ЭКСПРЕССИЯ ОНКОБЕЛКА Е6 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА В ЭПИТЕЛИИ ПРИДАТКОВ МАТКИ ПРИ РАКЕ ЯИЧНИКА И ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НЕМУ

ВВЕДЕНИЕ

Злокачественные новообразования яичника вследствие их тяжелого клинического течения и высокой смертности больных остаются одной из важных проблем онкогинекологии практически во всех странах мира [13]. В последнее десятилетие решение вопросов этиологии, ранней диагностики и профилактики рака яичника (РЯ) связывают в первую очередь с медико-генетическими исследованиями, направленными на изучение генетической предрасположенности к развитию злокачественного процесса в яичниках [4]. Согласно современным представлениям, наследственный фактор риска развития РЯ, 5–10% случаев которого обусловлены мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, является одним из наиболее значимых [1, 17]. Кроме того, наличие в родословной пробанда 2 родственниц I степени родства, больных РЯ, также повышает риск возникновения новообразований яичников у членов этой семьи [19]. Следует отметить, что в США и некоторых странах Европы наличие мутаций в генах BRCA1/2 и отягощенность семейного анамнеза по раку молочной железы (РМЖ) и яичника являются основанием для профилактической сальпингоовариоэктомии [12].

В то же время этиопатогенез РЯ изучен еще недостаточно: открытым остается вопрос о значении и соотношении наследственных, а также внешнесредовых факторов в развитии этого новообразования. Иccледование, проведенное на культурах клеток поверхностного эпителия яичника женщин с генетической предрасположенностью к РЯ, показало наличие тканеспецифической генетической нестабильности

этих клеток и высокую их чувствительность к алкилирующим агентам, в частности митомицину С [20]. По мнению авторов, эти особенности обусловливают повышенную восприимчивость поверхностного эпителия яичника к действию внешнесредовых факторов, в том числе и вирусной природы.

В настоящее время установлена этиологическая связь ВПЧ с развитием рака шейки матки (РШМ) и других аногенитальных опухолей. Трансформирующее влияние онкогенных типов ВПЧ (16, 18, 31,

33, 35, 39, 45 и др.) обеспечивается функционированием онкогенов Е6 и Е7 [18]. Продукты этих генов нарушают функции клеточных белков, являющихся ключевыми регуляторами клеточного цикла. Так, онкобелок Е6 связывает белок р53, что приводит к деградации последнего путем убиквитин-зависимого протеолиза, следствием чего является нарушение механизмов, обеспечивающих контроль пролиферации, апоптоза и репарации ДНК. Кроме того, взаимодействие белка Е6 с теломеразой также способствует повышению пролиферативной активности клеток. Механизм действия онкобелка Е7 связан с функциональной инактивацией опухолевого супрессора pRb, в результате чего высвобождается транскрипционный фактор E2F, активирующий гены, белковые продукты которых стимулируют вход клетки в S-фазу клеточного цикла [18]. Данные о наличии вирусных последовательностей в клетках РЯ не многочисленны, а вопрос о значении ВПЧ в развитии РЯ остается спорным. Многие ученые не исключают роли папилломавирусного инфицирования в патогенезе этого новообразования [2, 3, 10, 24]. Исследования инфицирования

ВПЧ эпителиальных клеток верхнего отдела генитального тракта у женщин с генетической предрасположенностью к РЯ не проводились.

