СООТНОШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ ПРИ МЕТАСТАТИЧЕСКИХ И ПЕРВИЧНЫХ ОПУХОЛЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-4-2019-g.8143

В настоящее время установлено, что в 6–14% случаев первичных злокачественных опухолей разной локализации формируются метастазы в головном мозге (ГМ). Вторичные опухоли головного мозга (ОГМ) чаще являются метастазами рака легкого (45%), молочной железы (15%), меланомы (10%), толстой кишки (5%). Клетки вторичных (метастатических) опухолей различных органов в мозге экспрессируют определенные маркеры: метастазы немелкоклеточного рака легкого — мутированный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), анапластической лимфомы — киназу 4 (ALK), меланомы — мутированный BRAFV600, рака молочной железы — рецептор HER2/new [1].

Метастазирование злокачественных опухолей реализуется в несколько этапов: комплекс генетических, эпигенетических и биологических изменений в опухолевой клетке (ОК) обеспечивает возникновение «метастатического каскада», который начинается с отделения ОК от первичного опухолевого очага. Затем следует ее инвазия в окружающие ткани, интравазация в кровеносное русло, диссеминация, проникновение в капилляры ГМ и экстравазация, колонизация клеток, индукция ангиогенеза и пролиферация под действием факторов роста. Клетки выживают, растут и развиваются в особом микроокружении (нише) [2]. В предыдущих исследованиях проанализирован состав и иммунологические функции клеток инфильтрата глиом. Установлено, что в глиомах, особенно злокачественных, преобладают клетки, относящиеся к врожденной иммунной системе иммунитета [3, 4].

Важную роль в развитии метастазов в ГМ играют реактивные астроциты (RAs), которые характеризируются повышенным содержанием глиального фибриллярного кислого белка (glial fibrillary acid protein — GFAP). Рецепторы RАs перекрестно взаимодействуют с рецепторами ОК. Метастатические ОК способствуют продукции RАs плазминогена и превращению его в плазмин. Последний способен элиминировать ОК, прошедшие через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Компонентом «противоопухолевой программы» RАs является и экспрессированный на астроцитах лиганд FasL, индуцирующий апоптоз ОК. В свою очередь, ОК продуцируют анти-RАs белок — серпин, блокирующий FasL. В частности, продукция серпина — универсальный механизм инициации метастазирования в ГМ рака легких. ОК, адгезируются на инактивированных RАs, колонизируя таким образом ГМ [5].

RАs генерируют прометастатическую нишу за счет многих механизмов. Накоплен большой фактический материал относительно роли воспалительных реакций, сопровождающих различные виды рака. Воспалительный ответ ассоциирован с инициацией и прогрессией ОК, благодаря ему поддерживается их выживание и распространение во многих тканях организма [6]. В частности, стимулами для RАs являются белки семейства DAMPs, которые связаны с врожденной иммунологической реактивностью и способны индуцировать неинфекционный воспалительный ответ (DAMPs) или воспалительный ответ на патоген (PAMPs). Источником DAMPs могут являться некротизированные ОК [7]. В формировании метастатической ниши могут также принимать участие секреторные молекулы COX2, CCL7, которые ассоциированы с повышением содержания CD24^low— и СD44^high-клеток [7]. Показано, что ОК способствуют индукции в RАs провоспалительного цитокина IL-23, который увеличивает пролиферацию ОК, опосредованную через транскрипционные факторы NF-kβ [8]. Воспалительные цитокины ОК и RАs индуцируют экспрессию эндотелиновых рецепторов ETAR и ЕTBR на ОК и лиганда эндотелина ET1 на астроцитах. На ОК и на RАs экспрессированы также молекулы клеточной адгезии — протокадгерин. На специфичной для метастазов субпопуляции RАs экспрессирован рецептор тромбоцитарного фактора роста PDGFRβ. Астроциты способствуют снижению или утрате активности опухолевого супрессора PTEN в метастатических ОК [9].

