ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩАЯ CPG-ДНК: ПЕРСПЕКТИВЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ В ОНКОЛОГИИ

Еще сравнительно недавно было принято считать, что нуклеиновые кислоты, как правило, иммунологически инертны [55–56]. Однако исследования последних лет позволили не только пересмотреть мнение о низкой иммуногенности ДНК,но признать ее одной из наиболее иммуногенных молекул природного происхождения.

Несмотря на то что иммуностимулирующие свойства ДНК впервые были открыты только в 80-е годы ХХ века, начало так называемой иммуностимулирующей терапии рака положено намногьраньше. В 1880 г. ньюйоркский хирург W. Coley впервые применил живые микроорганизмы для лечения больных раком. Он вводил живые бактерии Streptococcus pyogenes отдельно или совместно с Ser- ratia marcescens непосредственно в опухоль, что приводило к выраженной ее регрессии или к длительной ремиссии, однако сопровождалось сильной токсичностью и высоким риском развития рожистого воспаления [14]. Изменив тактику, W. Coley начал вводить больным убитые нагреванием бактерии, а также неочищенные бактериальные экстракты, получившие название токсины Coley [93]. Результат на то время был ошеломляющим: в группе из 894 пациентов с неоперабельными формами злокачественных опухолей после лечения токсинами Coley 5-летняя выживаемость составила 45%. Составные компоненты, входящие в «новое лекарство», на то время, конечно, не могли быть известны, а немного позже основную роль почемуто приписывали бактериальным эндотоксинам, хотя настоящего успеха W. Coley достиг лишь при использовании не содержащих эндотоксина грамположительных бактерий. Со временем в составе различных бактериальных экстрактов были идентифицированы и

охарактеризованы более простые компоненты, которым и приписывались иммуностимулирующие и противоопухолевые свойства, однако бактериальная ДНК ни разу не упоминалась [41]. В 1984 г. в Японии группа ученых под руководством T. Tokuna- ga доложила о том, что ДНКсодержащая фракция, изолированная из BCG (Bacillus Calmette-Guérin), активирует природные клеткикиллеры (NK-клетки), а также вызывает регрессию некоторых экспериментальных опухолей [71, 72]. Позже выяснилось, что при обработке нуклеолитическими ферментами большинство бактериальных экстрактов теряют иммуностимулирующие свойства, это свидетельствует о том, что именно ДНК является их ключевым иммуногенным ингредиентом [41, 72]. Факт повышения активности NK-клеток высокоочищенной бактериальной ДНК был потвержден в исследованиях[63, 96]; показано [51], что такая ДНК, в отличие от ДНК позвоночных, активирует также Влимфоциты.

Долго не удавалось понять: почему, будучи струк-

турно почти одинаковыми, обладая сходными физикохимическими свойствами и, главное, выполняя фактически одни и те же функции, ДНК бактерий и позвоночных так сильно отличаются между собой в плане проявления иммуностимулирующих свойств? Ответ на этот вопрос был найден только в середине 1990-х группой американских исследователей под руководством A. Krieg, которые при изучении влияния антисенсовых олигодезоксинуклеотидов (ОДН) на Вклетки установили, что именно неметилированные CG-динуклеотиды определяют иммуностимулирующие свойства ДНК [42]. Основания, фланкирующие неметилированный CG-динуклеотид и составляющие так называемый нуклеотидный

контекст, также играют немаловажную роль в определении иммуностимулирующих свойств ДНК, в частности оптимальным иммуностимулирующим мотивом оказался следующий: R1R2CGY1Y2, где R1 — пурин (предпочтительно G), R2 — пурин или Т, а Y1 и Y2 — пиримидины [42].

Следует отметить, что в геноме позвоночных

частота CG-динуклеотидов намного ниже ожидаемой, а также таковой в геноме бактерий. Кроме того, большинство цитозиновых остатков в ДНК позвоночных, и особенно цитозинов в составе CрG-мотивов, являются метилированными, что также объясняет низкую иммуногенность такой ДНК. Таким образом, было доказано, что присутствие в бактериальной ДНК неметилированных CpG-мотивов обусловливает ее иммуностимулирующую активность в отличие от ДНК позвоночных [6]. Высокополимерную ДНК или ее короткие последовательности, содержащие неметилированные CрG-мотивы и имеющие выраженное стимулирующее влияние на иммунную систему, принято называть иммуностимулирующими CрG-ДНК.

Активация иммунной системы под воздействием СрG-ДНК. Для объяснения иммуностимулирующей активности CpG-ДНК была выдвинута теория «сигнала опасности», согласно которой бактериальная ДНК, попав в организм, воспринимается иммунной системой как патогенный агент, способный вызвать инфекционный процесс [40]. Реакция организма на ДНК, обогащенную неметилированными CpG-мотивами, в первую очередь заключается в стремительной и мощной активации различных неспецифических механизмов иммунологической защиты, представляющих собой первую «линию обороны» против инфекционных возбудителей, паразитов и трансформированных клеток [3, 39, 40].

CрG-ДНК непосредственно или как костимулирующий сигнал активирует фактически все клетки иммунной системы [2, 3, 36, 38, 42, 64]. Поглощаясь клетками иммунной системы, CpG-ДНК специфически взаимодействует с Toll-like рецептором (TLR9), присутствующим в цитоплазматических эндоцитотозных везикулах [5, 30, 70], что приводит к стремительной генерации реактивных форм кислорода и активации NO-синтазы [70, 98]. Дальше TLR9-опосредованная активация иммунокомпетентных клеток происходит через сигнальный каскад, вовлекающий myeloid differ- entiation primary response gene 88 (MYD88) и такие сигнальные молекулы, как IL-1 receptor-activated ki- nase (IRAK) и tumour-necrosis factor receptor-associat- ed factor 6 (TRAF6). Кульминацией в этом сигнальном каскаде является активация нескольких транскрипционных факторов, включая nuclear factor-кB (NF-кB) и activating protein 1 (AP1) [36, 37, 40, 70], что непосредственно приводит к повышению регуляции экспрессии генов провоспалительных цитокинов и хемокинов [38, 40, 80].