Цель работы состояла в изучении экспрессии онкобелка Е6 ВПЧ 16 и 18 типов, а также белка р53 в образцах маточных труб и яичников женщин с генетической предрасположенностью к развитию РЯ и больных РЯ.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на операционном материале маточных труб и яичников 20 женщин, которым провели профилактическую сальпинго-овариоэктомию в связи с высоким риском развития РЯ, и 55 больных серозным РЯ. Образцы операционного материала женщин с высоким риском развития РЯ были получены из Медицинского университета штата Орегон (США). Согласно US Preventive Services Task Force Recommendation, пациенок причислили к группе высокого риска на основании одного из следующих критериев [19]: а) наличие мутаций в генах BRCA1/2; б) наличие в семье пробанда 1 и более родственниц І степени родства (мать, дочь, родная сестра) с диагнозом РЯ в возрасте до 50 лет; в) наличие в семье пробанда 1 родственницы І степени родства с диагнозом РЯ, а также 1 и более родственниц ІІ степени родства (бабушка, внучка, двоюродная сестра, тетя, племянница) с диагнозом РМЖ или РЯ; г) РМЖ у пробанда и наличие в родословной 1 и более родственниц І и ІІ степени родства с диагнозом РМЖ или РЯ. Больные РЯ находились на лечении в отделении онкогинекологии Национального института рака МЗ Украины (зав. отделением – д.мед.н., проф. Л.И. Воробьева). Средний возраст пациенток высокого риска развития РЯ и больных РЯ на момент хирургического вмешательства составил 45,0 ± 2,7 (26–74) и 50,7 ± 1,9 (16–79) года соответ-

ственно. Все пациентки дали информированное со-

гласие на включение в исследование.

Операционный материал фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина. Верификацию диагноза проводили на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Морфологически исследовали оба яичника. Иммуногистохимическое выявление Е6 ВПЧ 16 и

18 типов, а также белка р53 проводили на парафиновых срезах с использованием МкАТ к HPV16 E6+HPV18 E6 в разведении 1:100 (clone C1P5, «AbCam») и р53 (clone DO7, «DaKoCytomation»). При проведении иммуногистохимической реакции пользовались стандартным одноэтапным протоколом с демаскировкой антигена высокотемпературной обработкой (мощность — 700 w) в цитратном буфере (рН 6,0). Визуализацию осуществляли с помощью системы EnVision и красителя диаминбензидина («DakoCytomation»). Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Результат иммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом путем подсчета процента положительно окрашенных клеток — индекс метки (ИМ, %). Экспрессию

Е6 считали негативной при отсутствии окрашивания; фокальной — при наличии 10–30% окрашенных клеток, расположенных в отдельных участках эпителия; диффузной — при наличии более 30% окрашенных клеток, расположенных по всему эпителию. Экспрессию р53 считали низкой при значении ИМ ниже медианы, высокой — при значении ИМ выше медианы. В качестве позитивного контроля (ДНК ВПЧ 16+) использовали гистологические срезы цервикальной интраэпителиальной неоплазии ІІІ степени.

Оценку достоверности различий между группами проводили с помощью непараметрического двустороннего критерия Фишера в программе Statistica 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ анамнестических и генеалогических данных 20 пациенток с генетической предрасположенностью к РЯ подтвердил отягощенность их родословной по РМЖ и/или РЯ. При генетическом тестировании у 5 из них было установлено наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 (рис. 1).

Рис. 1. Родословная пробанда М., 40 лет, из субэтнической группы евреев Ашкенази. У пробанда и двоюродной сестры пробанда выявлена мутация в гене BRCA1 (187delAG). Родственницы пробанда Іи ІІ степени родства (мать, двоюродная сестра, бабушка) болели РМЖ и РЯ. Мать пробанда умерла от первично-множественного РМЖ и РЯ в возрасте 40 лет. Примечание: пробанд отмечена стрелкой. Арабскими цифрами указан возраст возникновения заболевания, римскими — поколения, ? — возраст неизвестен

При анализе морфологических особенностей профилактически удаленных яичников у женщин с высоким риском РЯ выявили наличие множественных фолликулярных, серозных, инклюзионных кист, кист желтого тела, железистых структур с эпителием серозного типа, гиперплазии тека-ткани, поверхностного папиллоза и фиброматоза. Характерным для фолликулярных и инклюзионных кист яичников у женщин с мутацией в генах BRCA1/2 было наличие на их стенках сосочковых разрастаний, эпителиальный покров которых отличался признаками гиперплазии. Поликистоз яичников диагностировали у 5 пациенток. При гистологическом исследовании маточных труб у женщин высокого риска выявлено склероз ворсинок с очагами ги-

перплазии эпителия отдельных ворсинок, также отмечались паратубарные кисты.

Результаты морфологического исследования операционного материала больных РЯ показали, что все новообразования были серозными карциномами разной степени дифференцировки: 4 – высоко(G1), 26 – умеренно(G2) и 25 – низкодифференцированными (G3).

