ОСОБЛИВОСТІ МЕТАБОЛІЗМУ ПОЛІАМІНІВ У ТРАНСФОРМОВАНИХ КЛІТИНАХ КРОВІ ХВОРИХ З РІЗНИМИ ФОРМАМИ ЛЕЙКЕМІЇ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-23-4-2021-g.10067

Поліаміни (ПА) — позитивно заряджені аміни, що містяться у клітинах всіх організмів. До основ­них ПА, що продукуються у клітинах ссавців, належать путресцин, спермідин та спермін. Внутрішньоклітинні рівні ПА залежать від активності їх біосинтетичних та катаболічних ферментів, а також від статусу поліамінних транспортерів. Біосинтез цих полікатіонів контролюється орнітиндекарбоксилазою (ОДК), S-аденозилметионіндекарбоксилазою (S-АМДК), спермідинсинтазою та спермінсинтазою, а деградація — N1-спермідин/спермін-ацетилтрансферазою (ССАТ), поліаміноксидазою (ПАО) та сперміноксидазою (СМО) [1]. На рис.1 представлено схему метаболізму ПА.

У світовій літературі є безліч даних про роль ПА у регуляції процесів проліферації та росту, диференціації та спеціалізації клітин, їх виживання або загибелі (апоптоз). Різноманітні порушення метаболізму ПА відіграють важливу роль у таких патологічних процесах, як дисдиференціація та малігнізація, ріст та прогресія пухлин, запалення, імунологічна реактивність та ін. [2].

У більшості ракових клітин спостерігається висока активність ферментів синтезу ПА (орнітиндекарбоксилази (ОДК) та S-АМДК) та високі рівні путресцину і спермідину, що сприяє проліферації та злоякісній трансформації клітин [1, 3]. Однак те, як ракові клітини активують цей метаболічний шлях, і молекулярні ознаки, що стоять за онкогенною дією ПА, дотепер головним чином залишаються до кінця незрозумілими.

Онкогематологічні хвороби людини належать до групи захворювань, за яких порушення метаболізму ПА вивчені недостатньо. У той же час досить широко досліджували метаболізм ПА в лейкемічних клітинах під час розвитку перещеплених лейкемічних штамів у експериментальних тварин та вивчали вплив інгібіторів обміну ПА на ріст таких пухлин in vivo. Зокрема, нами було показано, що різні штами експериментальних пухлин, у тому числі лімфоїдні лейкози у мишей, відрізняються між собою за чутливістю до інгібіторів ферментів синтезу ПА та комбінацій таких інгібіторів [1, 4].

Що стосується вивчення ролі ПА та ферментів їх метаболізму в лейкемічних клітинах людини, то у наявних публікаціях містяться лише фрагментарні відомості з цього питання і бракує даних щодо можливості використання показників обміну ПА як маркерів для уточненої диференціальної діагностики лейкемій, хоча деякі дослідження в цьому напрямку вже проведено [5–8]. Виявлено, що у фракції мононуклеарів периферичної крові (МПК) пацієнтів із хронічним мієлолейкозом (ХМЛ) активність ОДК достовірно перевищує аналогічний показник практично здорових людей [5]. У МПК хворих на ХМЛ у фазі акселерації активність ОДК суттєво підвищувалася порівняно з такою у пацієнтів із ХМЛ у хронічній фазі. Високі показники ОДК було виявлено у пацієнтів, хвороба яких протягом 24 міс прогресувала і переходила у фазу акселерації порівняно з особами без прогресії захворювання. Автори цієї роботи вважають, що активність ОДК відображає проліферативну активність клітин і може слугувати додатковим прогностичним маркером ХМЛ [5]. Виявлено, що висока активність CCАТ корелює з кількістю лейкемічних клітин при мієлоїдних формах лейкемії, тоді як у разі лімфоїдних форм такої кореляції не спостерігали [6]. Показано, що для мононуклеарів пацієнтів з резистентним до хіміотерапії ХМЛ характерна висока активність І ферменту синтезу ПА — аргінази [7]. На противагу цьому, за даними інших авторів, у пацієнтів з В-клітинним хронічним лімфолейкозом (В-ХЛЛ) активність аргінази у МПК була вдвічі нижчою, ніж у В-лімфоцитах у нормі. Протилейкемічна терапія сприяла нормалізації аргіназної активності [8].

