Повышение экспрессии белка АDАМ8 в ткани рака поджелудочной железы человека: иммуногистохимическое исследование

ВВЕДЕНИЕ

Рак поджелудочной железы (РПЖ) занимает 4-е место среди причин смертности вследствие злокачественных новообразований с медианой продолжительности жизни около 6 мес и 5-летней выживаемостью в пределах 3–5% [1]. В Украине РПЖ как причина смертности вследствие злокачественных опухолей занимает 7-е место среди мужчин и 9-е — среди женщин [2]. Известно, что 85% всех опухолей поджелудочной железы составляют аденокарциномы. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАПЖ) является наиболее часто определяемой опухолью этого органа [3]. Неблагоприятный прогноз при ПАПЖ связан с ее способностью к быстрому метастазированию в лимфатические узлы и отдаленные органы, что очень часто отмечают к моменту постановки диагноза. Такое агрессивное поведение и резистентность к различным видам лечения, включая химиотерапию, облучение и иммунотерапию, является характерным признаком данной патологии. Проведено много исследований, цель которых — выяснение молекулярной природы агрессивности ПАПЖ, среди которых значительное место занимают работы по изучению механизмов раннего метастазирования этих новообразований [4].

В настоящее время исследователи обратили внимание на белки семейства АА (A Desintegrin And Metalloprotease domen), являющиеся семейством трансмембранных протеинов I типа, которые содержат металлопротеазу и дезинтегриновый домен

[5, 6]. У человека идентифицировано более 20 генов семейства АА, часть из которых экспрессируется преимущественно в клетках репродуктивных органов и играет важную роль в слиянии сперматозоида и яйцеклетки, а также в сперматогенезе, другие же выявляют в различных тканях организма [7]. Белки семейства АА участвуют как в протеолизе, так и в клеточной адгезии, что позволяет предположить их определенную роль в реконструировании внеклеточного матрикса и изменениях адгезивных свойств клетки, характерных для патологических процессов, в частности для малигнизации. Установлено, что белки АА влияют на клеточную миграцию и контролируют различные сигнальные пути, активирующиеся в опухолевых клетках [8].

АА8 является членом семейства белков АА, клонированным как 2 (156) из мышиных макрофагов и экспрессируемым в гранулоцитах и В-клетках, а также в нейронах, олигодендроцитах [7, 9]. Ген АА кодирует протеин, содержащий 824 аминокислоты с карбоксидным терминалом трансмембранного домена и внеклеточными доменами, участвующими в адгезии и протеолизе [10]. U. chlomann и соавторы предложили модель процессинга и функции АА8, согласно которой про-АА8 подвергается автокатализу в участке между продоменом и металлопротеазным доменом с последующим образованием двух форм, одна из которых образуется при удалении продомена и представляет «sheddase» (белок, участвующий в «сбрасывании» каких-либо молекул с поверхности клетки), другая же — это оста-

точный АА8, образующийся путем удаления металлопротеазного домена и опосредующий адгезию клеток. Обе формы АА8 распологаются на клеточной поверхности [11]. АА8 in vitro действует как активная металлопротеаза, гидролизуя основной белок миелина (BP), белок-предшественник β-амилоида, 23, интерлейкины и фактор некроза опухоли α [12–15]. Активность АА8 не подавляется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIPs), что отличает его от других протеолитических ферментов [16].

В ряде работ показано, что АА8 является потенциальным опухолевым маркером сыворотки при карциномах легкого и почки, а также демонстрирует корреляцию с прогрессированием процесса при раке легкого и предстательной железы, с меньшей выживаемостью при карциноме почки и с увеличением инвазивности опухолей головного мозга [17–20]. Только для трех членов семейства АА, а именно АА9, АА15 и АА17, установлено определенное участие в развитии РПЖ [21, 22]. Исходя из сказанного, цель исследования — выявление экспрессии белка АА8 в ткани ПАПЖ и оценка ее связи с некоторыми клиническими показателями течения опухолевого процесса.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Больные. Все образцы опухолевой ткани пациентов получены после их информирования об исследовании и получения согласия. Больные подвергались хирургическому вмешательству в отделении общей хирургии и трансплантологии университета Хайдельберга (Германия). Ткань нормальной поджелудочной железы (всего 8 проб) получили у здоровых доноров в соответствии с программой трансплантации органов. Всего было исследовано 99 пациентов с диагнозом ПАПЖ (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика больных с ПАПЖ

