ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В УТОЧНЕНИИ ГИСТОГЕНЕЗА РАКА ЛЕГКОГО

Многолетние статистические исследования свидетельствуют о том, что наиболее частое злокачественное новообразование у мужчин — рак легкого (РЛ) [14]. Более 55% больных погибают до года с дня установления диагноза [16]. Только ранняя диагностика РЛ позволяет улучшить прогноз [1, 9]. Одним из проблемных является вопрос гистогенеза РЛ. Его решение может способствовать возникновению новых подходов к профилактике, диагностике и лечению РЛ. До настоящего времени проблема гистогенеза РЛ остается открытой. Существует наиболее распространенная точка зрения о том, что РЛ развивается из слизистой оболочки бронхов, и поэтому его еще называют бронхогенным [11]. Высказывают мнение [9, 10, 13], что центральные формы РЛ развиваются в крупных бронхах вплоть до проксимальных отделов сегментарных. Полагают также, что периферический РЛ развивается из эпителия мелких бронхов (начиная с дистальных отделов сегментарных), бронхиол и, вероятно, альвеол; сделан вывод о едином гистогенезе различных типов РЛ из полии унипотентных клеток-предшественниц. Такими клетками могут быть: цилиндрическая секреторная клетка, ее аналог на периферии — клетка Клара или же базальная клетка. Параллельно проведенные рентгенологические, бронхоскопические и морфологические исследования позволили установить [3] в большинстве наблюдений перибронхиально растущий РЛ. Отмечены также интактные бронхи среди разрастаний бронхиолоальвеолярного рака [16]. Все сказанное свидетельствует о неоднозначности гистогенеза РЛ. В связи с этим мы предприняли попытку изучения гистогенеза РЛ как по данным литературы, так и по материалам собственных исследований.

Поиск литературы проводился по различным научным направлениям. Так, изучены труды об исследовании эпителиальных клеток легкого [6, 15], по которым можно проследить период обновления, митотической активности и других параметров эпителия легочной ткани в эксперименте. Авторы установили, что митотическая активность эпителия трахеи составляет 3,4 на тысячу клеток, в бронхах среднего калибра 1–1,5, в мелких бронхах — 0,5–1,5, а в клетках межальвеолярных перегородок — 8,25. Отмечено также, что на долю пневмоцитов ІІ типа приходится 50% всех митозов, то есть именно они обладают наиболее высокими потенциями к пролиферации, а значит, и возможностью безудержного роста с явлениями озлокачествления. Время обновления эпителия трахеи составляет 47,6 сут, в крупных бронхах — 18,1, в средних — 7–10, в мелких — 167–200, а в клетках межальвеолярных перегородок наиболее короткое время обновления клеток — 3–7 сут. Это означает, что альвеолярный эпителий (АЭ) наиболее подвержен пролиферации, размножению и опухолевой трансформации. Естественно, что полученные в эксперименте данные нельзя полностью переносить на человеческий организм, но предположить общность данной тенденции представляется возможным. Независимо от других авторов ультраструктурные исследования [8] подтверждают данные о наибольшей пролиферативной активности клеток АЭ и, в частности, пневмоцитов ІІ типа по сравнению с другими эпителиальными клетками легкого. Эти исследования также доказывают, что пневмоциты ІІ типа можно отнести к стволовым клеткам легкого, то есть к таким, из которых могут развиваться разные патологические разрастания, в том числе и злокачествен-