Открытие иммуногенных свойств бактериальной ДНК привело к созданию ее синтетических CpG-содержащих олигонуклеотидных аналогов, различающихся не только нуклеотидной последовательностью, но и спецификой опосредуемых иммуностимулирующих эффектов [2, 36, 37, 65, 83]. Недавно, основываясь на особенностях структурных характеристик, а также иммуностимулирующей активности, все CpG-ОДН были разделены на 3 основных типа [43, 79]. CpG-ОДН типа А, или D-ОДН, — фосфоэфирные ОДН, которые, как и бактериальная ДНК, являются мощными индукторами IFN-α и активаторами NK-клеток [3, 34, 39,

43]; CpG-ОДН типа B, или K-ОДН [2, 43], являются фосфоротиоатными нуклеотидными последовательностями с одним или несколькими CpG-мотивами. В отличие от CpG-ОДН типа А, они резистентны к действию нуклеаз и поэтому в исследованиях in vivo часто демонстрируют длительные эффекты по типу лимфаденопатии [29, 48], а также активируют Влимфоциты и индуцируют секрецию фактора некроза опухоли (TNF)-α и IL-12 [38–41, 76], но при этом слабо активируют NK-клетки [3, 67, 97]; и, наконец, ОДН типа С, которые, подобно K-ОДН, имеют фосфоротиоатный остов и стимулируют секрецию IL-6 Влимфоцитами, но при этом, подобно D-ОДН, также обладают выраженной интерфероногенной активностью [25, 49].

Следует отметить, что CpG-ОДН, оптимальные для активации иммунной системы грызунов, часто оказываются низкоактивными у приматов, для которых оптимальными CpG-мотивами являются TCGTT и/или TCGTA [2, 43, 78, 79]. Кроме того, если у мышей TLR9 экспрессируют Влимфоциты, моноциты/макрофаги, а также дендритные клетки (ДК) плазмоцитоидного и миелоидного происхождения и соответственно могут быть непосредственно активированы CpG-ДНК, то у человека экспрессия TLR9 ограничивается только Влимфоцитами и плазмоцитоидными ДК [5, 34, 80].

Одним из наиболее примечательных свойств CpG-ДНК является ее способность значительно повышать уровень иммунного ответа даже на очень низкоиммуногенные антигены [40]. CpG-ДНК оказалась самым мощным иммуноадъювантом (превосходя полный Ад Фрейнда) Тх1-типа [36, 37, 39, 40, 76]. Адъювантное влияние CpG-ДНК объясняется ее способностью опосредованно через ДК или другие антигенпрезентующие клетки (АПК) активировать цитокиновую секрецию Тх1-лимфоцитами [36, 40, 65]. Кроме того, основным преимуществом CpG-ДНК является то, что в отличие от полного Ад Фрейнда, который так и не получил клинического применения, CpG-ДНК не имеет выраженной токсичности [32, 36, 76].

Исследования эффектов применения CрG-ДНК в экспериментальной иммунотерапии (ИТ) опухолей. Среди существующего разнообразия подходов к применению CрG-ДНК в ИТ рака можно выде-

лить несколько основных стратегий, среди которых: а) монотерапия CрG-ДНК [1, 7, 11, 85]; б) CрG- ДНК в составе ДНКвакцин [57]; в) применение CрG-ДНК в качестве Ад для повышения эффективности противоопухолевых вакцин (ПВ) [4, 15,

52, 64] или моноклональных антител (МкАТ) [33] и г) применение CрG-ДНК в качестве иммуностимулятора (ИС) или иммунопротектора при сопроводительной терапии [84].

Отбор и очистка значимого опухолевого антигена (ОАг), на введение которого в организме индуцировался бы иммунный ответ, являются весьма непростыми и не всегда выполнимыми задачами, что очень ограничивает возможности вакцинотерапии по поводу рака. Сделано предположение о том, что при введении CpG-ДНК непосредственно в опухоль иммунная система, возможно, сама выберет и распознает большинство важных и необходимых ОАг. Впервые эта идея была проверена на модели нейробластомы [11]. Более высокая эффективность применения пери(п/о) или интраопухолевых (и/о) инъекций CpG-ОДН, по сравнению с интраперитонеальным (и/п) введением, была продемонстрирована на большинстве моделей подкожно растущих опухолей [1, 10, 11, 27, 35].

Иммунотерапевтические эффекты применения CpG-ДНК могут состоять в выраженном торможении опухолевого роста (ОР), увеличении продолжительности жизни животных с опухолью, угнетении развития и роста метастазов, а также в полном отторжении первично трансплантированных опухолевых клеток (ОК) или уже развившихся опухолевых узлов и повторно трансплантированных опухолей [1, 10–12]. Было показано, что выраженность данных эффектов зависит от режима применения CpG-ДНК (профилактический или терапевтический) [7, 10, 64, 91], дозы, количества и частоты

инъекций [7, 12, 16], количества трансплантированных ОК, агрессивности опухолевой модели [26, 27, 45, 60], степени развития опухоли перед началом терапии CpG-ДНК [26, 88] и чувствительности опухоли к другим способам лечения [45]. Фосфоротиоатная модификация или липосомальная доставка CpG-ОДН значительно снижают их деградацию в организме под действием нуклеаз сыворотки крови и внутриклеточных нуклеаз, что также отражается на эффектах ИТ CpG-ДНК [19, 36, 45, 54, 59, 92]. На модели мезотелиомы у мышей показано, что повторные и/п инъекции CpG-ОДН в комплексе с катионными липидами, в отличие от их раздельного применения, приводят к отторжению развившихся в брюшной полости опухолевых узлов и выживанию 100% животных [45].

В экспериментах на модели рака мочевого пузыря было доказано, что достаточно всего лишь одного внутривенного введения (в/в) CpG-ОДН, чтобы вызвать существенное торможение ОР [28]. Однако в случае таких опухолей, как нейробластома, глиома, меланома В16, Тклеточная лимфома, карци-

нома Эрлиха и др., для достижения существенного эффекта ИТ применяли серию последовательных инъекций CpG-ДНК с различным суточным интервалом между введениями [2, 11, 15, 64, 69].

Противоопухолевый иммунный ответ, регистрируемый после введения CpG-ДНК, характеризуется преимущественно активацией NK-клеток, NKТклеток, макрофагов и цитотоксических Тлимфоцитов [1, 7, 9, 15, 19, 32, 35, 85], а эффективность проводимой ИТ коррелирует с антигенностью опухоли [35]. Согласно результатам гистологических исследований и/о или п/о введение CpG -ДНК приводит к массивной инфильтрации опухолевого узла Тлимфоцитами и макрофагами, за счет цитотоксического влияния которых преимущественно и происходит уничтожение отдельных ОК и разрушение опухоли в целом [1, 20, 22]. N. Garbi и соавторы [22] показали, что иммуностимуляция CpG-ДНК имеет также влияние на микроокружение опухоли. При этом, действуя как провоспалительный стимул, CpG-ДНК повышает экспрессию молекул адгезии на клетках эндотелия и тем самым способствует проникновению эффекторных клеток в ткань опухоли.