У женщин с генетической предрасположенностью к РЯ белок Е6 ВПЧ 16/18 обнаружен в 12 (60%) случаях, в том числе у 4 женщин с РМЖ в анамнезе и у 2 женщин-евреек Ашкенази с наличием мутации в гене BRCA1. При этом отмечали как ядерную, так и цитоплазматическую локализацию белка. У 4 женщин экспрессию Е6 выявили только в эпителии маточных труб, у 8 — в эпителии маточных труб и яичников. При исследовании характера экспрессии Е6 диффузное окрашивание обнаружили в эпителии маточных труб (рис. 2), фокальное — в гиперплазированном и неизмененном поверхностном эпителии яичников, гранулезных клетках фолликулов (рис. 3), эпителии фолликулярных кист (рис. 4) и железистых структурах яичников с эпителием серозного типа (рис. 5).

Рис. 2. Фрагмент маточной трубы. Диффузная экспрессия онкобелка Е6 ВПЧ 16/18 в ворсинках маточной трубы и эндотелии капилляров. Стрелками указаны «светлые» клетки, являющиеся, по данным литературы, показателями ВПЧассоциированных изменений эпителиальных клеток. Ув. х 400

Рис. 3. Экспрессия онкобелка Е6 ВПЧ 16/18 в гранулезных клетках первичного фолликула яичника. Ув. х 100

Рис. 4. Экспрессия онкобелка Е6 ВПЧ16/18 в эпителии фолликулярной кисты. Ув. х 400

Рис. 5. Экспрессия онкобелка Е6 ВПЧ 16/18 в железистых структурах яичника с эпителием серозного типа. Ув. х 400

Следует обратить внимание на то, что в эпителии маточных труб, экспрессирующем белок Е6, выявляли светлые клетки с пикнотичными ядрами, подобные койлоцитам, которые отмечают в эпителии шейки матки при инфицировании ВПЧ. Эти клетки локализовались как в базальном слое эпителия, так и в толще эпителиального пласта (см. рис. 2). Согласно литературным данным, действие ВПЧ на клетку проявляется цитопатическим эффектом, вследствие чего обнаруживаются койлоциты (с увеличенными ядрами, неровной складчатой мембраной и гиперхроматозом), наличие которых служит показателем ранних ВПЧ-ассоциированных морфологических изменений эпителиальных клеток [14]. На основании последнего и выявленной нами экспрессии белка Е6 в эпителии маточных труб можно заключить, что наличие койлоцитоподобных клеток — объективный показатель инфицирования ВПЧ.

Позитивная экспрессия Е6 была отмечена также в эндотелиальных клетках сосудов маточных труб (см. рис. 2) и яичников женщин группы высокого риска РЯ, что очевидно свидетельствует о тропности ВПЧ к эндотелию сосудов и возможном гематогенном пути диссеминации вируса.

Результаты иммуногистохимического исследования опухолевого супрессора р53 у женщин высокого риска развития РЯ установили отсутствие экспрессии этого белка в ткани маточных труб и яичников, в клетках которых обнаружен онкобелок Е6 ВПЧ. В то же время в 2 ВПЧ Е6-негативных наблюдениях у пациенток с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 экспрессия белка р53 отмечалась в эпителии кистозных образований яичников (ИМ р53 — 30,2 и 62,1%) и в эпителии ворсинок маточных труб (ИМ р53 — 4,8 и 9,8%).

В группе больных серозным РЯ белок Е6 был экспрессирован в 9 из 55 (16,3%) случаев, что достоверно ниже, чем в случаях высокого риска РЯ (р=0,01). Выявленная нами частота инфицирования ВПЧ 16/18, определенная по экспрессии вирусного онкобелка Е6, согласуется с данными некоторых европейских авторов, обнаруживших наличие этих типов ВПЧ в опухолевых клетках в 4,2–37,5% случаев РЯ [2, 3, 10]. В 7 случаях серозного РЯ окрашивание было диффузным, в 2 — фокальным. Во всех случаях также отмечали как ядерную, так и цитоплазматическую локализацию белка. Следует обратить внимание на то, что Е6 экспрессировался только в умеренно(66,7%) и низкодифференцированных (33,3%) серозных карциномах яичника.