Иммуногистохимические методы. Экспрессию АА8 определяли иммуногистохимически в заключенных в парафин образцах ткани, фиксированных в 4% забуференном формалине. Гистологические срезы толщиной 3–5 мкм депарафинировали в ксилоле и обезвоживали в постепенно снижающихся концентрациях этанола. Затем срезы помещали в отмывочный буфер (10 n ТрисНI, 0,85% NaI, 0,1% раствор бычьего сывороточ-

ного альбумина (БСА), рН 7,4) с последующим иммуногистохимическим окрашиванием. После того как антиген (АГ) в срезах восстановили с помощью тепловой обработки в 10 n цитратном буфере в течение 10 мин в микроволновой печи, срезы инкубировали в 3% растворе пероксидазы в течение 10 мин, а затем, после промывания, в 3% растворе БСА в течение 1 ч для блокирования неспецифических мест связывания. Срезы нормальной ткани и ПАПЖ инкубировали с мышиным моноклональным антицитокератин-19 антителом (АТ-K19) (AKO ytomation, Germany), кроличьим поликлональным АТ к АА8 (hemicon Int., UA), примененными в концентрации 1 : 250, или с нормальным мышиным IgG или кроличьим IgG соответственно в качестве контроля при 4 ˚С в течение 18 ч. Затем срезы ополаскивали в промывочном буфере и инкубировали с HRP-меченными антимышиным или антикроличьим соответственно АТ («AKO

ytomation», Германия) в течение 45 мин при ком-

натной температуре. После того как срезы отмывали в буфере, каждый срез был обработан 100 μl

AB-хромогенной субстратной смесью(AKO) споследующей остановкой реакции в H2O и окрашиванием гематоксилином ayer’s. После того как срезы отмыли и обезвожили, их заключили в среду на основе ксилола (premount media). Оценку экспрессии АА8 осуществляли визуально два независимых исследователя. Окрашивание опухолевых кле-

ток каждого образца оценивали как отсутствующее,

слабое, среднее или сильное.

Выживаемость больных определяли методом Kaplan — eier, различия между кривыми выживаемости анализировали с помощью long-rank теста. Корреляционные связи оценивали коэффициентами Pearson [r] и pearman [rho] и критерием χ2. Различия между показателями оценивали тестом

ann — Whitney.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В нормальной ткани поджелудочной железы (n = 8), выявлено слабое окрашивание АА8 в цитоплазме и мембране клеток протоков и ацинусов, а также среднее в эндокринных клетках (тельца Лангерганса) (рис. 1а, б). В тех же самых срезах определена экспрессия СК19 как маркера клеток протоков поджелудочной железы (рис. 1а (верхняя вставка), г). Экспрессия АА8 оказалась слабой в строме, нервах и кровеносных сосудах нормальной ткани поджелудочной железы доноров. В ткани ПАПЖ (n = 99) выявлена интенсивность окрашивания АА8 от средней до сильной в цитоплазме и мембране опухолевых клеток в 79% случаев (рис. 1в, д, е).

Клетки протоков при ПАПЖ были также поло-

жительны по экспрессии СК19 в параллельных срезах (рис. 1г). Кроме того, экспрессию АА8 определяли в тубулярных комплексах в 36% случаях и в дегенеративных ацинарных клетках в 51% случае.

Рис. 1. Экспрессия и локализация АA8 в ткани нормальной поджелудочной железы и ПАПЖ: (а, б) АА8 экспрессировался в нормальных эндокринных клетках, ацинусах, а также клетках протоков (нижняя вставка (а)). Окрашивание соответствующих срезов на СК19 в качестве маркера протоковых клеток (верхняя вставка (а)). Отсутствие окрашивания в соответствующих срезах негативного контроля (верхняя вставка (б)). Окрашивание (в, г) АА8 (в) и СК19 (г) в опухолевых клетках ПАПЖ. Сильное окрашивание (д, е) АА8 в клетках ПАПЖ. Отсутствие окрашивания в соответствующих срезах как негативного контроля (верхняя вставка (д)). Увеличение на всех препаратах х 200

Слабое окрашивание АА8 отмечали и в нервах, расположенных в ткани поджелудочной железы. Реакция с нормальным мышиным IgG в соответствующих срезах показала негативное окрашивание (негативный контроль) (рис. 1а (нижняя вставка), б, д (верхняя вставка)).

