КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ ИММУННОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ КОЖИ

Ильченко Ю.М., Коровин С.И., Кукушкина М.Н., Кукушкина С.Н., Лён А.Д.

В исследование включено 115 больных меланомой кожи (МК) I– IV стадии с локализацией первичной опухоли на туловище и конечностях.


ВВЕДЕНИЕ

Особенности клинического течения меланомы кожи (МК), а также многочисленные факты выявления у пациентов опухолеспецифических иммунных реакций клеточного и гуморального типов [15, 18] свидетельствуют о важной роли иммунной системы как в патогенезе заболевания, так и эффектах биотерапии. Вместе с тем для больных МК до настоящего времени не определены клинически значимые иммунологические параметры, на основании которых можно было бы судить о характере течения заболевания и прогнозировать риск его прогрессирования. В частности, имеют довольно противоречивый характер данные о содержании основных популяций лимфоцитов (Лф) в периферической крови, хотя большинство результатов указывает на уменьшение их количества при генерализации опухолевого процесса. Нет единого мнения относительно экспрессии активационных маркеров на Лф. По данным одних авторов [6, 13, 16], доля Лф, экспрессирующих активационные антигены (ААг), увеличивается, авторы других исследований не отмечали подобных изменений или выявляли их лишь для некоторых маркеров [1, 2]. Результаты изучения содержания естественных регуляторных Т-клеток (Трег) у больных МК также носят противоречивый характер. Увеличение относительного и абсолютно-

го количества Трег в периферической крови больных МК обнаружено в исследовании [11], в то время как согласно данным сообщения [20] эти показатели не отличаются от таковых у практически здоровых людей (ПЗЛ).

В связи с вышеизложенным целью нашего исследования было изучение функциональной активности и особенностей активационного фенотипа Лф периферической крови (ЛПК) у больных МК на разных стадиях заболевания.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 115 больных с гистологически подтвержденным диагнозом МК I–IV стадии с локализацией первичной опухоли на туловище и конечностях. Все больные подписали информированное согласие на участие в исследовании. Диагноз первично-локализованной МК (I–II стадия) верифицирован у 61 больного (39 женщин и 22 мужчины в возрасте 25–75 лет, средний возраст — 53,4 года), МК с метастазами в регионарных лимфатических узлах (ЛУ) (III стадия) — у 34 (17 женщин и 17 мужчин в возрасте 24–77 лет, средний возраст — 52,7 года), генерализованная форма (IV стадия) — у 20 (14 женщин и 6 мужчин в возрасте 20–72 лет, средний возраст — 51,6 года). Больные первично-локализованной МК были разделены на две подгруппы

на основании патогистологической верификации поверхностного изъязвления опухоли. Первую подгруппу (без изъязвления) составили 36 больных (23 женщины и 13 мужчин, средний возраст — 52,0 года), вторую (с изъязвлением) — 25 (16 женщин и 9 мужчин, средний возраст — 55,9 года). В группу больных с метастатическим поражением регионарных ЛУ были включены пациенты, ранее не лечившиеся по поводу МК, и пациенты, у которых поражение регионар-

зультаты представляли в виде среднего арифметического значения (М) и его стандартной ошибки (m). Различия оценивали как достоверные при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ активационного фенотипа ЛПК у больных МК выявил повышенную экспрессию ААг на всех стадиях опухолевого процесса (рис. 1).

image

70

ного лимфатического коллектора произошло спустя 12 мес и более после удаления первичной опухоли. Критерием включения в группу больных с IV стадией МК было отсутствие химиотерапии в анамнезе.

Клинико-иммунологическое обследование больных проводили перед началом основного лечения. В качестве контрольной группы было обследовано 60 ПЗЛ того же возраста.

Изучение активационного фенотипа ЛПК проводили методом проточной цитофлуориметрии [8] с использованием МкАТ к HLA-DR и CD95, меченных флуоресцеинизотиоцианатом («Сорбент», Россия), к CD25, меченных фикоэритринцианином-5, к CD127 и CD69, меченных фикоэритрином («Beckman Coulter», США). Трег определяли среди CD4+-Лф по наличию высокой экспрессии CD25 в комбинации с низкой или отрицательной экспрессией CD127 (CD4+25high127low-neg) [17].