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии р53 был получен положительный результат в 86,8% случаев РЯ. Необходимо отметить, что в новообразованиях яичника выявили значительную вариабельность количества клеток, экспрессирующих р53 (4,0–73,0%), медиана экспрессии р53 составила 30,0%. Низкая экспрессия (ИМ ≤ 30,0%) р53 установлена в 37,7%, а высокая (ИМ > 30,0%) — в 49,1% случаев серозного РЯ (рис. 6), при этом средний уровень экспрессии у больных РЯ — 31,2 ± 2,9%.

Рис. 6. Распределение больных РЯ (%) по экспрессии белка р53

Обращает внимание зависимость экспрессии опухолевого супрессора р53 от наличия и особенностей экспрессии онкобелка Е6 в клетках серозного РЯ. Так, в серозных карциномах, в клетках которых обнаружен онкобелок Е6 ВПЧ, уровень экспрессии р53 (ИМ 19,6 ± 4,08%) достоверно ниже,

чем в опухолях с отсутствием вирусного онкобелка (ИМ — 33,4 ± 3,2%) (р=0,04) (таблица).

Таблица Экспрессия опухолевого супрессора р53 в зависимости от особенностей экспрессии онкобелка Е6 ВПЧ в клетках серозного РЯ

Более того, в новообразованиях с фокальной локализацией онкобелка Е6 ВПЧ экспрессия белка р53 была высокой и составила 53,0 и 39,0%. В отличие от этого в опухолях яичников с диффузной локализацией онкобелка Е6 (рис. 7) отмечалась негативная и низкая экспрессия р53 (ИМ 0,0–26,0%) (рис. 8).

Рис. 7. Диффузная экспрессия онкобелка Е6 ВПЧ 16/18 в клетках серозного РЯ. Ув. х 400

Рис. 8. Низкая экспрессия р53 в серозном РЯ с диффузной локализацией онкобелка Е6 ВПЧ 16/18. Ув. х 400

Таким образом, анализ экспрессии онкобелка Е6 позволил установить высокую частоту инфицирования ВПЧ 16/18 в неизмененном эпителии придатков матки у пациенток с генетической предрасположенностью к РЯ и достоверно более низкий уровень инфицирования клеток опухоли у больных серозным РЯ. Высокая инфицированность ВПЧ эпителия яичников в случаях высокого риска, вероятнее всего, обусловлена нестабильностью генома этих

клеток, определяющей их чувствительность к действию внешнесредовых факторов. Подтверждением последнего являются особенности некоторых наследственных синдромов хромосомной нестабильности, в частности анемии Фанкони, при которой в более чем 80% случаев развитие карцином аногенитального тракта ассоциировано с инфицированием онкогенными типами ВПЧ [16]. Это дает основания предположить, что инфицирование ВПЧ поверхностного эпителия яичников женщин с генетически обусловленным риском РЯ может быть дополнительным экзогенным индуктором трансформации эпителиальных клеток яичников. Не исключено, что выявление белка Е6 в гранулезных клетках фолликулов отражает их возможное участие в поддержании продуктивного жизненного цикла ВПЧ, поскольку, согласно данным [21], в культуре эпителия яичников человека клетки продуцируют ряд белковых продуктов (AP-1, Sp-1, Oct-1, NF-1), характерных для эпителиоспецифической транскрипции ранних генов ВПЧ. Кроме того, гранулезные клетки фолликулов могут являться резервуаром вирусных частиц, которые при разрыве стенки овулирующего фолликула достигают поверхностного эпителия яичников и таким образом вызывают локальную инфекцию. Не исключено, что локальные воспалительные процессы в поверхностном эпителии яичников, инициируемые овуляцией, наряду с инфицированием ВПЧ способны провоцировать возникновение кистозных образований и повышать риск малигнизации эпителия [9].

В настоящее время установлено, что такой экзогенный фактор как ВПЧ является промотором злокачественной трансформации пролиферирующего эпителия, поскольку белковые продукты его онкогенов Е6 и Е7 нарушают функции ключевых регуляторов клеточного цикла р53 и pRb [18]. Кроме того, в результате многочисленных экспериментальных исследований ВПЧ-ассоциированных новообразований была установлена резистентность мутантной формы белка р53 к деградирующему действию онкобелка Е6 ВПЧ путем убиквитин-зависимого протеолиза [22, 23].