Іншим перспективним напрямком досліджень ПА при злоякісних захворюваннях кровотворної та лімфоїдної систем є вивчення можливостей застосування нових ефективних препаратів (на основі інгібіторів синтезу ПА та їх аналогів) для лікування хворих на лейкемію. Незважаючи на брак даних щодо особливостей метаболізму ПА у лейкозних клітинах різного генезу людини, уже є деякий позитивний досвід терапії пацієнтів з лейкозами із застосуванням інгібіторів біосинтезу ПА, зокрема, α-дифторметилорнітину та метил-гліоксаль(біс)гуанілгідразону [9].

Було проведено також передклінічні та клінічні випробування інгібіторів різних стадій біосинтезу ПА, аналогів ПА, або поліамінів, ковалентно сполучених з протилейкемічними лікарськими препаратами задля їх цільової доставки в лейкемічні клітини через систему активного транспорту ПА [10]. Ці дослідження показали обнадійливі результати і наразі продовжуються, зокрема у Франції, Великій Британії та Швейцарії.

Логічно припустити, що для досягнення більш істотного успіху потрібно розуміти специфічні особ­ливості метаболізму ПА при різних формах лейкозів. Для ефективної протипухлинної дії інгібіторів обміну ПА або їх аналогів вкрай необхідні знання метаболізму ПА в лейкозній клітині, оскільки в трансформованих клітинах при різних формах захворювання та різній агресивності процесу характер змін метаболізму ПА може істотно відрізнятися. Результати дослідження обміну ПА в клітинах хворих на різні форми лімфолейкемії можуть бути використаними як для уточненої диференціальної діагностики цих патологічних процесів і, тим самим, для індивідуалізації протилейкемічної терапії. Тільки такі знан­ня, на нашу думку, можуть забезпечити успіх у лікуванні з застосуванням препаратів, мішенню для яких є ті чи інші ланки метаболізму ПА.

Метою цього дослідження було оцінити можливість використання показників обміну ПА для уточненої діагностики та прогнозу перебігу різних форм лейкемії.

ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

На клінічному матеріалі (фракція МПК) 225 хворих з різними формами і цитологічними варіантами лейкозу (В-клітинний хронічний лімфолейкоз (В-ХЛЛ) — 82, гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ М1–М5) — 65, гострі В- і Т-лімфобластні лейкози (В- і Т-ГЛЛ) — 48, неходжкінські лімфоми (НХЛ) — 30 хворих) та 10 практично здорових людей (донорів) досліджено активність/експресію ферментів синтезу ПА (аргінази та ОДК), а також рівні ПА.

Вік обстежених хворих — 21–89 років. Діагнози за морфологічними, цитохімічними та імуноцитохімічними критеріями було верифіковано у відділі онкогематології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького Національної академії наук України (завідувач відділу — професор Д.Ф. Глузман) [11]. Хворих було поінформовано щодо мети проведення досліджень і вони надали згоду на використання клінічного матеріалу в наукових цілях.

З периферичної крові пацієнтів класичним методом центрифугування у градієнті фікол-урографіну (d=1,076–1,078 г/см3) виділяли фракцію МПК, яка містила у хворих на В-ХЛЛ приблизно 86,0% трансформованих В-лімфоцитів, у хворих на ГМЛ М5 — 70,0–80,0% монобластів, у пацієнтів з В-ГЛЛ‒38,0–90,0% бластів. Виділену фракцію використовували для подальших біохімічних досліджень. В-лімфоцити донорів отримували з МПК з використанням еритроцитів барана шляхом видалення спонтанно утворених Є-розеток, нехтуючи незначною домішкою моноцитів у кінцевій суспензії. Кількість клітин підраховували в камері Горяєва.

Вміст ПА визначали методом високоефективної рідинної хроматографії за допомогою хроматографа Agilent 1200 (США) із застосуванням методу [12] з нашими модифікаціями. Для цього ПА після їх екстракції зі зразків піддавали дансилюванню за допомогою дансилхлориду. У якості стандартів служили гідрохлориди ПА виробництва Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Для визначення рівнів експресії ОДК і аргінази I застосовували методи гель-електрофорезу та Western blotting аналізу білкових препаратів (екстрактів клітин), денатурованих за допомогою SDS, визначення проводили за модифікованою методикою Леммлі [13]. Екстракти готували згідно з методом М. Sovak [14]. Визначення концентрації загального білка в зразках проводили за допомогою методу Бредфорда [15]. Дані Western blotting аналізу були математично оброблені за допомогою комп’ютерної програми TotalLab. Активність аргінази вимірювали методом [16] і виражали в мікромолях виробленої сечовини (25•10³ клітин/год).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили, використовуючи t-критерій Стьюдента. Достовірними вважали розбіжності за p ≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У дослідженнях активності аргінази в лейкемічно трансформованих клітинах хворих з різними формами лейкозів (В-ХЛЛ, ГМЛ М1–М5, В-ГЛЛ) і НХЛ виявили значну варіабельність як активності, так і експресії білка цього ферменту [17]. Найвищою активність аргінази була у МПК хворих на В-ХЛЛ, а найнижчі показники активності аргінази спостерігали у фракції бластних клітин хворих на В-ГЛЛ (рис. 2). Як показано нами раніше, рівні експресії білка аргінази найвищими також були у МПК хворих на В-ХЛЛ [17]. Окрім того, рівні активності аргінази у МПК хворих з різними формами лейкозу суттєво відрізнялися від показників активності ферменту в лімфоцитах практично здорових людей та були на 16,0–52,0% нижчими, ніж у загальному пулі МПК практично здорових осіб, і на 39–82% нижчими, ніж у фракції В-лімфоцитів практично здорових осіб.