ные. Согласно классическим данным [7], все патологические процессы в легком начинаются из бронхиол и реакции выстилочного АЭ; это положение принято и международными экспертами. С другой стороны, показано [12], что бронхиальный эпителий (БЭ) является наиболее устойчивым к вредным воздействиям по сравнению с другими эпителиальными структурами легкого. Уместно вспомнить микрофотографии крупных монографий, многотомных руководств по патологической анатомии, где демонстрируется РЛ. На фотографиях, независимо от локализации опухоли, — в центральном или в периферическом отделе легкого, виден обширный перибронхиальный компонент опухоли и небольшой экзофит в бронхе. Наконец, экспериментальные данные известной школы Л.М. Шабада по канцерогенезу РЛ [4, 5, 17] подтверждают начало развития и дальнейшую малигнизацию эпителия в субплевральных зонах независимо от пути введения канцерогена — эндобронхиально, внутрибрюшинно или других. Эти работы также, независимо от приведенных, подтверждают развитие РЛ не из БЭ, а из субплевральных отделов, то есть из АЭ. Таким образом, все полученные результаты экспериментальных, патологоанатомических, гистологических и иммуногистохимических исследований (ИГХ) сводятся к тому, что АЭ, а именно пневмоциты ІІ типа, являются стволовыми клетками легкого, поэтому логично предположить начало развития РЛ именно из них. Для уточнения этого вопроса нами проведено настоящее исследование.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучен операционный материал 120 больных, которым выполнены лобэктомии, билобэктомии или пульмонэктомии по поводу РЛ ІІІ стадий в период 2006–2008 гг. Среди них — 49 больных с плоскоклеточным РЛ (ПРЛ), 66 — с железистым (ЖРЛ), 3 — с альвеолярноклеточным типом (АКРЛ) и 5 больных — с мелкоклеточной (недифференцированной) формой РЛ (МКРЛ). Наиболее часто отмечались пациенты в возрасте 50–70 лет. Мужчин было 79 (66%), женщин — 41 (34%). После классической проводки и окраски материала гематоксилином и эозином гистологические препараты тщательно изучали. При этом во всех препаратах и по всей площади срезов изучали особенности морфологической структуры РЛ. Особое внимание обращали на наличие роста опухоли в альвеолах, в которых идентифицируется рядность клеток и их наслоившийся рост от базальной мембраны к ее центру. Гистологический тип опухолей легкого оценивали по характерным структурным признакам с учетом новой Международной гистологической классификации [20]. Проведено также ИГХ-исследование опухолей с использованием МкАТ («ДАКО») к Ki67, PCNA, Bcl-2 и p53. При проведении ИГХ-реакций руководствовались инструкциями фирмы «ДАКО» и опытом других лабораторий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение макроскопических особенностей направленности роста и распространенности РЛ по отношению к стенке бронха, в том числе к его слизистой оболочке, позволило установить ряд закономерностей. Одной из главных, имеющих отношение к изучению гистогенеза РЛ, можно считать соотношение эндобронхиальной и перибронхиальной части опухоли. Преобладание перибронхиальной части опухоли замечено нами ранее [2]. Продолжение исследований в настоящее время позволило убедиться, что экзофитно растущая в просвет бронха часть РЛ составляет небольшую часть — от 1/4 до 1/40 всей опухоли, а остальная часть растет перибронхиально. Из 120 больных у 94 (78%) мы не смогли найти эндобронхиальное поражение слизистой оболочки бронха, то есть опухоль росла только перибронхиально.

Исследования гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, показали, что во всех препаратах есть участки, где виден рост раковых клеток от базальных мембран альвеол по направлению к их центру (рис. 1).

Рис. 1. Межальвеолярные перегородки. Рост ПРЛ от базальной мембраны. Гематоксилин, эозин; х200

Подтверждением того, что рост опухоли в легком начинается от базальной мембраны альвеолы, может быть исследование формы, размеров и тинкториальных свойств клеток опухоли и направленности роста. Отмечается закономерность построения рядов опухолевых клеток в альвеолах, которые растут от базальных мембран к центру альвеол, где выявляется содержимое предсуществующих альвеол — макрофаги, лейкоциты; в некоторых случаях — гибнущие опухолевые клетки (рис. 2). Кроме того, прослеживаются наслаивающиеся ряды клеток. При сравнении структуры клеток, расположенных в разных рядах альвеол, четко отмечаются признаки незрелых клеток у базальной мембраны по сравнению с теми, которые находятся над ними. Они отличаются меньшим размером, более интенсивно окрашенной базофильной цитоплазмой, увеличенным ядерно-цитоплазматическим соотношением и более гиперхромными, относительно укрупненными ядрами. Отмечаются отдельные альвеолы, в одной

части которых виден АЭ без патологических изменений, а в другой — с выраженными признаками атипии, характерными для рака.

