ПОЛИМОРФИЗМ RS6449182 ГЕНА CD38 И РИСК РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА

ВВЕДЕНИЕ

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) — одно из наиболее часто встречающихся онкогематологических заболеваний взрослого населения США и стран Европы, включая Украину. Случаи семейного ХЛЛ свидетельствуют о наличии определенной генетической предрасположенности к его развитию, однако до сих пор точные гены-мишени не идентифицированы [1]. Недавние исследования выявили ассоциацию риска заболевания ХЛЛ с наличием полиморфизма 10 генов; функции некоторых из них еще не известны [2].

В патогенезе ХЛЛ важная роль принадлежит молекуле поверхностных мембран лейкемических клеток — антигену CD38. Лигандом CD38 является молекула адгезии CD31/PECAM-1, присутствующая на эндотелии и некоторых типах стромальных клеток. Как результат взаимодействия CD38 с лигандом, на мембране лейкемических лимфоидных клеток индуцируется экспрессия антигена CD100, что способствует повышению их пролиферативной активности и, соответственно, экспанции лейкемического клона [3]. Кроме функции рецептора, молекула CD38 обладает также активностью фермента в реакциях образования аденозинтрифосфат рибозы (ADPR) и циклической аденозинтрифосфат рибозы (сADPR) из никотин-аденин-динуклеотида, а также фосфат-никотин-аденин-динуклеотидной кислоты из никотинаденин-динуклеотида. сADPR — универсальный вторичный мессенджер при передачи внутриклеточного сигнала, способный контролировать уровень кальция в клетке независимо от инозитолтрифосфата и участвующий в процессах пролиферации клеток [4]. Ген CD38 располагается в области короткого пле-

ча 4-й хромосомы (4р15), состоит из 8 экзонов, од-

нако более 98% нуклеотидных последовательностей представлено интронами [5]. Описаны 53 варианта полиморфизма гена CD38, обусловленных заменой одного нуклеотида (SNPs) [6]. Наиболее известным является SNP rs6449182 (184C > G, CD38 PvuII полиморфизм), локализованный в области 5` конца 1-го интрона в регуляторном участке, в непосредственной близости от CpG сайта функционального элемента, отвечающего за повышение экспрессии гена под влиянием ретиноевой кислоты. Кроме того, в составе данного участка гена находится так называемый Е-бокс, с которым в В-лимфоцитах связывается фактор транскрипции Е2А. Индукторами Е2А являются ИЛ-2 и лиганды Toll-like рецептора-9 (TLR-9) (неметилированные CpG олигодезоксинуклеотидные последовательности бактерий). Установлено, что в присутствии G-аллели интенсивность связывания Е2А выше, что приводит к более высокому уровню экспрессии антигена CD38 и свидетельствует о функциональном значении rs6449182 полиморфизма [7]. Ряд исследований свидетельствует о неблагоприятном течении ХЛЛ у носителей G-аллели гена CD38, что проявляется на момент установления диагноза как более поздняя стадия заболевания, более частое наличие гиперпластического синдрома, более высокий уровень лактатдегидрогеназы (непрямые показатели пролиферативной активности лейкемических клеток и массы опухоли), повышенный риск трансформации Рихтера [4, 8].

Вопрос о том, является ли носительство G-аллели гена CD38 фактором, предрасполагающим к развитию ХЛЛ, остается открытым. В исследованиях итальянских авторов распределение генотипов гена CD38 по полиморфизму rs6449182 среди больных

ХЛЛ не отличалось от контрольной группы [8], тогда как польские исследователи выявили уменьшение числа лиц с генотипом СС среди больных ХЛЛ и, соответственно, повышение риска развития заболевания у носителей полиморфной аллели: относительный риск (OR) становить 3,57 (95% доверительный интервал (ДИ) 2,4–5,3) [9]. Подобные исследования в нашей стране не проводились. В этой связи нами предпринята попытка проанализировать распределение генотипов гена CD38 среди больных ХЛЛ жителей Украины с целью оценки риска развития этого заболевания в зависимости от полиморфизма rs6449182 гена CD38.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 249 больных ХЛЛ В-клеточной природы (168 (67,5%) мужчин и 81 (32,5%) женщину, средний возраст которых — 57,47 ± 0,61 года), находившихся на лечении в отделении гематологии Института клинической радиологии ГУ «Научный центр радиационной медицины Национальной Академии медицинских наук Украины» («НЦРМ НАМН Украины») и Полтавской областной клинической больницы. Диагноз устанавливали на основании клинико-гематологических данных и иммунофенотипирования (в лаборатории иммуноцитологии Института клинической радиологии ГУ «НЦРМ НАМН Украины» под руководством доктора медицинских наук, профессора Д.А. Базыки) лимфоцитов периферической крови. Стадию заболевания определяли согласно классификаций K.R. Rai и соавторов [10] и J.L. Binet и соавторов [11]. По классификации Binet 76 больных (30,5%) на момент проведения исследования находились на стадии А, 106 (42,2%) — на стадии В, 68 (27,3%) — на стадии С. По классификации Rai распределение пациентов было следующим: 0 стадия — 15 больных (6,0%), І стадия — 57 (22,9%), ІІ стадия — 108 (43,3%), ІІІ ста-

дия — 31 (12,4%) и IV стадия — 38 (14,3%). Мутацион-

ный статус генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGHV) был определен у 237 больных: в 164 (69,2%) случаях лейкемические клетки имели немутированные (UM), в 73 (30,8%) — мутированные (М) IGHV-гены. Определение проводили, как описано ранее [12].