Выявленное в нашем исследовании отсутствие экспрессии белка р53 в клетках серозного РЯ, экспрессирующих онкобелок Е6 ВПЧ, по-видимому свидетельствует об его ингибирующем действии на белок-супрессор. Эти результаты согласуются с немногочисленными данными других исследователей, показавших инактивацию белка р53 вследствие его взаимодействия с онкобелком Е6 ВПЧ 16 типа в новообразованиях яичника и молочной железы [15, 11]. Следует отметить, что использованное в нашей работе МкАТ (clone DO7) визуализирует белковый продукт как «дикого», так и мутантного гена ТР53. Поэтому отсутствие белка р53 в клетках серозного РЯ с диффузной локализацией онкобелка Е6 ВПЧ, вероятнее всего, связано с взаимодействием Е6 с

«дикой» формой р53. В то же время низкий или вы-

сокий уровень экспрессии онкосупрессора р53 в неоплазиях с диффузным и фокальным характером локализации онкобелка Е6 указывает на присутствие популяции клеток с мутированной формой р53, являющейся, как было указано выше, резистентной к действию вирусных онкопротеинов. Установленная в нашем исследовании вариабельность фенотипических характеристик серозных карцином яичника как по экспрессии опухолевого супрессора р53, так и по частоте обнаружения онкобелка Е6 ВПЧ, особенностей его локализации в опухолевой ткани позволяет предположить, что серозный РЯ — этиологически гетерогенное новообразование с точки зрения участия генетических и внешнесредовых факторов в его развитии.

Подытоживая вышеизложенное, необходимо

еще раз подчеркнуть актуальность исследований, направленных на изучение роли ВПЧ в развитии РЯ, в частности значения вирусных онкобелков в регуляции пролиферации эпителия яичников, отражающей биологические свойства опухоли. Кроме того, особенности функционирования вирусных онкогенов в опухолевых клетках яичников могут отличаться тканеспецифичностью, что также требует проведения дальнейших, более углубленных исследований.

В заключение следует отметить, что установле-

ние причинно-следственной связи вирусного инфицирования и развития РЯ поспособствует как определению этиопатогенетического значения высокоонкогенных типов ВПЧ, так и разработке мероприятий по профилактике этих новообразований.

ВЫВОДЫ

1. Результаты представленного исследования свидетельствуют о высокой восприимчивости эпителиальных клеток верхних отделов генитального тракта к инфицированию ВПЧ у женщин с генетически обусловленным риском развития РЯ.

2. Установлена гетерогенность серозного РЯ по количеству клеток, экспрессирующих р53, в зависимости от наличия экспрессии онкобелка Е6 ВПЧ и его распространенности в ткани опухоли.

3. Выявленная экспрессия онкобелка Е6 ВПЧ 16/18 в неизмененном эпителии пациенток с высоким риском РЯ и опухолевых клетках больных РЯ, по-видимому, отражает значение высокоонкогенных типов ВПЧ в патогенезе этого новообразования.

Работа выполнена при поддержке целевой комплексной междисциплинарной программы научных исследований НАН Украины «Фундаментальные основы молекулярных и клеточных биотехнологий», в рамках которой выполняется научно-исследовательская работа «Исследование генетических предпосылок и влияния внешнесредовых факторов на реализацию наследственной предрасположенности к развитию злокачественных опухолей» (государственный регистрационный номер 0110U005761).

ЛИТЕРАТУРА

1. Имянитов ЕН. Скрининг для лиц с наследственной предрасположенностью к раку. Практ Онкол 2010; 11 (2): 102–9.

2. Махтарулина СВ, Ашрафян ЛА, Киселев ВИ и др. Вирусная и бактериальная инфекции при злокачественных эпителиальных опухолях яичников. Рос Онкол Ж 2006; (3): 11–5.

3. Atalay F, Taskiran C, Taner MZ, et al. Detection of human papillomavirus DNA and genotyping in patients with epithelial ovarian carcinoma. J Obst Gynaecol Res 2007; 33 (6): 823–8.