Оценку спонтанного апоптоза ЛПК проводили методом проточной цитофлуориметрии [8] с использованием пропидия йодида.

Функциональную активность ЛПК изучали в реакции бласттрансформации Лф (РБТЛ) и цитотоксическом тесте. РБТЛ выполняли морфологическим методом с использованием МкАТ к CD3 (анти-CD3,

«Медбиоспектр», Россия) в концентрации 3 мкг/мл и фитогемагглютинина (ФГА, «Sigma», Германия) в концентрациях 10 и 20 мкг/мл (соответственно субагглютинирующая и агглютинирующая дозы, предварительно подобранных в тесте гемагглютинации [5]). Результаты выражали в процентах бласттрансформированных клеток (% БТ).

Цитотоксическую активность ЛПК определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием клеток-мишеней линии К-562 [8]. Результаты выражали цитотоксическим индексом (ЦИ) в процентах:

ЦИ = (А-В/С-В)×100%, где

А — количество мертвых клеток-мишеней в опыте; В — количество мертвых клеток-мишеней в контроле; С — общее количество клеток-мишеней.

Учет результатов определения цитотоксической активности, спонтанного апоптоза и фенотипирования ЛПК проводили на проточном цитофлуориметре FACScan («Becton Dickinson», США) с использованием программы «Cell Quest».

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Excel (MS Office 2003, XP) и STATІSTІCA 6,0 (StatSoft Inc., США). Для определения достоверности различий (р) показателей в группах использовали критерий Манна — Уитни. Ре-

CD95+ CD69+ HLA-DR+ CD25+

Рис. 1. Cодержание активированных Лф (%) в крови больных МК

Примечание: различия при сравнении с показателем у ПЗЛ статистически достоверны (р<0,05); * различия при сравнении с показателем у больных меланомой І–ІІ стадии статистически достоверны (р<0,05).

Как видно, уже на ранних стадиях заболевания регистрируется существенное увеличение относительного количества клеток, экспрессирующих как ранние (CD25, CD69), так и поздние (CD95, HLA-DR) маркеры активации. Наряду с усилением экспрессии CD25- и HLA-DR-антигенов, свидетельствующих в пользу реализации иммунной системой эффекторных функций [10], наблюдается повышение количества циркулирующих CD95+-Лф, готовых к апоптозу. Такая тенденция характерна для всех стадий опухолевого процесса. Однако, если у больных первичнолокализованной МК с гистологически верифицированным изъязвлением опухоли регистрируется повышенное содержание CD95+-Лф (59,9±1,7 против 52,3±1,7% у ПЗЛ, р<0,05), то у больных МК без изъязвления содержание этих клеток не отличается от нормального (соответственно 55,3±1,4 и 52,3±1,7%, р>0,05). Эти данные позволяют предположить наличие элиминации на периферии аутореактивных клонов Т-Лф, распознающих линейноспецифические антигены МК. Об этом косвенно свидетельствует факт, что в отличие от СD95+-Лф содержание CD25+-, CD69+-, HLA-DR+-ЛПК в обеих подгруппах больных первично-локализованной МК было практически одинаковым.

Распространение опухолевого процесса на регио-

нарный лимфатический коллектор и за его пределы приводит к усилению вышеописанных явлений. Так, относительное количество HLA-DR+-Лф у больных с регионарными метастазами достоверно выше, чем

у больных первично-локализованной МК. Содержание CD25+-, HLA-DR+-, CD69+, CD95+-Лф у боль-

ных генерализованной МК повышено не только по сравнению с показателями у ПЗЛ, но и больных первично-локализованной МК. В плане обсуждения полученных данных можно отметить, что аналогичные изменения активационного фенотипа Лф были описаны ранее [6]. Авторы цитируемой работы обратили внимание на более выраженный активационный фенотип (HLA-DR, CD95, CD25, CD71) ЛПК у боль-

ных МК по сравнению с таким Лф больных с другими солидными злокачественными новообразованиями. Следствием антигенспецифической активации