Полуколичественный анализ интенсивности окрашивания АА8 в опухолевых клетках под-

Таблица 2

Экспрессия АА в ткани ПАПЖ человека

желудочной железы при ПАПЖ позволил установить следующее: отсутствие окраски — 0 случаев, слабое окрашивание — 21 случай (21,2), среднее — 46 (46,5) и сильное — 32 (32,3%) (табл. 2).

Не выявлено корреляции между уровнем экспрессии АА8 в опухолевой ткани и клинико-патологическими показателями, такими как стадия развития процесса и степень дифференцировки опухоли.

Отмечена тенденция к лучшей выживаемости больных, в опухолях которых определяли слабое и/или среднее окрашивание АА8. едиана продолжительности жизни таких больных составила 20 мес, тогда как пациентов, в опухолях которых выявлено сильное окрашивание АА8, — 14 мес (р = 0,065) (рис. 2).

Рис. 2. Кривые выживаемости пациентов с ПАПЖ (n = 99) (нижняя кривая — сильное окрашивание, верхняя кривая — слабое/среднее окрашивание) (р = 0,065). По оси абсцисс — продолжительность жизни (мес), по оси ординат — количество больных (%)

Ранее было показано, что белки семейства АА участвуют в реализации адгезивных и миграционных свойств клеток, столь важных в развитии целого ряда патологических процессов [8]. Известно, что и адгезия, и миграция могут оказывать существенное влияние на развитие опухоли, в частности модулируя способность клеток опухоли к метастазированию. Эти данные и сделанные на их основе предположения способствовали развитию исследований белков АА в связи с опухолевым ростом и привлекли к ним внимание как к возможным мишеням для противоопухолевой терапии.

Белок АА8, один из членов семейства АА, гиперэкспрессируется в ряде опухолей человека, в частности в опухолях легкого, почки [17, 18]. В ткани РПЖ также отмечали аномальную экспрессию членов семейства АА, таких как АА9, АА15 и АА17 [21, 22]. При этом высказано предположение, что гиперэкспрессия этих белков имеет отношение к инвазивности и агрессивности РПЖ [21–23].

В исследовании отметили значительное усиление экспрессии белка АА8 в ткани ПАПЖ по сравнению с нормальной тканью поджелудочной железы, что позволяет говорить о потенциальной роли АА8 в патогенезе и прогрессии рака поджелудочной железы. В ткани нормальной поджелудочной железы белок АА8 локализуется на мембране клеток протоков поджелудочной железы и в меньшей степени — клеток островков и ацинусов. В ткани ПАПЖ АА8 экспрессировался в умеренной и сильной степени в раковых клетках и клетках тубулярных комплексов. Установлено, что низкий уровень экспрессии белка АА8 коррели-

ровал с выживаемостью больных с ПАПЖ: определено, что выживаемость больных с низким уровнем экспрессии АА8 была значительно лучше, чем таковая у больных с высоким уровнем АА8. Это совпадает с результатами недавно опубликованных работ, в которых показано, что гиперэкспрессия АА8 ассоциируется с плохим прогнозом у больных со злокачествепнными опухолями легкого, головного мозга, предстательной железы и почки [17–20, 24]. Установлено также, что экспрессия АА8 является хорошим маркером прогнозирования развития отдаленных метастазов при карциноме почки [18].

ВЫВОДЫ

1. Установлена экспрессия белка АА8 в клетках протокового РПЖ, оцененная как «умеренная/ сильная» в 79% случаях.

2. Не выявлена корреляция уровня экспрессии АА8 с основными клиническими характеристиками опухолевого процесса. В то же время во всех наблюдаемых случаях в метастатических очагах в лимфатических узлах отмечена «умеренная/сильная» экспрессия АА8.

3 Определена обратная связь выживаемости больных и уровня экспрессии АА8 в клетках первичной опухоли, хотя корреляция оказалась статистически незначимой на данном этапе наблюдения за больными.