Важно отметить, что факты отторжения развившихся и повторно трансплантированных опухолей, а также регрессия контрлатеральных месту введения CpG-ДНК опухолей, что на введение CpG-ДНК развивается не локальный, а системный иммунный ответ [2, 11, 12, 26,27, 45, 60]. Отторжение или регрессивные изменения обеих контрлатерально расположенных и гистогенетически различных опухолей при п/о введениях CpG-ОДН свидетельствуют об отсутствии видоспецифичности действия CpG-ДНК [27].

Специфика иммунобиологической активности CрG-ОДН относительно индуцируемого иммунного ответа также варьирует в зависимости от последовательности ОДН, особенностей их остова, а также от исследуемой опухолевой модели. Показано [2], что введение CрG-ОДН 1585 вызывает выраженную опосредованную NK-клетками регрессию меланомы, но является абсолютно неэффективным при лимфоме. После введения CрG-ОДН 1826 отмечали выраженное угнетение роста лимфомы, опосредованное NK- и Тклетками. Согласно результатам некоторых исследований продукция таких цитокинов, как IFN-γ и IL-12, а также активация NK-клеток играют важную роль в индуцированном CрG-ОДН 1826 угнетении роста гепатомы

[84] и выраженном антиметастатическом эффекте CрG-ДНК [16, 19, 23]. На двух разных опухолевых линиях, метастазирующих в легкие и печень, было показано, что антиметастатический эффект CрG- ДНК не зависит от линии мышей, линии ОК или органамишени для метастазов [23].

ОК редко представляют на своей поверхности антигены, необходимые для формирования эффективного Тклеточного иммунного ответа. Для

преодоления этой проблемы в последнее время разрабатывают новые иммунотерапевтические подходы, одним из которых является направленная модификация экспрессии костимулирующих молекул или секреции цитокинов ОК с целью повышения их способности функционировать в виде АПК. Такой подход может быть особенно эффективен в случае ИТ лимфопролиферативных малигнизаций Вклеточного происхождения, так как CpG-ДНК имеет непосредственное влияние на Влимфоциты [18, 42]. Установлено, что значительно возрастает экспрессия вовлеченных в костимуляцию, презентацию антигенов и апоптоз молекул (CD40, CD54, CD80, CD86, CD95 и МНС І и ІІ класса) на поверхности преВлимфобластоидных клеток, обработанных CpG-ОДН in vitro, а также их способность функционировать в виде АПК [31, 58]. Следует отметить, что стимуляция малигнизированных Вклеток CpG-ОДН вызывает усиленную экспрессию на их поверхности рецептора к IL-2. Кроме того, малигнизированные CD40+-Вклетки, стимулированные CpG-ОДН в сочетании с IL-2, намного активнее индуцируют пролиферацию и продукцию IFN- γ аллогенными и аутологичными Тклетками, что также является весьма перспективной стратегией при ИТ таких малигнизаций [17].

Сегодня ДНКвакцины с успехом используют для генерирования противоопухолевого иммунного ответа на такие антигенымишени, наиболее часто экспрессируемые злокачественными опухолями человека, как раковоэмбриональный антиген, ErbB2/neu, меланомаассоциированные антигены и др. [57]. В исследовании А. Schneeberger и соавторов

1. показано, что вакцинация мышей ДНКвакциной, кодирующей меланомаспецифический антиген и обогащенной CрG-мотивами, приводит к отторжению трансплантированных клеток меланомы, опосредованному специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами.

   Применение CрG-ДНК в качестве Ад совместно с облученными ОК или ОАг, входящими в состав ПВ, зачастую способствует более выраженной противоопухолевой активности в профилактических, нежели терапевтических схемах применения [4, 9,

   15, 52, 64, 91]. Проведены исследования, в которых сделаны успешные попытки применить CрG-ОДН в сочетании с ПВ, которые представляют собой живые облученные генетически модифицированные ОК, способные секретировать определенный цитокин [60, 69]. Вакцинотерапия такого плана весьма эффективна, так как параллельно с присутствием уже готовых к презентации ОАг в организме также создается «выгодное» цитокиновое микроокружение. В одной из работ было отмечено, что хотя ПВ и CрG-ДНК отдельно способны индуцировать мощный цитотоксический иммунный ответ, только при их совместном применении этот эффект коррелировал с противоопухолевым ответом [69]. Кроме того, по данным гистологических исследований

   такое комбинированное применение отражается на васкуляризации опухоли, приводя к ее массивному некрозу. Вероятно, это происходит за счет высоких локальных концентраций TNF-α и сильных антиангиогенных свойств IL-12 и IFN-γ [23, 68, 69]. Не менее успешно применение CрG-ДНК в сочетании с высокоочищенными нативными пептидными ОАг или их синтетическими аналогами [52, 64, 68].

   CрG-ОДН существенно повышают эффективность МкАТ для ИТ при злокачественных опухолях. На модели Вклеточной лимфомы у мышей был показан значительный противоопухолевый эффект совместного применения антиидиотипических МкАТ с CрG-ОДН: опухоли развивались лишь у 20% животных по сравнению с 90% в случае проведения лишь терапии МкАТ [94]. Кроме того, комбинированное применение МкАТ с CрG-ОДН оказалось намного эффективным и менее токсичным, чем таковое с использованием IL-2 [33]. Дальнейшие исследования установили, что введение мышам с трансплантированной лимфомой 38С13 CрG- ОДН через 2 сут после проведения МкАТтерапии еще больше повышает противоопухолевую эффективность МкАТ [86]. Комбинированное применение CpG-ДНК и МкАТ к рецептору эпидермального фактора роста приводит к выраженной регрессии ксенотрансплантатов колоректального рака у мышей, а совместное применение их с иринотеканом — к отторжению уже развившихся опухолей у 90% животных [73].

   Однако N. Garbi и соавторы [22] сообщают, что применение CpG-ДНК отдельно или в виде Ад для белковых ПВ является недостаточным для полного излечения от опухолевого процесса, тогда как использование CpG-ДНК совместно с адоптивной ИТ на основе Тклеток может оказаться более перспективным. O. Egeter и соавторы [20] в своих исследованиях вводили животным с опухолями преинкубированные с CpG-ДНК CD4+-лимфоциты, достигая полного отторжения уже развившихся опухолей даже у CD8–-мышей. Кроме того, под воздействием CpG-ДНК происходит созревание незрелых ДК и активация продукции цитокинов зрелыми ДК [9, 25, 50]. ДК, активированные in vitro с помощью

   CpG-ДНК, являются потенциальными ПВ [9, 13, 50, 89]. На различных моделях ОР показано, что комбинированное применение нагруженных ОАг ДК и CpG-ДНК приводит к регрессии и даже к отторжению развившихся нечувствительных к химиотерапии опухолей больших размеров [13, 26, 50].