Т-Лф является экспрессия рецептора к α-цепи ИЛ-2 (CD25). С целью уточнения субпопуляционного состава Т-Лф, реагирующих таким образом на активный рост МК, было изучено содержание CD4+25+– и CD8+25+-клеток среди ЛПК больных на разных стадиях заболевания. Существенное увеличение количества CD4+25+-Лф в циркуляции регистрируется у больных первично-локализованной МК (20,1±0,8 против 14,8±0,6% у ПЗЛ, р<0,05). Прогрессирование опухолевого процесса ассоциируется со стабильно большим количеством CD4+25+-Лф в циркуляции, содержание которых при генерализованной форме превышает аналогичный показатель у больных первично-локализованной МК (соответственно 23,6±1,3 и 20,1±0,8%, р<0,05). Напротив, относительное количество CD8+25+-Лф у больных МК не отличается от значений нормы вне зависимости от стадии заболевания (при І–ІІ стадии — 2,0±0,3%, при ІІІ — 1,8±0,2%, при IV — 2,4±0,6% против 2,1±0,2% у ПЗЛ, р>0,05).

Следовательно, в процессе роста и метастазирова-

ния МК в периферической крови больных возрастает доля активированных Т-хелперов (CD4+25+), что может ассоциироваться с иммуносупрессией, механизмы которой направлены на подавление противоопухолевого иммунного ответа, обусловленного, в частности, Трег [21]. Поэтому представляет интерес изучение содержания этих клеток в периферической крови больных на разных стадиях заболевания (рис. 2).

image

5

Как видно, повышение уровня Трег происходит уже на ранних стадиях заболевания, при І–ІІ стадии (3,3±0,2 против 2,8±0,1% у ПЗЛ, р<0,05). У больных с метастатическим поражением регионарных ЛУ и больных с генерализованной МК содержание этих клеток в периферической крови стабильно высокое (соответственно 4,1±0,3 и 4,0±0,2%), достоверно превышающее уровень не только у ПЗЛ, но и у больных с первично-локализованной МК (р<0,05). Важно отметить, что повышение содержания Трег в циркуляции происходит по мере приобретения Лф активационного фенотипа.

Увеличение плотности поверхностных рецепторов к ИЛ-2 (CD25) предполагает, в свою очередь, повышение интенсивности пролиферативного ответа Т-Лф на действие этого цитокина. Однако имеются данные, что у больных МК такой ответ снижен вследствие нарушения фосфорилирования белков, STAT, обеспечивающих передачу активирующего транскрипцию генов-мишеней сигнала [14].

Поэтому нами был использован методический подход, позволивший оценить ответ Т-Лф при активации иных путей передачи сигнала — классического (через CD3-TCR-рецепторный комплекс) и альтернативного (митоген-индуцированного) (табл. 1).

Таблица 1 Пролиферативная активность (% БТ) ЛПК у больных МК

на разных стадиях заболевания

Показатели

Больные МК,

стадия заболевания

ПЗЛ

I–II

III

IV

% БТ (10 мкг/мл ФГА)

24,5±2,8

22,9±4,1

16,3±4,9

33,2±1,9

% БТ (20 мкг/мл ФГА)

60,0±3,1

55,4±5,3

33,6±5,8, *, **

63,5±1,8

% БТ (анти-CD3)

60,4±4,2

52,8±4,6

42,2±7,5 *

46,9±4,4

Примечание: — различия при сравнении с показателем у ПЗЛ статистически достоверны (р<0,05); * — различия при сравнении с показателем у больных с І–ІІ стадией меланомы статистически достоверны (р<0,05); ** — различия при сравнении с показателем у больных с ІІІ стадией меланомы статистически достоверны (р<0,05).