Дослідження рівня експресії білка гена ОДК проведено у МПК хворих на В-ХЛЛ, ГМЛ М5 та НХЛ. Найвищі рівні експресії ОДК спостерігали в МПК хворих на ГМЛ М5 (рис. 3).

Було також показано, що рівні експресії ОДК у МПК хворих на В-лімфому мантійної зони (В-ЛМЗ) залежали від прогресування хвороби (рис. 4). Як видно з представлених даних, для хворих на В-ЛМЗ без лейкемізації процесу характерним був низький рівень експресії ОДК. При лейкемізації значення експресії ОДК більш ніж у 2,4 раза перевищували показники хворих без лейкемізації.

Рівні експресії ОДК в МПК хворих на Т-лімфобластний лейкоз/лімфому (Т-ЛЛ/Л) були приблизно такими ж, як у хворих на В-ЛМЗ при лейкемізації процесу. У хворих на Т-пролімфоцитарний лейкоз рівні експресії ОДК були значно нижчими, ніж у пацієнтів з Т-ЛЛ/Л, і практично не відрізнялися від значень у хворих на В-ЛМЗ за відсутності лейкемізації.

Наступним нашим завданням було дослідити рівні ПА у трансформованих клітинах крові хворих з різними формами лейкозу та у МПК і фракції В-лімфоцитів практично здорових людей.

Достовірної різниці у рівнях ПА і співвідношенні спермідин/спермін у МПК та фракції В-лімфоцитів практично здорових людей не виявлено (табл. 1). Величина молярного співвідношення спермідину до сперміну у МПК становила 0,25 ± 0,03 ум.од., а у фракції В-лімфоцитів — 0,22 ± 0,04 ум.од.

У хворих з різними формами лейкозу рівні ПА в МПК суттєво відрізнялися. Найменші відмінності у рівнях ПА у порівнянні з донорами спостерігали у хворих з В-ХЛЛ. У пацієнтів цієї групи, порівняно з донорами, виявлено лише суттєве зниження (на 50,0%) рівня ацетильованого путресцину та зростання на 28,0% вмісту спермідину. Вміст інших фракцій ПА (путресцину, ацетильованого спермідину та сперміну) практично не відрізнявся від контрольних значень у фракції В-лімфоцитів практично здорових осіб. Внаслідок збільшення вмісту спермідину спостерігали зростання показника молярного співвідношення спермідин/спермін (0,31 ± 0,03 проти 0,22 ± 0,02 у практично здорових осіб; p <0,05).

У МПК хворих на гострі В-лімфобластні лейкози (В-ГЛЛ), у порівнянні з хворими на В-ХЛЛ, суттєво зменшувалася кількість сперміну і ацетильований спермідин (рис. 5) та зростав показник співвідношення спермідин/спермін (0,43 ± 0,02 порівняно з 0,31 ± 0,03 у хворих на В-ХЛЛ, p <0,05).

Значну різницю у рівнях ПА спостерігали у МПК хворих на В-ГЛЛ за наявності та за відсутності коекспресії мієлоїдного антигену CD13. У хворих на В-ГЛЛ з коекспресією CD-13 відсутні ацетильовані форми путресцину і спермідину, був різко знижений рівень сперміну та високі значення показника спермідин/спермін (табл. 2).

*p<0,05 — у порівнянні з В-ГЛЛ з коекспресією CD13.