Клетки первичных злокачественных опухолей ГМ — глиобластом, подобно ОК из других тканей, остеобластам, остеоцитам и гемопоэтическим клеткам, нейтрофилам, дендритным клеткам, NK, T- и B-лимфоцитам, продуцируют ряд молекул врожденной иммунологической реактивности, провоспалительных цитокинов и их рецепторов. Выработка общих факторов ОК разной локализации и клетками глиобластом во многом объясняют однотипность иммунологических реакций при первичных глиальных и метастатических ОГМ [3, 10].

Несмотря на то что злокачественные ОГМ относительно изолированы от системных иммунологических реакций и ограничены ГЭБ, метастазируют в редких случаях (0,2%) [11], их инвазия и миграция в паренхиму ГМ (а также в межклеточные и субарахноидальные пространства с деградацией клеточного матрикса) имеет принципиально одинаковые механизмы с системным метастатическим процессом из других органов. Так, и ОК, и клетки глиобластом активируются к метастатическому процессу или инфильтративному росту и миграции за счет поляризации/деполяризации клеточной мембраны с последующим взаимодействием протеина эзрина с актином и образованием псевдоподий и формированием амебовидного (миграционного) фенотипа ОК [12, 13].

Миграцию и инвазию ОК (включая клетки глиобластом) регулируют факторы воспаления TNF-α, IL-6, VEGF, TGF-β, которые являются одновременно регуляторами уровня иммунологических реакций. В частности, TGF-β и VEGF супрессируют иммунную систему. Высокие уровни TNF-α стимулируют выработку IL-17, усиливающего рост опухоли [8].

Рост глиобластом, как и рост вторичных (метастатических) ОГМ, сопровождается интенсивным астроглиозом, воспалительным ответом и повышением содержания RАs вокруг опухолевых очагов [12, 14, 15].

В ранее проведенных исследованиях установлено, что при наиболее злокачественных ОГМ — глиобластомах — достоверно изменяются показатели, отражающие уровень системных воспалительных реакций: абсолютное количество лейкоцитов (Л) в периферической крови (ПК), соотношение количества клеток, относящихся к врожденному и приобретенному иммунному ответу (нейтрофилы (Нф), лимфоциты (Лф), тромбоциты (Тр)) [4, 16].

Цель выполненного исследования — изучение содержания Л, Тр, Нф и Лф в ПК (как показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа и системного воспаления) у больных с первичными глиальными и вторичными метастатическими ОГМ в дооперационный и послеоперационный периоды.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучены показатели ПК 56 больных с первичными ОГМ различной гистоструктуры (глиобластомы — 40, фибриллярно-протоплазматические астроцитомы — 16) и 18 — со вторичными метастатическими ОГМ. По локализации первичных опухолей больные этой группы распределялись следующим образом: аденокарцинома легких — 4, рак молочной железы — 2, прямой кишки — 2, щитовидной железы — 1, кожи — 1, матки — 1, семиома — 1, меланома — 3, тип первичного рака не идентифицирован — 3. Показатели 28 пациентов с неонкологическими хроническими заболеваниями ГМ были включены в группу сравнения. Возраст обследованных составлял 35–65 лет. Больные были прооперированы в ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины» в 2017–2018 гг. Все пациенты дали стандартное информированное согласие на проведение диагностических исследований и использование их биологического материала в научных целях.

Определение показателей ПК проводили в дооперационный и послеоперационный периоды с использованием автоматического гематологического анализатора MINDRAYBC-3000 plus (Китай). Определяли абсолютное содержание Л, Тр, Нф и Лф, а также — соотношение абсолютных количеств Тр и Лф (Тр/Лф), абсолютных количеств Тр и Нф (Тр/Нф) и относительных (процентных) количеств Нф и Лф (Нф/Лф).