Как видно из представленных данных, пролиферативный ответ Т-Лф периферической крови больных МК I–II стадии при их активации по классическому пути, инициированному через CD3-TCR- рецепторный комплекс, существенно превышает такой у ПЗЛ. Метастазирование МК в регионарный лимфатический коллектор с последующей диссеминацией во внутренние органы нивелирует такой эффект, снижая ответ Т-Лф до уровня ПЗЛ. Отметим также, что у больных генерализованной формой МК% БТ существенно ниже, чем у больных первично-локализованной МК. Следовательно, хотя повышенный пролиферативный ответ Т-Лф, инициированный по классическому пути активации, характерен только для ранних стадий заболевания, при метастазах в регионарные ЛУ и генерализованной МК он регистрируется на уровне нормы. Последнее согласуется с данными исследования [14], свидетельствующими о сохранности функциональной активности Лф (по данным этого же теста) у больных МК ІІІ–IV стадии. Важно отметить, что в научной литературе есть данные о снижении пролиферативной активности ЛПК in vitro у больных с

генерализованной формой других солидных злокачественных новообразований [3, 4, 12].

Иные результаты были получены при изучении митоген-индуцированной пролиферации Лф, отражающей альтернативный путь активации Т-Лф (см. табл. 1). Как видно, вне зависимости от стадии МК ответ ЛПК на субагглютинирующую дозу ФГА (10 мкг/мл) достоверно снижен по сравнению с таким у ПЗЛ. Подобные данные были получены ранее [7]. Авторы упомянутой работы обнаружили наиболее выраженное снижение пролиферативного ответа ЛПК онкологических больных при индукции низкими концентрациями ФГА. В то же время использование агглютинирующей дозы ФГА (20 мкг/мл) выявило особенности пролиферативного ответа ЛПК больных МК в зависимости от стадии заболевания. Так, у больных с I–III стадией МК ответ ЛПК in vitro на эту дозу митогена не отличается от такого у ПЗЛ. У больных генерализованной МК показатель БТ снижен не только по сравнению с таким у ПЗЛ, но и у больных с I–III стадией заболевания. При детальном анализе пролиферативной активности ЛПК у больных первично-локализованной МК, проведенном с учетом гистологической верификации поверхностного изъязвления опухоли, оказалось, что характер митоген-индуцированной пролиферации в подгруппах больных не зависит от этого фактора, в то время как анти-

CD3-индуцированная пролиферация существенно отличается (табл. 2).

Таблица 2

Пролиферативная активность (% БТ) ЛПК у больных первично-локализованной МК

Показатели

Больные с гистологической

верификацией опухоли

ПЗЛ

Без

изъязвления

С

изъязвлением

% БТ (10 мкг/мл ФГА)

24,1±3,5

21,2±3,9

33,2±1,9

% БТ (20 мкг/мл ФГА)

60,4±4,4

56,7±4,4

63,5±1,8

% БТ (анти-CD3)

53,2±5,2

74,6±2,9, *

46,9±4,4

Примечание: — различия при сравнении с показателем у ПЗЛ статистически достоверны (р<0,05); * — различия при сравнении с показателем у больных меланомой без изъязвления первичной опухоли статистически достоверны (р<0,05).

Как видно, при поверхностном изъязвлении первичной опухоли наблюдали существенное повышение ответа циркулирующих Т-Лф при их активации по классическому пути, в отличие от Лф больных без поверхностного изъязвления МК. При этом уровень

но повышение интенсивности апоптоза циркулирующих Лф [16, 19]. В контексте описанных данных представилось важным изучить уровень спонтанного апоптоза ЛПК у больных МК в зависимости от тяжести течения опухолевого процесса.

У больных первично-локализованной МК уровень спонтанного апоптоза циркулирующих Лф не отличается от такого у ПЗЛ (соответственно 3,8±0,4 и 3,9±0,4%, р>0,05). Метастазирование МК в регионарный лимфатический коллектор и дальнейшая диссеминация во внутренние органы ассоциируются с усилением спонтанного апоптоза ЛПК (соответственно 6,7±1,2 и 7,1±1,3%), уровень которого превышает показатель не только у ПЗЛ, но и у больных с I–II стадией заболевания (р<0,05). Снижение пролиферативной активности циркулирующих Лф и усиление апоптоза на фоне метастазирования предшествует развитию иммуносупрессии, связанной с развитием лимфопении, о чем мы сообщали ранее [9]. В целом описанные выше изменения в иммунной системе больных МК отражают проявления поликлональной активации Т-Лф, лабораторными признаками которой на ранних стадиях заболевания являются повышенная экспрессия активационных маркеров и выраженный ответ на стимуляцию in vitro по классическому пути активации. К лабораторным признакам распространения опухолевого процесса на регионарный лимфатический коллектор и за его пределы можно отнести угнетение классического и альтернативного механизмов активации Т-Лф на фоне повышенной экспрессии активационных маркеров и усиление апоптоза циркулирующих Лф. Следует отметить, что если при первично-локализованной МК дисфункция иммунной системы носит активационный характер, то прогрессирование заболевания ассоциируется с иммунодефицитом, глубина которого обусловлена

тяжестью течения опухолевого процесса [9].