Рис. 2. ПРЛ: некроз в центре опухоли в альвеоле. Гематоксилин, эозин; х400

Следует подчеркнуть, что подобный рост опухоли в альвеолах отмечается при всех основных формах РЛ — ПРЛ, ЖРЛ, МКРЛ. Однако их не всегда просто выявить, так как каждый гистологический тип характеризуется классическими морфологическими особенностями, на основании которых устанавливается вариант опухоли. Кроме того, в операционном материале, как правило, хорошо развитый и далеко зашедший опухолевый процесс и поэтому выявить начальные этапы его роста не так просто. В ежедневной гистологической диагностике этим вопросом мало кто интересуется. При тщательном исследовании гистологических препаратов ПРЛ, ЖРЛ, МКРЛ нам удалось найти отдельные или целые поля альвеол, в которых прослеживается рост РЛ от базальной мембраны. При исследовании гистологических препаратов АКРЛ опухолевые клетки с признаками различной степени атипии растут преимущественно в альвеолах одним рядом, реже отмечаются места, в которых видно несколько рядов опухолевых клеток и папиллярные структуры АЭ.

Для подтверждения замеченного нами начала роста РЛ из альвеол проведено ИГХ-исследование с применением МкАТ, которые характеризуют уровень пролиферативной активности опухолевых клеток (по наличию Кi-67 и PCNA) либо позволяют оценить их склонность к апоптозу (по экспрессии Bcl-2 и p53). Ki-67 и PCNA изучены в ИГХ-препаратах 23 больных РЛ (у 11 был ПРЛ, у 12 — ЖРЛ). Интересно отметить, что только базальные клетки имели позитивную реакцию на Ki-67 и PCNA, отражающую выраженную пролиферативную активность, а также морфологические признаки опухолевой трансформации АЭ. Это прослеживалось как при ПРЛ, так и при ЖРЛ; таким образом, можно трактовать это явление как закономерность. Найдены типичные структуры, в которых четко выявляются клетки ростковой зоны опухоли от базальной мембраны альвеол (рис. 3, 4).

Рис. 3. ЖРЛ: ИГХ-реакция на антиген Кі-67; х200

Рис. 4. ЖРЛ: ИГХ-реакция на антиген PCNA; х400

Наряду с этим, клетки, растущие над базальными рядами, не реагируют с названными МкАТ, то есть они соответствуют более зрелым элементам и утрачивают пролиферативную активность по сравнению с базальными клетками. Применение МкАТ к Вcl- 2 и p53 выявило, что в базальных ростковых зонах опухолевые клетки практически не содержат названных антигенов; в то время как клетки, приближающиеся к центру предсуществующих альвеол, имели позитивную реакцию.

Полученные данные подтверждают известные морфологические закономерности роста, последующей дифференцировки и гибели клеточных элементов. При этом по цитоморфологическим признакам начального роста клетки относятся к незрелым, приобретают признаки опухолевой атипии, затем дифференцируются (созревают) и, наконец, претерпевают апоптотические изменения и гибнут. Эти данные принципиально схожи с результатами других исследователей [18, 19].

ВЫВОДЫ

1. Изучение особенностей морфологической структуры РЛ разных гистологических типов позволило выявить, кроме типичных признаков, характерных для определенного варианта РЛ, общую закономерность роста раковой опухоли от базаль-

   ной мембраны альвеолы к ее центру, в котором выявляются клетки АЭ, макрофаги, лейкоциты — характерное содержимое предсуществующих альвеол.

2. ИГХ-исследования с использованием МкАТ подтверждают выявленные при гистологическом изучении признаки роста раковых клеток от базальной мембраны предсуществующих альвеол (Ki-67 и PCNA-положительные) с нарастанием в клетках, приближающихся к их центру, признаков зрелости и склонности к апоптозу, что свидетельствует об альвеологенном генезе.