У МПК хворих на ГМЛ М4 і М5 визначали високі рівні путресцину, спермідину, сперміну і ацетильований путресцин. Характерним для МПК хворих на ГМЛ без ознак дозрівання та з мінімальними ознаками диференціювання — ГМЛ М1-М2 була відсутність ацетильованих форм путресцину і спермідину, найнижчі серед усіх хворих на ГМЛ рівні сперміну та найвищі значення індексу спермідин/спермін (табл. 3).

*p<0,05 — у порівнянні з ГМЛ М4 та ГМЛ М5.

Проведено порівняльний аналіз рівнів ПА у МПК хворих на НХЛ, а саме: у 9 хворих на В-ЛМЗ при лейкемізації процесу та за відсутності лейкемізації, 8 хворих на В-лімфому з малих лімфоцитів/В-ХЛЛ, 3 хворих на дифузну В-крупноклітинну лімфому, 7 хворих на В-пролімфоцитарний лейкоз, 3 хворих на Т-ЛЛ/Л. У хворих з різними гістологічними типами НХЛ рівні ПА у МПК суттєво відрізнялися (рис. 6).

Для МПК хворих на В-ЛМЗ за відсутності лейкемізації процесу характерним був низький рівень путресцину, високий спермін та низьке (0,13) значення показника молярного співвідношення спермідин/спермін (рис. 7).

У той же час за наявності лейкемізації в МПК хворих на В-ЛМЗ рівні спермідину і путресцину були відповідно в 3,3 та 8,6 раза вищими, а рівень сперміну був знижений у 1,6 раза. Значення індексу спермідин/спермін підвищувалося до 0,69. Імовірно, що ці показники, поряд з імуноцитохімічними та іншими даними, можуть бути додатковими маркерами активізації процесу у хворих на В-ЛМЗ.

Варто зазначити, що серед обстежених хворих на НХЛ найвищі рівні путресцину, найнижчі рівні сперміну та найвищі значення індексу спермідин/спермін спостерігали у хворих на В-пролімфоцитарний лейкоз та Т-лімфобластний лейкоз/лімфому. Для хворих на В-пролімфоцитарний лейкоз був характерним високий лейкоцитоз (140–150•10⁹), а кількість пролімфоцитів становила 90,0–93,0%. У хворих на Т-лімфобластний лейкоз/лімфому також виявляли високий лейкоцитоз (147–150 •10⁹), кількість бластів становила 67,0–70,0%.

Таким чином, проведені дослідження свідчать про наявність у фракції МПК хворих з різними формами і цитологічними варіантами лейкозів значних відмінностей у системі метаболізму ПА. Аналіз отриманих даних продемонстрував, що рівні активності/експресії аргінази і ОДК, ПА (сперміну, спермідину та путресцину) та значення співвідношення спермідин/спермін можуть бути використані як додаткові маркери для уточненої діагностики різних цитологічних варіантів лейкозу. З певною обережністю також можна констатувати, що деякі показники метаболізму поліамінів можуть відображати ступінь активізації процесу і визначення їх може бути корисним для прогнозу прогресії захворювання. Зокрема, рівень експресії ОДК, рівні сперміну, спермідину, путресцину та значення індексу спермідин/спермін, поряд з імуноцитохімічними даними, можуть бути додатковими маркерами активізації хвороби у пацієнтів з В-ЛМЗ.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що активність аргінази в МПК пацієнтів при всіх досліджених формах лейкозу є достовірно вищою, ніж у практично здорових людей; активність аргінази та експресія білка аргінази в МПК хворих на В-ХЛЛ достовірно вищі у порівнянні з іншими формами лейкозів.

2. Рівні експресії ОДК у МПК хворих на В-ЛМЗ залежать від прогресування хвороби: при лейкемізації значення експресії ОДК були більш ніж у 2,4 раза вищими у порівнянні з такими за відсутності лейкемізації.

3. У хворих з різними формами лейкозу рівні ПА у МПК суттєво відрізнялися. Найменші відмінності у рівнях ПА порівняно з донорами спостерігали у хворих на В-ХЛЛ.

4. Встановлено, що у МПК хворих на В-ГЛЛ, у порівнянні з В-ХЛЛ, значно нижчі рівні сперміну і ацетильованого спермідину та вищі, ніж при В-ХЛЛ, значення показника спермідин/спермін.

5. Для МПК хворих на ГМЛ М4 і М5 характерні високі рівні путресцину, спермідину, сперміну і ацетильованої форми путресцину. Характерним для МПК хворих на ГМЛ М1-М2 була відсутність ацетильованих форм путресцину і спермідину, найнижчі серед усіх хворих на ГМЛ рівні сперміну та найвищі значення індексу спермідин/спермін.