   Применение CpG-ДНК в сочетании с цитостатиками может потенцировать противоопухолевую активность последних. На модели рабдомиосаркомы показано, что совместное применение CpG-ОДН 2006 и таких химиопрепаратов, как циклофосфамид или топотекан, способствует значительному увеличению продолжительности жизни мышей с опухолями больших размеров по сравнению с применением этих препаратов отдельно [88]. В другом иссле-

   довании также показано, что локальное введение CpG-ДНК и циклофосфамида крысам с глиомой приводит к выраженной регрессии ОР [10]. Недавно было доложено об успешных экспериментальных результатах комбинированного применения паклитаксела и CрG-ОДН 7909 на модели метастазирующей карциномы легких Льюис. Значительное увеличение продолжительности жизни животных, а также отсутствие какихлибо дополнительных токсических проявлений со стороны цитостатика при совместном применении с CрG-ОДН свидетельствуют о перспективности этого лечения у больных немелкоклеточным раком легкого [87]. Хорошие экспериментальные результаты получены при системном применении CpG-ОДН 2006 для предупреждения развития рецидивов после хирургической резекции опухоли [88].

   Исследуют возможности применения CрG-ДНК в сочетании с лучевой терапией (ЛТ). Применение CрG-ОДН значительно усиливает эффект ЛТ, что приводит к существенному увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных, у которых выявлены повышенная чувствительность опухоли к облучению и четкие гистологические изменения, состоящие в появлении больших некротизированных участков, выраженной инфильтрации воспалительными иммунокомпетентными клетками и снижении плотности ОК [53]. Полученные данные свидетельствуют о значительном потенциале CрG-ДНК для улучшения результатов ЛТ у больных онкологического профиля.

   Безусловно, что химиотерапевтические препараты проявляют более выраженные противоопухолевые эффекты по сравнению с различными агентами, стимулирующими или модулирующими противоопухолевый иммунный ответ. Однако угнетая ОР и убивая трансформированные, активно пролиферирующие ОК, цитостатики, к сожалению, вызывают серьезные повреждения нормальных клеток, особенно гемопоэтических клеток костного мозга, что влечет за собой выраженную иммуносупрессию. CрG-ДНК является сильным ИС и, как было выявлено, помимо активации различных иммунокомпетентных клеток, способна индуцировать экстрамедуллярный гемопоэз [48, 66], а также повышать цитотоксическую активность Тлимфоцитов у облученных мышей [66]. Кроме того, применение CрG-ДНК сопровождается намного меньшими побочными эффектами, чем цитостатиков или таких ИС, как IFN-γ и IL-12 [85], что может сделать ее более привлекательной для лечения пациентов с рядом злокачественных новообразований. Поэтому применение CрG-ДНК в качестве сопроводительной терапии для нивелирования иммуносупрессирующего влияния цитостатиков или ЛТ на сегодня рассматривается как весьма перспективное направление. X.S. Wang и соавторы [84], исследующие в эксперименте комбинированное применение флуороурацила и CрG-ОДН 1826, установили,

   что CрG-ДНК способна устранять иммуносупрессию, индуцированную химиопрепаратами. При этом введение мышам с перевитой гепатомой Н-22 CрG-ДНК индуцировало высокий уровень IFN-γ и IL-12 в сыворотке крови и значительно повышало цитотоксическую активность NK-клеток даже на фоне применения флуороурацила [84].

   Следует отметить, что получены положительные результаты применения CрG-ДНК в ИТ рака на нокаутных линиях мышей, включая nude, SCID, beige и др. [1, 7, 10, 11, 68]. Так, еженедельные и/п инъекции CрG-ДНК трансгенным мышам Her-2/neu значительно снижали частоту спонтанного возникновения аденокарциномы молочной железы и обеспечивали выраженный антиметастатический эффект у животных после в/в введения ОК [62]. В другом исследовании в/в введение CрG-ДНК способствовало существенному снижению частоты возникновения аутохтонных опухолей поджелудочной железы у мышей RIP1-Tag5, однако не обеспечивало заметного терапевтического эффекта у животных с уже развившимися опухолями [22].

   Результаты первых клинических испытаний CрG-ДНК в онкологической практике. Несмотря на то что CрG-ДНК и распознающий ее рецептор были открыты сравнительно недавно, уже начаты и проводятся больше десятка клинических испытаний различных CрG-ОДН [36]. Предварительные результаты свидетельствуют о том, что CрG-ОДН могут значительно усиливать продукцию антигенспецифических антител у здоровых добровольцев [24, 37]. Способность CрG-ДНК повышать и ускорять иммунный ответ является одним из главных преимуществ при выборе Ад, а способность повышать как мукозальный, так и системный иммунитет вообще делают ее непревзойденной, особенно в случае ИТ по поводу злокачественных новообразований [32, 40, 41].

   Сравнительно недавно были начаты испытания CрG-ОДН 7909 у пациентов с меланомой и базальноклеточной карциномой [74, 75]. Участники получали CрG-ОДН 7909 в возрастающих дозах (от 0,01 до 10 мг) с интервалом в 2 нед интратуморально либо в окружающую опухоль ткань. При этом побочные эффекты состояли в покраснении и незначительной припухлости в месте инъекции, а также в таких типичных гриппоподобных симптомах, как лихорадка или озноб, которые проходили через 2 сут после введения препарата, и лишь у 1 пациента при введении CрG-ОДН 7909 в высоких дозах (2,5 и 10 мг) выявлено кратковременное повышение артериального давления. Уже после введения CрG-ОДН 7909 в самой низкой дозе у всех больных с базальноклеточной карциномой отмечали признаки регрессии ОР, при этом у 1 пациента регистрировали полный ответ, у 2 — частичный, выражающийся в уменьшении размера опухоли не менее чем на 50%, и у 1 больного — уменьшение размера опухоли на 43%.

   В случае меланомы только у 2 из 4 пациентов выявлен ответ на проводимую CрG-ОДНтерапию. У одного из них также отмечена незначительная регрессия метастазов, у другого, получавшего CрG- ОДН 7909 в дозе 5 мг внутрь в опухоль, — полная регрессия опухолевых узлов, в то время как расположенные вблизи узлы продолжали прогрессировать и даже развиваться de novo. Таким образом, предварительные результаты проведенных испытаний свидетельствуют о том, что CрG-ОДН 7909, обладая достаточно приемлемой токсичностью, могут применяться интратуморально для лечения больных с опухолями кожи [41, 75].