4. Точный механизм влияния белка АА8 на опухолевую прогрессию все еще не известен, но можно предположить, что повышение экспрессии и функциональной активности этого белка способствует усилению клеточной миграции, инвазивности и метастазированию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. ancer statistics, 2006.

   A ancer J lin 2006; 56: 106–30.

2. Шалимов СА, Осинский ДС, Черный ВА и др. Рак поджелудочной железы (современное состояние проблемы).

   онография. Киев: Основа 2007. 320 с.

3. Hezel AF, Kimmelman AC, Stanger BZ, et al. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes and

   ev 2006; 20: 1218–49.

4. Li D, Xie K, Wolff R, Abbruzzese JL. Pancreatic cancer. Lancet 2004; 363: 1049–57.

5. Wolfsberg TG, Primakoff P, Myles DC, White JM. AA, a novel family of membrane proteins containing A isintegrin And etalloprotease domain: multipotential functions in cell-cell and cell-matrix interaction. J ell Biol 1995; 131: 275–8.

6. Yamamoto S, Higuchi Y, Yoshiyama K, et al. AA family proteins in the immune system. Immunol Today 1999; 20: 278–84.

7. Richens J, Fairclough L, Ghaemmaghami AM, et al. The detection of AA8 proteins on cells of the human immune systems and the demonstration of its expression on peripheral blood B cells, dendritic cells and monocyte subsets. Immunobiology 2007; 212: 29–38.

8. Mochizuki S, Okava Y. AAs in cancer cell proliferation and progression. ancer ci 2007; 98: 621–8.

9. Kelly K, Hutchinson G, Nebenins-Oosthuizen D, et al.

   etalloprotease-isintegrin AA8: Expression Analysis and

   Targeted deletion in ice. evelopmental dynamics 2005; 232: 221–32.

10. Yoshiyama K, Higuchi Y, Kataoka M, et al. 156 (human AA8): expression, primary amino acid sequence, and gene location. Genomics 1997; 41: 56–62.

11. Schlomann U, Wildeboer D, Webster A, et al. The metalloprotease disintegrin AA8. Processing by autocatalysis is required for proteolytic activity and cell adhesion. J Biol hem 2002; 277: 48210–9.

12. Naus S, Reipschlager S, Wildeboer D, et al. Identification of candidate substrates for ectodomain shedding by the metalloprotease-disintegrin AA8. Biol hem 2006; 387: 337–46.

13. Fourie AM, Coles F, Moreno V, Karlsson L. atalytic activity of AA8, AA15, and -L (AA28) on synthetic peptide substrates and in ectodoman cleavage of 23. J Biol hem 2003; 278: 30469–77.

14. King NE, Zimmermann N, Pope SM, et al. Expression and regulation of a disintegrin and metalloproteinase (AA) 8 in experimental asthma. Am J Respir ell ol Biol 2004; 31: 257–65.

15. Schlomann U, Rathke-Hartlieb S, Yamamoto S, et al. Tumor necrosis factor alpha induces a metalloprotease- disintegrin, AA8 ( 156): implications for neuron-glia interactions during neurodegeneration. J Neurosci 2000; 20: 7964–71.

16. Amour A, Knight CG, English WR, et al. The enzymatic activity of AA8 and AA9 is not regulated by TIPs. FEB Lett 2002; 524: 154–8.

17. Ishikawa N, Daigo Y, Yasui W, et al. AA8 as a novel serological and histochemical marker for lung cancer. lin ancer Res 2004; 10: 8363–70.

18. Roemer A, Schwettmann L, Jung M, et al. The membrane proteases adams and hepsin are differentially expressed in renal cell carcinoma. Are they potential tumor markers? J Urol 2004; 172: 2162–6.

19. Fritzsche FR, Jung M, Xu C, et al. AA8 expression in prostate cancer is associated with parameters of unfavorable

1. Grutzmann R, Luttges J, Sipos B, et al. AA9 expression in pancreatic cancer is associated with tumor type and is a prognostic factor in ductal adenocarcinoma. Br J ancer 2004; 90: 1053–8.

2. Valkovskaya N, Kayed H, Felix K, et al. AA8 expression is associated with increased invasiveness and reduced patient survival in pancreatic cancer. J ellular ol ed 2007;

11 (5): 1162–74.

prognosis. Virchows Arch 2006; 449: 628–36.