6. Рівні ПА та індекс спермідин/спермін у різних груп хворих на НХЛ суттєво відрізняються. Для МПК пацієнтів з В-ЛМЗ за наявності процесу лейкемізації характерні значно вищі рівні путресцину, спермідину (у 3,3 та 8,6 раза відповідно) та високий індекс спермідин/спермін, порівняно з такими за відсутності лейкемізації.

7. Найвищі рівні путресцину та найвищі показники індексу спермідин/спермін виявлено у хворих на Т-лімфобластний лейкоз/лімфому та В-пролімфоцитарний лейкоз (3,78 та 3,20 відповідно).

ПОДЯКА

Висловлюємо щиру подяку співробітникам відділу онкогематології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України і особисто — завідувачу відділу, професору Д.Ф. Глузману за люб’язно надані зразки крові пацієнтів і консультативну підтримку.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Zaletok SP. Polyamines — markers of tumor growth and targets for anticancer therapy. DBiolSci (14.01.07) thesis. Kyiv, 2007. 37 p. (in Ukrainian).

2. Bae D-H, Lane DJ R, Jansson PJ, Richardson DR. The old and new biochemistry of polyamines. Biochim Biophys Acta Gen Subj 2018; 1862 (9): 2053–68.

3. Jiajing Li, Yan Meng, Xiaolin Wu, Yuxin Sun. Polyamines and related signaling pathways in cancer. Cancer Cell International 2020; 20: 539–55.

4. Zaletok SP, Berdinskikh NK, Lyalyushko NM, et al. Effect of α-diphluoromethylornithine and polyhexamethyleneguanidine — inhibitors of the polyamines biosynthesis on the kinetics of leukemia L1210 growth and the lifetime of animals. Líkars’ka sprava (Vrachebnoye delo) 2005; 8: 76–83. (in Ukrainian)

5. Tipathi AK, Chaturvedi R, Ahmad R, et al. Peripheral blood leukocytes ornithine decarboxylase activity in chronic myeloid leukemia patients: prognostic and therapeutic implications. Leukemia Res 2002; 26 (2): 349–54.

6. Pirnes-Karhu S. Spermidine/spermine N1-acetyltransferase in mouse hematopoiesis and bone remodeling and in human leukemias. Dis in Health Sciences. University of Eastern Finland, Tampere 2013: 1–73.

7. Ahmed MM, Said ZS, Montaser SA. Chronic myelogenous leukemia: cytogenetic and biochemical consequences and applications for diagnosis and judgment. J Cytol Histol 2014; S4: 015. doi: 10.4172/2157–7099.S4–015.

8. Konarska L, Widzynska I, Zienkiewicz H, Sulek K. Arginase activity alterations in peripheral blood lymphocytes in the human chronic lymphocytic leukemia. Acta Biochim Polonica 1993; 40 (1): 160–3.

9. Arruabarena-Aristorena A., Zabla-Letona A., Carracedo A. Oil for the cancer engine: the cross-talk between oncogenic signaling and polyamine metabolism. Science Advances 2018; 4 (1): 2606–17.

10. Boyé P, Floch F, Serres F, et al. Randomized, double-blind trial of F14512, a polyamine-vectorized anticancer drug, compared with etoposide phosphate, in dogs with naturally occurring lymphoma. Oncotarget 2020; 11 (7): 671–86.

11. Gluzman DF, Sklyarenko LM, Koval SV, et al. Diagnostics of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. Kyiv: DIA, 2017: 64 p. (in Ukrainian)

12. Gerbaut L. Determination of erythrocytic polyamines by reversed-phase liquid chromatography. Clin Chem 1991; 37 (12): 2117–20.

13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680–5.

14. Sovak M, Bellas R, Kim D, et al. Aberrant nuclear factor-kB/Rel expression and pathogenesis of breast cancer. J Clin Invest 1997; 100: 2952–60.

15. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annal Biochem 1976; 72: 248–54.

16. Corraliza IM, Campo ML, Soler G, Modolell M. Determination of arginase activity in macrophages: a micromethod. J Immunol Methods 1994; 174 (1–2): 231–5.

17. Gogol SV, Yanish YuV, Zaletok SP, Ivanivska TS. Arginase activity and expression in the peripheral blood cells of patients with the different forms of leukemia. Oncology 2018; 20 (4): 265–8 (in Ukrainian).

Адреса для листування:
Залєток С.П.
Київ, 03022, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: sophiazaletok@ukr.net

Одержано: 3.06.2021