4. Berliner JL, Fay AM. Risk assessment and genetic counseling for hereditary breast and ovarian cancer: recommendation of the National Society of Genetic counselors. J Genet Counts 2007; 16: 241–60.

5. Caeson A, Khan SA. Characterization of transcription factor to human papillomavirus type 16 DNA during cellular differentiation. J Virol 2006; 80 (9): 4356–62.

6. Chong TD, Apt B, Gloss M, Bernard U. The enhancer of human papillomavirus type 16: binding sites for the ubiquitous transcription factors Oct-1, NFA, TEF-2, NF1 and AP1 participate in epithelial cell-specific transcription. J Virol 1991; 65: 5933–43.

7. Fehrmann F, Laimins LA. Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation. Oncogen 2003; 22: 5201–7.

8. Fülle T, Mathe M, Suba Z, et al. The presence of human papillomavirus 16 in neural structures and vascular endothelial cells. Virology 2006; 348 (2): 289–96.

9. Gaytan M, Morales C, Bellido C, et al. Macrophages in human fallopian tube and ovarian epithelial inclusion cysts. J of Reprod Immunol 2007; 73: 66–73.

10. Giordano G, D’Adda T, Gnetti L, et al. Role of human papillomavirus in the development of epithelial ovarian neoplasms in Italian women. J Obst Gynaecol Res 2008; 34 (2): 210–7.

11. Henning EM, Kvinnsland S, Holm R, et al. Significant difference in p53 and p21 protein immunoreactivity in HPV 16 positive and HPV negative breast carcinomas. Acta Oncologica 1999; 38 (7): 931–8.

12. Kauff ND, Satagopan JM, Robson ME, et al. Risk-reducing salpingo-oophorectomy in women with a BRCA1 or BRCA2 mutation. N Engl J Med 2002; 346: 1609–15.

13. Khaskheli M, Baloch S, Baloch AS. Gynecological malignancies: a continuing threat in the developing world. J of Gyn Surg 2010; 26 (2): 121–5.

14. Krawczyk E, Suprynowicz FA, Liu X, et al. Koilocytosis: a cooperative interaction between the human papillomavirus E5 and E6 oncoproteins. Am J Pathol 2008; 173: 682–8.

cancer susceptibility: Systematic evidence review for the U.S. preventive services task force. Ann Int Med 2005; 143 (5): 362–79.

1. Pejovic T, Yates JE, Liu HY, et al. Cytogenetic instability in ovarian epithelial cells from women at risk of ovarian cancer. Cancer Res 2006; 66 (18): 9017–25.

2. Pisarska MD, Kuo FT, Tang D, et al. Expression of forkhead transcription factors in human granulose cells. Fertil Steril 2009; 91 (4): 1392–4.

3. Tomassino M, Accardi R, Caldeira S, et al. The role of TP53 in cervical carcinogenesis. Hum Mut 2003; 21: 307–12.

4. Scheffner M, Takahashi T, Huibregtse JM, et al. Interaction of the human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein with wild- type and mutant human p53 protein. J Virol 1992; 66 (8): 5100–5.

5. Wu J, Guo M, Lu ZM, et al. Detection of human papillomavirus-16 in ovarian malignancy. Br J Cancer 2003; 89: 672–5.

1. Kusku E, Ordemir BH, Erkanlis S, et al. HPV and p53

   expression in epithelial ovarian carcinoma. Eur J Gynaecol Cancer 2005; 26 (6): 642–5.

2. Lowy DR, Gillison ML. A new link between Fanconi anemia and human papillomavirus-associated malignancies. J Natl Cancer Inst 2003; (95): 1648–50.

3. Lynch HT, Casey MJ, Snydera CL, et al. Hereditary ovarian carcinoma: heterogeneity, molecular genetics, pathology, and management. Mol Oncol 2009; 3 (2): 97–137.

4. Munger K, Baldwin A, Edwards K, et al. Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. J of Virol 2004; 78 (21): 11451–60.

5. Nelson HD, Huffman LH, Fu R, Harris EL. Genetic risk assessment and BRCA mutation testing for breast and ovarian