   Начаты клинические испытания (І фаза) монотерапевтического применения CрG-ОДН 7909 и у пациентов с рецидивирующей неходжкинской лимфомой после проведенной химиотерапии [47]. У 15 пациентов, принимавших участие в исследовании, на 21-е сутки после проведения CрG-ОДНтерапии отмечено дозозависимое повышение активности NK-клеток и эффекторов АЗКЦ. Кроме того, что пациенты довольно хорошо переносили введение CрG-ОДН 7909, ни в одном из случаев не выявлено прогрессирования ОР [95].

   Закончился первый этап исследований новой ПВ, содержащей антиген меланомы MAGE-3, совместно с CрG-ОДН 7909 [44]. В исследовании принимали участие всего лишь 6 больных с метастатической MAGE-3+-меланомой, которые получали внутримышечные инъекции MAGE-3 и CрG-ОДН 7909 в дозах 300 мкг и 0,5 (или 1,0) мг соответственно. Оценивали безопасность и переносимость препаратов, содержащих CрG-ДНК, а также изучали их иммуностимулирующий и противоопухолевый эффект. Все пациенты получали по 4 инъекции вакцины совместно с Ад с 3-недельным интервалом, а в случае отсутствия ОР — еще 3 инъекции. Согласно шкале Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) у 2 пациентов выявлено прогрессирование ОР и еще у 2 — частичный ответ на проведенное лечение, который длился не менее 12 мес [41, 77]. Несмотря на столь небольшое количество пациентов, принимавших участие в этих клинических испытаниях, обнадеживает сам факт положительного клинического ответа на введение CрG-ДНК у больных меланомой IV стадии [77]. Следует отметить, что введение CрG-ОДН 7909 достаточно хорошо переносилось пациентами, отмечали токсические проявления І и ІІ степени — кратковременную лихорадку, усталость, миалгию, головную боль, тошноту и (или) рвоту, общую болезненность и кожные реакции в месте введения препарата [44].

   Одним из весьма перспективных подходов клинического использования CрG-ДНК, который начал разрабатываться одним из первых, является комбинированное применение CрG-ОДН и специфических противоопухолевых МкАТ [33]. Недавно опубликованы предварительные результаты І фазы клинических испытаний совместного применения

   CрG-ОДН 1018 c препаратом Ритуксан (ритуксимаб) у пациентов с неходжкинскими лимфомами [21]. В испытаниях установлено, что CрG-ОДН 1018 хорошо переносится и в комбинации с ритуксаном не вызывает значительных токсических проявлений, а также характеризуется значительной иммунобиологической активностью, состоящей в повышении экспрессии генов IFNα/β, потенцировании АЗКЦ и антигенпрезентующей функции ДК, макрофагов и Влимфоцитов. У 6 из 18 принимавших участие в исследовании пациентов отмечали положительный ответ на проведенное лечение (у 1 — неподтвержденная полная ремиссия, у 5 — частичная ремиссия), у остальных — стабилизацию состояния. Медиана выживаемости при этом составила около 12 мес (5–23,5 мес). Более того, была начата ІІ фаза испытаний совместного применения CрG- ОДН 1018 и ритуксимаба у пациентов c рецидивирующей фолликулярной неходжкинской лимфомой. В этих исследованиях планируется оценить влияние такого комбинированного лечения на опухолевое микроокружение и системный иммунный ответ, а также проследить возможную корреляцию этих показателей с клиническим ответом на проводимое лечение [21].

   Проведены подобные клинические испытания ритуксимаба и CpG-ОДН 7909 [90]. Комбинированное применение двух препаратов хорошо переносили 50 пациентов, принимавших участие в исследовании, у которых при этом отмечали местные побочные реакции І и ІІ степени, артралгию и миалгию. У некоторых (2–4%) больных выявлены более серьезные побочные эффекты, такие как лимфопения, нейтропения, диарея и дегидратация. Через 50 дней после начала лечения отмечали 7 случаев объективного клинического ответа (3 — полный и 4 — частичный), через 20 нед — еще 5 случаев (1 — полный и 4 — частичный). Продолжаются клинические испытания применения CрG-ОДН 7909 совместно с препаратом трастузумаб при лечении больных раком молочной железы [10, 33].

   Проводятся клинические испытания комбинированного применения CрG-ДНК с некоторыми цитостатиками. В исследовании, в котором принимали участие 184 пациента с метастатической меланомой, применяли CрG-ОДН 7909 отдельно или совместно с дакарбазином [81, 82]. Установлено, что подкожное введение CрG-ОДН 7909 в дозах до 40 мг/нед является безопасным и хорошо переносится пациентами. Кроме того, применение CрG- ОДН 7909 не только не усложняет лечение с использованием дакарбазина, но и значительно улучшает клинический ответ у пациентов по сравнению с применением одного цитостатика [81]. В других исследованиях с привлечением 83 больных немелкоклеточным раком легкого выявлено, что сочетанное применение комплекса таксан–платина и CрG- ОДН 7909 значительно повышает выживаемость без прогрессирования опухолевого процесса, а также

   общую выживаемость пациентов, не усложняя при этом химиотерапии [46].

   Таким образом, анализ многочисленных литературных данных дает возможность подтвердить безусловную перспективность применения препаратов на основе CрG-ДНК в ИТ больных со злокачественными новообразованиями.

   ЛИТЕРАТУРА

   1. Auf G, Carpentier AF, Chen L, et al. Implication of macro- phages in tumor rejection induced by CpG-oligodeoxynucleotides without antigen. Clin Cancer Res 2001; 7: 3540–3.

   2. Ballas Z, Krieg AM, Warren T, et al. Divergent therapeutic and immunologic effects of oligodeoxynucleotides with distinct CpG motifs. J Immunol 2001; 167: 4878–86.

   3. Ballas Z, Rasmussen WL, Krieg AM. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J Immunol 1996; 157: 1840–7.

   4. Baral RN, Saha SK, Chatterjee KA, et al. Immunostimula- tory CpG oligodeoxynucleotides enhance the immune response of anti-idiotype vaccine that mimics carcinoembryonic antigen. Can- cer Immunol Immunother 2003; 52: 317–27.

   5. Bauer S, Kirschning CJ, Hacker H, et al. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 9237–42.

   6. Bird AP. CpG islands as gene markers in the vertebrate nu- cleus. Trends Genet 1987; 3: 342–7.

   7. Blazar BR, Krieg AM, Taylor PA. Synthetic unmethylated cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides are potent stimulators of antileukemia responses in naïve and bone marrow transplant recipients. Blood 2001; 98(4): 1217–25.