В контрольную группу входило 238 человек, жителей города Киева и Киевской области без наличия онкологических и онкогематологических заболеваний: 163 (68,5%) мужчин и 75 (31,5%) женщин, средний возраст которых — 62,28 ± 0,67 года. Контрольная группа и группа больных ХЛЛ совпадали по полу обследованных (р = 0,438) и находились в одной возрастной категории.

Определение полиморфизма rs6449182 гена CD38 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей рестрикцией полученных продуктов согласно E. Ferrero и соавторов [5] (рис. 1). Полученную частоту полиморфизмов анализировали на соответствие уравнению Харди — Вайнберга. Различия в наблюдаемых и ожидаемых частотах генотипов считали значимыми при условии значения критерия χ2 > 3,85. Статистическую обработку данных проводили в программе SPSS 13.0 software package (SPSS, США).

Рис. 1. Результаты определения полиморфизма rs6449182 гена CD38 методом ПЦР с последующей рестрикцией полученных продуктов рестриктазой PvuII (CAG↓CTG). В отсутствие полиморфизма (генотип СС) образуется 2 полосы рестриктированного продукта реакции (63 и 65 п.о.). При наличии полиморфизма (генотип GG) рестрикция продукта не происходит (128 п.о.). Гетерозиготный вариант (генотип СG) проявляется наличием трех полос (128, 65 и 63 п.о.)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Распределение генотипов rs6449182 гена CD38 в контрольной группе соответствовало уравнению Харди — Вайнберга, не различалось в зависимости от пола обследованных и места их постоянного проживания. В то же время в группе больных ХЛЛ полученные частоты отдельных генотипов значительно отличались от ожидаемых за счет снижения числа гетерозигот и повышения числа гомозигот полиморфной аллели гена (табл. 1, 2). При этом частота носителей полиморфной аллели была одинаковой в обоих группах (р = 0,342).

Таблица 1 Распределение генотипов rs6449182 гена CD38, частота полиморфной аллели и соответствие уравнению Харди — Вайнберга

(показатель χ2) в сравнении с данными литературы

Среди больных ХЛЛ распределение генотипов не зависело от пола пациентов, стадии заболевания при установлении диагноза, однако существенно различалось в зависимости от места проживания пациентов (см. табл. 2).

Таблица 2 Распределение генотипов rs6449182 гена CD38 в контрольной

группе и среди больных ХЛЛ в зависимости от пола, места проживания, стадии заболевания и мутационного статуса IGHV– генов (для больных ХЛЛ)

Среди больных ХЛЛ жителей Киева и других городов распределение генотипов rs6449182 гена CD38 соответствовало распределению Харди — Вайнберга (χ2 = 3,09) и приближалось к показателям в контрольной группе (р = 0,141), тогда как среди жителей сельской местности соответствия с уравнением Харди — Вайнберга не было найдено (χ2 = 21,99), распределение отличалось от такового в контроле (р = 0,000007), а также у больных ХЛЛ городских жителей. Основное различие между подгруппами больных ХЛЛ в зависимости от места проживания заключалось в частоте встречаемости генотипа GG. При этом различий по возрасту, полу, стадии заболевания между больными ХЛЛ городскими жителями и жителями сельской местности не было (табл. 3).

Таблица 3 Сравнительная характеристика больных ХЛЛ в зависимости

от места постоянного проживания

Это свидетельствует о том, что повышение числа гомозигот GG среди больных ХЛЛ жителей сельской местности не обусловлено селекцией пациентов. Соответственно, риск развития ХЛЛ у жителей сельской местности, гомозигот полиморфной аллели

гена CD38 по сравнению с контрольной группой был повышен: OR = 4,80 (95% ДИ 2,36–9,78, р = 0,0001).

Как видно из данных табл. 2, выявлена ассоциация распределения исследованных генотипов с мутационным статусом IGHV-генов, однако различия в частоте гомозигот GG среди больных ХЛЛ жителей города и сельской местности не обусловлены этим фактом, поскольку по мутационному статусу IGHV– генов в лейкемических клетках подгруппы больных совпадали (см. табл. 3). Кроме того, повышение числа гомозигот GG наблюдалось среди больных ХЛЛ жителей сельской местности как при М, так и UM статусе IGHV-генов (рис. 2).