3. При макроскопическом и микроскопическом исследованиях РЛ, который развивается в периферических отделах, не найдено морфологических признаков связи с какими-либо бронхами, что не подтверждает развитие РЛ из слизистой оболочки бронха.

4. Исследование операционного материала центральных форм РЛ позволило установить общую закономерность в виде наличия практически во всех случаях небольшой части ткани опухоли, растущей эндобронхиально или без эндобронхиального роста, и основного массива опухоли, растущего перибронхиально, что также не подтверждает развитие РЛ из эпителия бронхов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Арсеньев АИ, Барчук АС, Канаев СВ. Паллиативное лечение распространенного рака легкого. Вопр онкол 2006; 52 (4): 464–71.

2. Болгова ЛС. О гистогенезе рака легкого. Онкология 1999; (3): 195–8.

3. Вагнер РИ, Барчук АС, Друкин ЭЯ и др. Итоги и перспективы выявления доклинических форм рака легкого. II Всероссийский съезд онкологов. Омск. Тез докл 1980; 26–30.

4. Веснушкин ГМ, Плотникова НА, Семенченко АВ и др. Мелатонин угнетает канцерогенез легких, индуцированный уретаном у мышей. Вопр онкол 2006; 52 (2): 164–8.

5. Грицюте ЛА. Экспериментальные опухоли легких. М: Медицина, 1975. 166 с.

6. Клеточная биология легких в норме и при патологии. / Под ред: ВВ Ерохин, ЛК Романова / М.: Медицина, 2000, 496 с.

7. Есипова ИК. Легкое в патологии. ч II. Новосибирск: Наука, 1975. 248 с.

8. Загорулько АК, Аскари ТА. Атлас ультраструктурной морфологии респираторного отдела легких. Симферополь: AZ–PRESS–СОНАТ, 2002. 142 с.

9. Коган ЕА, Кодолова ИМ, Секамова СМ. Морфогенез периферического рака легкого. Арх патол 1988; 50 (6): 26–34.

10. Коган ЕА, Швец СИ, Коваленко ВЛ и др. Соотношение процессов пролиферации, апоптоза, ангиогенеза и метастазирования в различных гистогенетических типах рака легкого (иммуногистохимическое исследование). Арх патол 2004; 66 (6): 33–8.

11. Мацко ДЕ, Желбунова ЕА, Имянитов ЕН. Рак легкого: гистопатология и молекулярный патогенез. М: Медицина, 2007. 24 с. (Приложение к ж: Архив патологии 2007; 69).

12. Непомнящих ГИ. Биопсия бронхов: Морфогенез общепатологических процессов в легких. М: РАМН, 2005. 384 с.

13. Паклина ОВ, Галил–Оглы ГА, Берщанская АМ и др. Атипичная аденоматозная гиперплазия легких. Арх патол 2000; 62 (3): 21–3.

14. Рак в Україні, 2008–2009, захворюваність, смертність, показники онкологічної служби. Бюл національного канцерреєстру України 2010; (11). 111 с.

15. Романова ЛК. Регуляция восстановительных процессов. М: Изд-во Московского ун-та, 1984. 174 с.

16. Харченко ВП, Галил-Оглы ГА, Коган ЕА и др.

    Бронхиолоальвеолярный рак. Арх патол 2000; 62 (3): 10–6.

17. Шабад ЛМ. Предрак в экспериментально-морфологическом аспекте. М., 1967. 382 с.

18. Kerr KM, Carey FA, Lamb D. Evidence that pulmonary atypical alveolar hyperplasija in human lung is premalignant. J Pathol 1994; 174: 154–9.

19. Tomida Shuta, Yatabe Yasushi, Yanagisawa Kiyoshi Takashi. Throwing new light on lung cancer pathogenesis: Update on the on three recents topics. Сancer Sci 2005; 96 (2): 63–8.

20. World Health Organization Classification of Tumors of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. Lyon, 2004. 341 p.