   8. Broide DH, Orozco EM, Roman M, et al. Intradermal gene vaccination down-regulates both arms of the allergic response. J Allergy Clin Immunol 1997; 99: 129–36.

   9. Brunner C, Seiderer J, Schlamp A, et al. Enhanced dendritic cell maturation by TNF-α or cytidine-phosphate-guanosine DNA drives T cell activation in vitro and therapeutic anti-tumor immune responses in vivo. J Immunol 2000; 165: 6278–86.

   10. Carpentier AF, Auf G, Delattre JY. CpG-oligonucleotides for cancer immunotherapy: review of the literature and poten- tial applications in malignant glioma. Front Bioscience 2003; 8: 115–27.

   11. Carpentier AF, Chen L, Maltonti F, Delattre JY. Oligodeso- xynucleotides containing CpG motifs can induce rejection of a neu- roblastoma in mice. Cancer Res 1999; 59 (21): 5429–32.

   12. Carpentier AF, Xie J, Mokhtari K, Delattre JY. Successful treatment in intracranial gliomas in rat by oligodeoxynucleotides containing CpG motifs. Clin Cancer Res 2000; 6: 2469–73.

   13. Chagnon F, Tanguay S, Ozdal OL, et al. Potentiation of a dendritic cell vaccine for murine renal cell carcinoma by CpG ol- igonucleotides. Clin Cancer Res 2005; 11 (3): 1302–11.

   14. Coley WB. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas: with a report of ten original cases. 1893. Clin Orthop Relat Res 1991; 262: 3–11.

   15. Davila E, Celis E. Repeated administration of cytosine- phosphorothiolated guanine-containing oligonucleotides togeth- er with peptide/protein immunization results in enhanced CTL re- sponses with anti-tumor activity. J Immunol 2000; 165: 539–47.

   16. Davis HL, Weeratna RD, Bourne LL, et al. Role of dose in- tensity of TLR9 agonist CpG ODN (CPG 7909) in the treatment of metastatic murine renal cell carcinoma. 40th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, June 5–8, 2004, New Orleans, USA.

   17. Decker T, Schneller F, Kronschnabl M, et al. Immunos- timulatory CpG-oligonucleotides induce functional high affin- ity IL-2 receptors on B-CLL cells: Costimulation with IL-2 re- sults in a highly immunogenic phenotype. Exp Hematol 2000; 28: 558–68.

   18. Decker T, Schneller F, Sparwasser T, et al. Immunostim- ulatory CpG-oligonucleotides cause proliferation, cytokine pro- duction, and an immunogenic phenotype in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2000; 95: 999–1006.

   19. Dow SV, Fradkin LG, Liggitt DH, et al. Lipid-DNA complexes induce potent activation of innate immune responses and antitumor activity when administered intravenously. J Immunol 1999; 163: 1552–61.

   20. Egeter O, Mocikat R, Ghoreschi K, et al. Eradication of disseminated lymphomas with CpG DNA activated T helper type 1 cells from nontransgenic mice. Cancer Res 2000; 60: 1515–20.

   21. Friedberg JW, Kim H, McCauley M, et al. Combination immunotherapy with a CpG oligonucleotide (1018 ISS) and rituximab in patients with non-Hodgkin lymphoma: increased interferon-α/β-inducible gene expression, without significant toxicity. Blood 2005; 105 (2): 489–95.

   22. Garbi N, Arnold B, Gordon S, et al. CpG motifs as proinflammatory factors render autochthonous tumors permissive for infiltration and destruction. J Immunol 2004; 172: 5861–9.

   23. Hafner M, Zawatzky R, Hirtreiter, et al. Antimetastatic effect of CpG DNA mediated by type I IFN. Cancer Res 2001; 61: 5523–8.

   24. Halperin SA, Van Nest G, Smith B, et al. A phase I study of the safety and immunogenicity of recombinant hepatitis B surface antigen co-administered with an immunostimulatory phosphorothioate oligonucleotide adjuvant. Vaccine 2003; 21: 2461–7.

   25. Hartmann G, Battiany J, Poeck H, et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-γ induction in plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol 2003; 33: 1633–41.

   26. Heckelsmiller K, Beck S, Rall K, et al. Combined dendritic cell- and CpG oligonucleotide-based immune therapy cures large murine tumors that resist chemotherapy. Eur J Immunol 2002; 32: 3235–45.

   27. Heckelsmiller K, Rall K, Beck S, et al. Peritumoral CpG DNA elicits a coordinated response of CD8 T cells and innate effectors to cure established tumors in a murine colon carcinoma models. J Immunol 2002; 169: 3892–9.

   28. Hegele A, Dalpke A, Heeg K, et al. Immunostimulatory CpG oligonucleotides reduce tumor burden after intravesical ad- ministration in an orthotopic murine bladder cancer model. Tu- mour Biol 2005; 26 (5): 274–80.

   29. Heikenwalder M, Polymenidou M, Junt T, et al. Lymphoid follicle destruction and immunosuppression after repeated CpG oligodeoxynucleotide administration. Nat Med 2004; 10 (2): 187–92.

   30. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 2000; 408: 740–5.

   31. Jahrsdorfer B, Hartmann G, Racila E, et al. CpG DNA in- creases primary malignant B cell expression of costimulatory mol- ecules and target antigens. J Leukocyte Biol 2001; 69: 81–8.

   32. Jahrsdorfer B, Weiner GJ. CpG oligodeoxynucleotides for immune stimulation in cancer immunotherapy. Curr Opin Inves- tig Drugs 2003; 4: 686–90.

   33. Jahrsdorfer B, Weiner GJ. Immunostimulatory CpG ol- igodeoxynucleotides and antibody therapy of cancer. Semin On- col 2003; 30: 476–82.

   34. Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, et al. Subsets of hu- man dendritic cell precursors express different toll-like recep- tors and respond to different microbial antigens. J Exp Med 2001; 194: 863–70.

   35. Kawarada Y, Ganss R, Garbi N, et al. NK- and CD8+ T cell-mediated eradication of established tumors by peritumoral injection of CpG-containing oligodeoxynucleotides. J Immunol 2001; 167: 5247–53.

   36. Klinman DM. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature Rev Immunol 2004; 4: 1–10.

   37. Klinman DM, Ishii KJ, Gursel M, et al. Immunotherapeutic applications of CpG-containing oligodeoxynucleotides. Drug News Perspect 2000; 13: 289–96.

   38. Klinman DM, Yi AK, Beaucage SL, et al. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. Pro Natl Acad Sci USA 1996, 93: 2879–83.

