связываться со специфическими последовательностями в составе ДНК [20].

Наиболее гетерогенным был характер экспрессии белков в подгруппе больных с нарушенным клеточным ответом на действие ИИ вследствие повышенной клеточной гибели в контрольных культурах (7 человек). В 2 случаях полученные данные свидетельствовали о наличии мутаций гена р53 — гиперэкспрессия белка р53 в контроле, отсутствие индукции р21. У 5 больных белки р53 и р21 отсутствовали в контроле, после облучения отмечали слабую экспрессию белка р53, белок р21 в виде слабой полосы был выявлен только у 3 из них, а в 2 случаях не индуцировался. Предположительно такой тип ответа может быть связан со снижением функциональной активности белка АТМ. Так, снижение уровня белка АТМ выявили в опухолевых клетках 30–40% больных ХЛЛ [21, 22], причем у части больных отмечали мутации гена [23].

Как уже отмечалось выше, белок MDM2 может выступать как негативный регулятор функции р53. MDM2 связывается с р53 в консервативной области (аминокислотные остатки 17–27) и способствует переходу последнего из ядра в цитоплазму, где белок р53 подвергается деградации [11]. В нашем исследовании экспрессия MDM2 была выявлена как в контрольных, так и в облученных клетках всех больных приблизительно на одинаковом уровне, хотя и была несколько выше в лизатах облученных клеток у больных с адекватным клеточным ответом на облучение (рис. 5).

Рис. 5. Результаты определения экспрессии белка MDM2 в клеточных лизатах при помощи вестерн-блот анализа. Дорожки 1, 3 — лизаты контрольных клеток. Дорожки 2, 4 — лизаты клеток через 10 ч после облучения

Возможно, это связано с тем, что белок р53 является активатором экспрессии MDM2 [24]. Одна-

ко ни у одного из больных, независимо от характера клеточного ответа на облучение, не выявлено гиперэкспрессии этого белка и, следовательно, возможного влияния MDM2 на изменение чувствительности к индукции р53-зависимого апоптоза.

ВЫВОДЫ

Таким образом, в результате проведенных исследований вывлены следуюшие типы клеточного ответа на действие ИИ:

1. Адекватный характер клеточного ответа, выявленный у большинства обследованных больных (75,6%). Характеризуется нарастающей с течением времени гибелью облученных клеток, индукцией в них экспрессии белков р53 и р21, повышением базального уровня белка MDM2.

2. Атипичный характер ответа, связанный скорее всего с мутациями р53 (с или без делеции второй аллели); характеризуется отсутствием достоверной разницы в количестве погибших клеток в контрольных и облученных культурах, высоким базальным уровнем р53, отсутствием индукции р21. Выявлен у 4 больных (8,9%).

3. Атипичный характер ответа, вероятнее всего связанный с делециями гена р53 (делеции 17р) с инактивацией второй аллели: резистентность к индукции ИИ-опосредованного апоптоза, отсутствие экспрессии р53 и р21 в контроле и после облучения. Выявлен у 2 больных (4,4%).

4. Атипичный характер ответа, возможно связанный с нарушениями гена АТМ: отсутствие достоверной разницы в количестве погибших клеток в контрольных и облученных культурах, слабая индукция р53, р21 или ее отсутствие под влиянием облучения. Выявлен у 5 больных (11,1%).

Полученные данные свидетельствуют, что в группе больных ХЛЛ, нуждающихся в проведении стационарного лечения, достаточно часто, примерно в 25% случаев, отмечают различные аномалии в системе индукции р53-зависимого апоптоза. Учитывая тот факт, что многие химиотерапевтические средства, применяемые для лечения ХЛЛ, в том числе и флударабин, вызывают именно р53-зависимый апоптоз [24], можно предположить у таких больных отсутствие позитивного ответа (или недостаточно эффективный устойчивый ответ) на проводимую терапию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Zakian VA. AM-related genes: whay do they tell us about functions of the human gene? Cell 1995; 82: 685–7.

2. Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, et al. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer

   es 1991; 51: 6301–11.

3. Fritsche M, Haessler C, Brandner G. Induction of nuclear accumulation of the tumour suppressor protein p53 by DNA- damaging agents. Oncogene 1993; 8: 307–18.

4. El-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumour suppression. Cell 1993; 75: 817–25.

5. Miyashita T, Reed J. umour suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 1995; 80: 293–9.

6. Miyashita T, Harigai M, Hanada M, Reed JC. Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene. Cancer es 1994; 54: 3131–5.

7. Carbone R, Pearson M, Minucci S, Pelicci RG. PML NBs associate with the hMre11 complex and p53 at sites of irradiation induced DNA damage. Oncogene 2002; 21: 1633–40.

8. Lane DP. p53 and human cancers. Brit Med Bull 1994; 50: 582–99.

9. Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF, et al. Chromosome anomalies detected by interphase fluorescence in situ hybridization: correlation with significant biological features of B-cell chronic lymphocytic leuaemia. Brit J Haematol 2003; 121: 287–95.

10. Dohner H, Stilgenbauer S, James MR, et al. 11q deletions identify a new subset of B-cell chronic lymphocytic leuemia characterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis. Blood 1997; 89: 2516–22.

11. Prives C. Signaling to p53: breaing the MDM2-p533 circuit. Cell 1998; 98: 5–8.

12. Pettitt ER, Sherrington PD, Stewart G, et al. p53 dysfunction in B-cell chronic lymphocytic leuemia: inactivation of AM as an alternative to P53 mutation. Blood 2001; 98: 814–22.

13. Rai KR, Sawitzky A, Cronkite EP, et al. Clinical staging of chronic lymphocytic leuemia. Blood 1975; 46: 219–24.

14. Binet JL, Auguier A, Dighiero G, et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leuemia derived from a multivariante survival analysis. Cancer 1981; 48: 198–205.

15. International Worshop on Chronic Lymphocytic Leuemia. Chronic lymphocytic leuemia: recommendations for diagnosis, staging, and response criteria. Ann Intern Med 1989; 110: 236–8.

16. Work TS, Work E. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Vol 1, part 1. North Holland Publishing Co, 1969: 320 p.

17. Reed JC. Molecular biology of chronic lymphocytic leuemia. Semin Oncol 1998; 25: 11–8.

18. Dulic V, Lees E, Reed SI. Association of human cyclin E with periodic G1-S phase protein inase. Science 1992; 257: 1958–61.

19. Stankovic T, Stewart GS, Fegan Ch, et al. Ataxia telangiectasia mutated-deficient B-cell chronic lymphocytic leuemia occurs in pregerminal center cells and results in defective damage response and unrepaired chromosome damage. Blood 2002; 99: 300–9.

20. Prives C. How loops, β sheets, and α helices help us to understand p53. Cell 1994; 78: 543–6.

21. Starostik P, Manshouri T, O’Brien S, et al. Deficiency of the AM protein expression defines an aggressive subgroup of B-cell chronic lymphocytic leuemia. Cancer es 1998; 58: 4552–7.

22. Stankovic T, Weber P, Stewart G, et al. Inactivation of ataxia telangiectasia mutated gene in B-cell chronic lymphocytic leuaemia. Lancet 1999; 353: 26–9.

23. Schaffner C, Stilgenbauer S, Rappold GA, et al. Somatic AM mutations indicate a pathogenic role of AM in B-cell chronic lymphocytic leuemia. Blood 1999; 94: 748–53.

24. Rosenwald A, Chuang E, Davis R, et al. Fludarabine treatment of patients with chronic lymphocytic leuemia induces a p53-dependent gene expression response. Blood 2004; 104: 1428–34.