В подтверждение сказанного можно привести результаты изучения цитотоксической активности ЛПК в зависимости от стадии МК (рис. 3).

БТ Т-Лф больных первично-локализованной МК с изъязвлением существенно превышал такой у ПЗЛ. Таким образом, для ранних стадий МК характерным лабораторным признаком активного опухолевого роста является повышение ответа in vitro при активации Т-Лф по классическому пути. Для диссеминации опухолевого процесса характерно угнетение пролиферации Лф в ответ на активацию in vitro как по классическому, так и по альтернативному пути.

Известно, пролиферация Лф в ответ на активацию тесным образом связана с противоположным процессом — их гибелью. Известно также, что для больных со злокачественными новообразованиями характер-

Рис. 3. Цитотоксическая активность ЛПК больных МК на разных стадиях заболевания

Примечание: различия при сравнении с показателем у ПЗЛ статистически достоверны (р < 0,05).

Как видно, дисфункция иммунной системы формируется уже на ранних стадиях заболевания и проявляется тенденциейкснижению цитотоксичности Лфубольных первично-локализованной МК. Причем величина ЦИ у больных этой группы с изъязвленной МК значительно снижена по сравнению с показателем у ПЗЛ (соответственно 19,9±3,7 и 29,1±3,4%, р<0,05). Метастазирование МК в регионарные ЛУ и генерализация опухолевого процесса ассоциируются с выраженным снижением ЦИ Лф, что связано на поздних стадиях МК с уменьшением в периферической крови абсолютного количества цитотоксических клеток-эффекторов [9].

Подводя итог изложенному материалу, можно ут-

верждать, что эволюция иммунных нарушений при МК является отражением тяжести течения опухолевого процесса. Поликлональная активация Т-Лф на ранних стадиях заболевания, проявляющаяся повышенной экспрессией AAг, носит характер защитноприспособительной реакции, сменяющейся в процессе распространения МК в лимфоидную ткань и внутренние органы развитием механизмов, обусловливающих угнетение эффекторных функций клеточного звена иммунной системы.

ВЫВОДЫ

На основании анализа выявленных изменений параметров иммунной системы больных МК можно сформулировать клинико-лабораторные критерии, важные для диагностики иммунной дисфункции при этом заболевании.

  1. Для первично-локализованной МК характерны: выраженный активационный фенотип ЛПК, повышенный анти-CD3-индуцированный ответ Лф in vitro, низкие показатели митоген-индуцированной пролиферации Лф при ответе на субагглютинирующую дозу ФГА.

  2. При метастазировании МК в регионарный лимфатический коллектор — повышенное содержание Трег в циркуляции, низкие показатели пролиферативного ответа Лф на субагглютинирующую дозу ФГА, низкие показатели цитотоксической активности Лф in vitro.

  3. Для генерализованной MK — высокий уровень Трег, низкие показатели митоген-индуцированной пролиферации Лф при нормальных значениях их анти-CD3-индуцированного ответа, низкие показатели цитотоксической активности.

  4. Можно ожидать, что применение этих иммунологических критериев в комплексном обследовании больных МК позволит определять индивидуальные особенности течения опухолевого процесса, прогнозировать ответ организма на биотерапию и таким образом оптимизировать тактику лечения.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Абрамов МЕ, Гуторов СЛ, Славина ЕГ и др. Химиотерапия диссеминированной меланомы кожи с включением Ингарона. Клинико-иммунологические исследования. Рос биотер журн 2009; 8 (1): 64–74.

  2. Демидов ЛВ, Харкевич ГЮ, Тимофеев ИВ. Результаты иммунопрофилактики метастазов меланомы кожи рекомбинантным гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором после хирургического иссечения первичной опухоли: динамика иммунологических и гематологических показателей. Рос биотер журн 2002; 1 (4): 49–53.