   39. Krieg AM. Now I know my CpGs. Trends Microbiol 2001;

       9(6): 249–52.

   40. Krieg AM. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu Rev Immunol 2002; 20: 709–60.

   41. Krieg AM. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts? Nature Medicine 2003; 9 (7): 831–5.

   42. Krieg AM, Yi A-K, Matson S, et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 1995; 374: 546–9.

   43. Krug A, Rothenfusser S, Hornung V, et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN α/β in plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol 2001; 31: 2154–63.

   44. Kruit WH, van Ojik H, Portielje J, et al. Phase I/II study with CpG 7909 as adjuvant to vaccination with MAGE-3 protein in patients with MAGE-3 positive tumors. 38th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, May 18–21, 2002, Orlando, Florida, USA.

   45. Lanuti M, Rudginsky S, Force SD, et al. Cationic lipid: bacterial DNA complexes elicit adaptive cellular immunity in murine intraperitoneal tumor models. Cancer Res 2000; 60: 2955–63.

   46. Leichman G, Gravenor D, Woytowitz D, et al. CPG 7909, a TLR9 agonist, added to first line taxane/platinum for advanced non-small cell lung cancer, a randomized, controlled phase II study. 41st Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, May 13–17, 2005, Orlando, Florida, USA. J Clin Oncol 2005; 23(16 suppl): 7039.

   47. Link BK, Ballas AK, Weisdorf D, et al. Phase I study to assess safety and activity of oligodeoxynucleotide CpG 7909 in patients with previously treated non-Hodgkin’s lymphoma [abstr]. Blood 2001; 98: 608–9.

   48. Lipford GB, Sparwasser T, Zimmermann S, et al. CpG- DNA-mediated transient lymphadenopathy is associated with a state of Th1 predisposition to antigen-driven responses. J Immunol 2000; 165: 1228–35.

   49. Marshall JD, Fearon K, Abbate C, et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. J Leukoc Biol 2003; 73: 781–92.

   50. Merad M, Sugie T, Engleman EG, Fong L. In vivo manipulation of dendritic cells to induce therapeutic immunity. Blood 2002; 99 (5): 1676–82.

   51. Messina JP, Gilkeson CS, Pisetsky DS. Simulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA. J Immunol, 1991, 147: 1759–64.

   52. Miconnet I, Koenig S, Speiser D, et al. CpG are efficient adjuvants for specific CTL induction against tumor antigen-de- rived peptide. J Immunol 2002; 168: 1212–8.

   53. Milas L, Mason KA, Ariga H, et al. CpG oligodeoxynu- cleotide enhances tumor response to radiation. Cancer Res 2004; 64(15): 5074–7.

   54. Mui B, Raney SG, Semple SC, Home MJ. Immune stim- ulation by a CpG-containing oligodeoxynucleotides is enhanced when encapsulated and delivered in lipid particles. J Pharmacol Exp Ther 2001; 298: 1185–92.

   55. Pisetsky DS, Grudier JP, Gilkeson GS. A role of immuno- genic DNA in the pathogenesis of systemic lupus erythematous. Arthritis Rheum 1990; 33: 153–9.

   56. Plescia OJ, Braun W. Nucleic acids as antigens. Adv Im- munol 1967; 6: 231–9.

   57. Prud’homme GJ. DNA vaccination against tumors. J Gene Med 2005; 7 (1): 3–17.

   58. Rieger R, Kipps TJ. CpG oligodeoxynucleotides enhance the capacity of adenovirus-mediated CD154 gene transfer to generate effective B-cell lymphoma vaccines. Cancer Res 2003; 63: 4128–35.

   59. Rudginsky S, Siders W, Ingram L, et al. Antitumor activity of cationic lipid complexes with immunostimulatory DNA. Mol Ther 2001; 4: 347–55.

   60. Sandler AD, Chihara H, Kobayashi G, et al. CpG oligonucleotides enhance the tumor antigen-specific immune response of a granulocyte macrophage colony-stimulating factor- based vaccine strategy in neuroblastoma. Cancer Res, 2003; 63: 394–9.

   61. Schneeberger A, Wagner C, Zemann A, et al. CpG motifs are efficient adjuvants for DNA cancer vaccines. J Invest Dermatol 2004; 123: 371–9.

   62. Sfondrini L, Besusso D, Rumio C, et al. Prevention of spontaneous mammary adenocarcinoma in HER-2/neu transgenic mice by foreign DNA. FASEB J 2002; 16: 1749–54.

   63. Shimada S, Yano O, Tokunaga T. In vivo augmentation of natural killer cell activity with a deoxyribonucleic acid fraction of BCG. Jpn J Cancer Res, 1986, 77: 808–16.

   64. Shlyakhovenko VA, Olishevsky SV, Kozak VV, et al. Anticancer and immunostimulatory effects of nucleoprotein fraction of Bacillus subtilis 7025 culture medium filtrate. Exp Oncol 2003, 25: 119–23.

   65. Silverman ES, Drazen JM. Immunostimulatory DNA for asthma. Better than eating dirt. Am J Respir Cell Mol Biol 2003; 28: 645–7.

   66. Sparwasser T, Hültner L, Koch ES, Luz A, Lipford GB, Wagner H. Immunostimulatory CpG-oligodeoxynucleotides cause extramedullary hemopoiesis. J Immunol 1999; 162: 2368–74.

   67. Stacey KJ, Sweet MJ, Hume DA. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. J Immunol 1996; 157 (5): 2116–22.

   68. Stern BV, Boehm BO, Tary-Lehmann M. Vaccination with tumor peptide in CpG adjuvant protects via IFN-γ-dependent CD4 cell immunity. J Immunol 2002, 168: 6099–6105.

   69. Switaj T, Jalili A, Jakubowska AB, et al. CpG immunostimulatory oligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 gene-modified tumor vaccine in a melanoma model in mice. Clin Cancer Res 2004; 10: 4165–75.

   70. Takeshita F, Leifer CA, Gursel I, et al. Cutting edge: Role of toll-like receptor 9 in CpG DNA-induced activation of human cells. J Immunol 2001; 167: 3555–8.

   71. Tokunaga T, Yamamoto H, Shimada S, et al. Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I. Isolation, physicochemical characterization and antitumor activity. J Natl Cancer Inst 1984; 72 (4): 955–62.

   72. Tokunaga T, Yamamoto T, Yamamoto S. How BCG led to the discovery of immunostimulatory DNA. Jpn J Infect Dis 1999; 52 (1): 1–11.