Рис. 2. Частота генотипа GG среди пациентов с М и UM IGHV-генами в лейкемических клетках в зависимости от места их постоянного проживания

Анализ результатов других исследователей по обследованию лиц контрольных групп показал значительные различия в частоте отдельных генотипов между группами; наибольшее соответствие выявлено между группой, обследованной нами, и испанской популяцией (р = 0,904). При сравнении результатов, полученных нами при исследовании группы больных ХЛЛ, с данными литературы показано, что распределение генотипов гена CD38 среди больных ХЛЛ городских жителей приближалось к показателям в группе больных ХЛЛ жителей Италии (р = 0,052).

Эпидемиологические исследования свидетельствуют, что лица, занимающиеся профессиональной деятельностью в области сельского хозяйства и животноводства, имеют повышенный риск развития ХЛЛ [15]. К примеру, повышенный риск развития ХЛЛ и неходжкинских злокачественных лимфом низкой степени злокачественности у фермеров (OR = 1,79, 95% ДИ 1,22–2,63) обнаружен в исследовании D. Amadori и соавторов [16], что авторы связывают с испольванием химических веществ для обработки растений и животных и/или влиянием трансмиссивных заболеваний животных. В исследовании D.С. Chiu и соавторов [17] повышение риска развития ХЛЛ/лимфом из малых лимфоцитов найдено у лиц, использовавших пестициды, особенно если они имели близких родственников, заболевших злокачественными заболеваниями системы крови, что предполагает наличие определенной генетической предрасположенности. В этой связи нами сделано предположение, что, возможно, гомозиготы полиморфной аллели rs6449182 гена CD38

имеют повышенный риск развития ХЛЛ в условиях контакта с негативными факторами сельскохозяйственного производства. Данное предположение носит предварительный характер и нуждается в подтверждении глубоким эпидемиологическим исследованием, предполагающим учет и анализ комплекса негативных факторов окружающей среды, воздействующих на организм. В то же время данных, свидетельствующих об ассоциации полиморфизма rs6449182 гена CD38 и риска развития ХЛЛ у городских жителей, нами не обнаружено.

ЛИТЕРАТУРА

1. Goldin LR, Landgren O, Marti GE, Caporaso NE. Familial Aspects of Chronic Lymphocytic Leukemia, Monoclonal B-Cell Lymphocytosis (MBL), and Related Lymphomas. European J Clin Med Oncol 2010; 2 (1): 119–26.

2. Crowther-Swanepoel D, Broderick P, Di Bernardo MC, et al. Common variants at 2q37.3, 8q24.21, 15q21.3 and 16q24.1 influ- ence chronic lymphocytic leukemia risk. Nature Genetics 2010; 42 (2): 132–59.

3. Deaglio S, Vaisitti T, Bergui L, et al. CD38 and CD100 lead a network of surface receptors relaying positive signals for B-CLL growth and survival. Blood 2005; 105 (8): 3042–50.

4. Malavasi F, Deaglio S, Damle R, et al. CD38 and chronic lymphocytic leukemia: a decade later. Blood 2011; 118 (13): 3470–8.

5. Ferrero E, Saccucci F, Malavasi F. The human CD38 gene: polymorphism, CpG island, and linkage to the CD157 (BST-1) gene. Immunogenetics 1999; 49 (4): 597–604.

6. Hartman WR, Pelleymounter LL, Moon I, et al. CD38 ex- pression, function, and gene resequencing in a human lympho- blastoid cell line-based model system. Leuk Lymphoma 2010; 51 (7): 1315–25.

7. Saborit-Villarroya I, Vaisitti T, Rossi D, et al. E2A is a tran- scriptional regulator of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2011; 25 (3): 479–88.

8. Aydin S, Rossi D, Bergui L, et al. CD38 gene polymorphism and chronic lymphocytic leukemia: a role in transformation to Richter syndrome? Blood 2008; 111 (12): 5646–53.

9. Jamroziak K, Szemraj Z, Grzybowska-Izydorczyk O, et al.

1. Gonzalez-Escribano MF, Aguilar F, Torres D, et al. CD38 polymorphisms in Spanish patients with systemic lupus erythema- tosus. Hum Immunol 2004; 65 (5): 660–4.

2. Drummond FJ, Mackrill JJ, O’sullivan K, et al. CD38 is associated with premenopausal and postmenopausal bone min- eral density and postmenopausal bone loss. J Bone Miner Metab 2006; 24 (1): 28–35.

3. Linet MS, Devesa SS, Morgan GJ. The leukemias. In: Schot- tenfeld D, Fraumeni JF Jr, eds. Cancer Epidemiology and Preven- tion (3rd ed). New York: Oxford University Press, 2006: 841–71.

4. Amadori D, Nanni O, Falcini F, et al. Chronic lymphocyt- ic leukaemias and non-Hodgkin’s lymphomas by histological type in farming-animal breeding workers: a population case-control study based on job titles. Occup Environ Med 1995; 52 (6): 374–9.

5. Chiu DC, Weisenburger DD, Zahm SH, et al. Agricultur- al pesticide use, familial cancer, and risk of non-Hodgkin lym- phoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13 (4): 525–31.