  3. Курганова ЕВ, Тихонова МА, Егоров ДН и др. Регуляторные Т-лимфоциты у больных с новообразованиями желудочно-кишечного тракта. Сибирский онкологический журнал 2010; 2 (38): 35–41.

  4. Курганова ЕВ, Тихонова МА, Лебедева ВА и др. Характеристика регуляторных Т-клеток у больных раком яичников. Сибирский онкологический журнал 2008; 6 (30): 40–5.

  5. Луцик МД, Панасюк ЕН, Луцик АД. Лектины. Львов: Вища школа, 1981. 156 с.

  6. Олейник ЕК, Шибаев МИ, Олейник ВМ. Маркеры активации лимфоцитов крови (CD25, CD71, CD95, HLA-DR) у онкобольных. Гематология и трансфузиология 2006; 51 (1): 18–22.

  7. Олейник ЕК, Олейник ВМ, Назаров ПГ и др. Снижение индуцированной митогенами поликлональной активации лимфоцитов периферической крови как параметр иммуносупрессии при различных опухолях человека. Вопр онкологии 2007; 53 (1): 49–53.

  8. Пинегин БВ, Ярилин АА, Симонова АВ и др. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие для врачейлаборантов. Москва 2001. 55 с.

  9. Фільчаков ФВ, Кукушкіна СМ, Шуміліна КС та ін. Особливості імунного статусу у хворих на меланому шкіри на різних стадіях захворювання. Клин онкол 2011; 2 (2): 36–40.

  10. Хайдуков СВ, Зурочкин АВ. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. Челябинск, 2008. 195 с.

  11. Cesana G, DeRaffele G, Cohen S, et al. Characterization of CD4+CD25+ regulatory T-cells in patients treated with high-dose interleukin-2 for metastatic melanoma or renal cell carcinoma. J Clin Oncol 2006; 24 (7): 1169–77.

  12. Critchley-Thorne RJ, et al. Impaired interferon signaling is a common immune defect in human cancer. PNAS 2009; 106 (22): 9010–15.

  13. Dworacki G, et al. Decreased ζ chain expression and apop- tosis in CD3+ peripheral blood T lymphocytes of patients with me- lanoma. Clin Cancer Res 2001; 7: 947s–957s.

  14. Mortarini R, Vegetti C, Molla А, et al. Impaired STAT phos- phorylation in T-cells from melanoma patients in response to IL-2: association with clinical stage. Clin Cancer Res 2009; 15: 4085–94.

  15. Romero P, Cerottini JC, Speiser DE. The human T-cell re- sponse to melanoma antigens. Adv Immunol 2006; 92: 187–224.

  16. Saito T, Dworacki G, Gooding W, et al. Spontaneous apop- tosis of CD8+ T lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced melanoma. Clin Cancer Res 2000; 6: 1351–64.

  17. Seddiki N, Santner-Nanan B, Martison J, et al. Expres- sion of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates be- tween human regulatory and activated T cells. J Exp Med 2006; 203 (7): 1693–700.

  18. Stockert E, Jager E, Chen Y, et al. A survey of the humo- ral immune response of cancer patients to a panel of human tu- mor antigens. J Exp Med 1998; 187 (8): 1349–54.

  19. Takahashi А, Kono К, Amemiya Н, et al. Elevated Cas- pase-3 activity in peripheral blood T-cells coexists with increased degree of T-cell apoptosis and down-regulation of TCR zeta mo- lecules in patients with gastric cancer. Cancer Res 2001; 7: 74–80.

  20. Viguier M, Lemaître F, Verola О, et al. Foxp3 expressing CD4+CD25 high regulatory T-cells are overrepresented in human metastatic melanoma lymph nodes and inhibit the function of in- filtrating T-cells. J Immunol 2004; 173 (2): 1444–53.

  21. Wolf AM, Wolf D, Steurer M, et al. Increase of regulatory T-cell in the peripheral blood of cancer patients. Clin Cancer Res 2003; 9 (2): 606–12.


No comments » Add comment