   73. Tortora G, Bianco R, de Placido S, et al. A novel modified CpG inhibits EGF receptor signaling and synergistically enhances antitumor activity of cetuximab and irinotecan in colon cancer xe- nografts. 41st Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, May 13–17, 2005, Orlando, Florida, USA. J Clin On- col 2005; 23(16 suppl): 3191.

   74. Trefzer U, Kors C, Pelzer K, et al. Preliminary results of a phase I trial of intralesional injection of CpG-DNA in basal cell carcinoma or melanoma. 2nd International Symposium «Activat- ing immunity with CpG Oligos». October 7–10, 2001, Amelia Is- land, Florida, USA.

   75. Trefzer U, Kors C, Pelzer K, et al. Preliminary results of a phase I trial of intralesional injection of CpG 7909 in patients with basal cell carcinoma or melanoma. 38th Annual Meetings of the American Society of Clinical Oncology. May 18–21, 2002, Or- lando, Florida, USA.

   76. Vaccine adjuvants. Preparation Methods and research protocols. Ed by DT O’Hagan. Totowa, NJ, USA: Humana Press 2000. 342 p.

   77. van Ojik H, Kruit W, Portielje J, et al. Phase I/II study with CpG 7909 as adjuvant to vaccination with MAGE-3 protein in patients with MAGE-3 positive tumors [abstract]. Ann Oncol 2003; 13: 157.

   78. Verthelyi D, Ishii KJ, Gursel M, et al. Human peripher- al blood cells differentially recognize and respond to two distinct CpG motifs. J Immunol 2001; 166: 2372–7.

   79. Verthelyi D, Kenney RT, Seder RA, et al. CpG oligode- oxynucleotides as vaccine adjuvants in primates. J Immunol 2002; 168: 1659–63.

   80. Verthelyi D, Klinman DM. Immunoregulatory activity of CpG oligonucleotides in humans and nonhuman primates. Clin Immunol 2003; 109: 64–71.

   81. Wagner S, Weber J, Redman T, et al. CPG 7909, a TLR9 agonist immunomodulator in metastatic melanoma: A random- ized phase II trial comparing two doses and in combination with DTIC. 41st Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology. May 13–17, 2005, Orlando, Florida, USA. J Clin On- col 2005; 23 (16 suppl): 7526.

   82. Wagner S, Pashenkov M, Goess G, et al. TLR9-targeted CpG immunostimulatory treatment of metastatic melanoma: A phase II trial with CpG 7909 (ProMune). 40th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, June 5–8, 2004, New Orleans, USA; J Clin Oncol 2004; 22 (14 suppl): 7513.

   83. Wang H, Rayburn E, Zhang R. Synthetic oligodeoxynu- cleotides containing deoxycytidyl-deoxyguanosine dinucleotides (CpG ODNs) and modified analogs as novel anticancer therapeu- tics. Curr Pharm Des 2005; 11 (22): 2889–907.

   84. Wang X-S, Sheng Z, Ruan Y-B, et al. CpG oligodeoxynu- cleotides inhibit tumor growth and reverse the immunosuppres- sion caused by the therapy with 5-fluorouracil in murine hepato- ma. World J Gastroenterol 2005; 11 (8): 1220–4.

   85. Warren TL, Wittrock C, Weiner GL. CpG DNA as mono- therapy for lymphoma: linking innate and adaptive immunity [ab- str]. Blood 2002; 100: 203.

   86. Warren TL, Gahle CE, Weiner GL. CpG oligodeoxynucle- otides enhance monoclonal antibody therapy of a murine lympho- ma. Clin Lymphoma 2000; 1: 57–61.

   87. Weeratna RD, Bourne SM, Sullivan, et al. Combination of a new TLR agonist immunomodulator (CpG 7909) and pacl- itaxel for treatment of metastatic Lewis Lung Carcinoma (LLC). 40th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncol- ogy, June 5–8, 2004, New Orleans, USA; J Clin Oncol 2004; 22 (14 suppl): 7346.

   88. Weigel BJ, Rodeberg DA, Krieg AM, Blazar BR. CpG oli-

1. Weiner GJ, Liu HM, Wooldridge JE, et al. Immunostim- ulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are ef- fective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 10833–7.

2. Whitmore MM, Li S, Falo J, Huang L. Systemic admin- istration of LPD prepared with CpG oligonucleotides inhibits the grows of established pulmonary metastases by stimulating innate and acquired antitumor immune responses. Cancer Immunol Im- munother 2001; 50: 503–14.

3. Wiemann B, Starnes CO. Coley’s toxins, tumor necro- sis factor and cancer research: a historical perspective. Pharmacol Ther 1994; 64: 529–36.

4. Wooldridge JE, Ballas Z, Krieg AM, Weiner GJ. Immu- nostimulatory oligodeoxynucleotides containing CpG motifs en- hance the efficacy of monoclonal antibody therapy of lymphoma. Blood 1997; 89: 2994–8.

5. Wooldridge J, Link BK, Weisdorf DJ, et al. Phase I study of oligodeoxynucleotide CpG 7909 in patients with previously treat- ed non-Hodgkin’s lymphoma. 39th Annual Meeting of the Amer- ican Society of Clinical Oncology, May 31–June 3, 2003, Chica- go, USA; Proc Am Soc Clin Oncol 2003; 22: 210.

6. Yamamoto S, Yamamoto T, Shimada T, etal. DNAfrombacte- ria, butnotvertebrates, inducesinterferons, activates naturalkiller cells and inhibits tumor growth. Microb Immunol 1992; 36: 983–8.

7. Yamamoto S, Yamamoto T, Kataoka T, et al. Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induce IFN and augment IFN-mediated natural killer activity. J Immunol 1992; 148(12): 4072–6.

8. Yi AK. Tuetken R, Redford T, et al. CpG motifs in bacterial DNA activate leukocytes through the pH-dependent generation of reactive oxygen species. J Immunol 1998; 160: 4755–61.

   godeoxynucleotides potentiate the antitumor effects of chemother-

   apy or tumor resection in an orthotopic murine model of rhabdo- myosarcoma. Clin Cancer Res 2003; 9: 3105–14.

   1. Weigel BJ, Nath N, Taylor PA, et al. Comparative analy- sis of murine marrow-derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and maturated with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood 2002; 100 (12): 4169–76.

   2. Weiner GJ, Link BK, Leonard C, et al. Combination of CpG 7909 and rituximab in patients with relapsed or refractory B-cell non-Hodgkin’s lymphoma (NHL): A phase I, open label dose es- calation study of safety and tolerability. 40th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, June 5–8, 2004, New Or- leans, USA; J Clin Oncol 2004; 22 (14 suppl): 6594.