Статистическая обработка данных проведена с помощью пакета программ «Statistica 6.0», достоверность различий определяли, используя t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В дооперационный период у больных с первичными ОГМ значения абсолютного содержания Тр в ПК не превышали значений в группе сравнения. Количество Тр у пациентов с метастатическими ОГМ не превышало значений у больных с первичными ОГМ и лиц группы сравнения. Содержание Л в ПК было достоверно выше у пациентов с глиобластомами и метастатическими ОГМ, чем аналогичные показатели в группе сравнения и у пациентов с доброкачественными ОГМ за счет высоких значений абсолютного содержания Нф. Увеличение последнего может отражать определенную роль воспалительных реакций в патогенезе наиболее злокачественных опухолей (глиобластомы, метастатические ОГМ). Абсолютное содержание Лф было достоверно выше при доброкачественных ОГМ по сравнению с группами глиобластом и неопухолевых заболеваний ГМ (табл. 1). Процентное содержание Лф у больных глиобластомами и метастатическими ОГМ было достоверно ниже, чем в группе сравнения (соответственно 22,7±1,7 и 16,0±1,7 против 31,7±1,5%). Снижение указанного показателя в группе больных с метастатическими ОГМ по сравнению с группой доброкачественных опухолей ГМ также достоверно. Процентное содержание Нф было наиболее высоким у больных со вторичными ОГМ. Отметим, что при метастазах злокачественных опухолей легкого (немелкоклеточный рак, аденокарцинома) у 55% пациентов выявлены лейкоцитоз и нейтрофилез, которые ассоциировались с более коротким периодом жизни больных [14].

В табл. 1–4:
*достоверность различий p < 0,05 между группами опухолей различной гистоструктуры.
**достоверность различий p < 0,05 по сравнению с группой сравнения.
***достоверность различий p < 0,05 при сравнении групп пациентов с доброкачественными и метастатичес­кими ОГМ.

Лейкоцитоз, в частности нейтрофилез, ассоциирован с риском тромбообразования. Л активируют коагуляционный каскад как часть врожденного иммунного ответа на инфекцию, предотвращая распространение патогена. Истощение Нф может привести к регрессу тромбоза. В связи с этим определение соотношения показателей абсолютного содержания Тр к абсолютному содержанию Нф (Тр/Нф) может являться важным критерием клинической стадии опухолевого процесса, роли воспалительных реакций в патогенезе ОГМ у конкретного больного, а также эффективности проведенного лечения [16]. Для клинической оценки изменения количества клеток ПК используют также определение соотношения абсолютных значений Тр и Лф (Тр/Лф) и процентных значений Нф и Лф (Нф/Лф), которые интегрально отображают изменения отдельных звеньев врожденного и приобретенного иммунитета [4] (табл. 2).

Значение показателя соотношения Нф/Лф достоверно повышено у больных с наиболее злокачественными опухолями — глиобластомами и метастатическими ОГМ. Так, при глиобластомах соотношение Нф/Лф составило 4,0 ± 0,4 у.е., а при метастатических ОГМ — 6,8 ± 0,9 у.е, что достоверно выше, чем в группе сравнения (2,2 ± 0,2 у.е) и в группе доброкачественных ОГМ (2,4 ± 0,4 у.е). Показатель Нф/Лф у больных с метастатическими ОГМ был наиболее высоким (достоверно выше, чем у пациентов с глиобластомами; p = 0,0412). Полученные данные согласуются с результатами [14, 16], показавшими возможность использовать соотношение Нф/Лф для прогноза клинического течения различных видов рака. Значения соотношения Тр/Лф повышались с увеличением степени анаплазии глиомы. Отмечены достоверные различия между соотношениями Тр/Лф при глиобластомах и астроцитомах фибриллярно-протоплазматических (p = 0,0432). В связи с этим показатель Тр/Лф можно использовать как дополнительный критерий оценки степени анаплазии глиомы и степени злокачественности. Необходимо также подчеркнуть, что наибольшее значение данного показателя отмечено при метастатических опухолях.

Соотношение Тр/Нф имело достоверно меньшие значения у больных глиобластомами (42,8 ± 3,5) и метастатическими опухолями (46,9 ± 9,2) по сравнению с лицами группы сравнения (65,9 ± 5,1; p < 0,01). Снижение соотношения Тр/Нф происходило за счет достоверного повышения абсолютного содержания Нф у больных с глиобластомами (p = 0,0155) и метастатическими опухолями (p = 0,0095) (см. табл. 1, 2). Тр взаимодействуют с Нф, используя различные механизмы, формируют тромбоцитарно-лейкоцитарные комплексы, которые секретируют серотонин, индуцируют P селектин на поверхности Тр; молекулы адгезии ICAM и αvβ3 на эндотелиальных клетках. Эти факты свидетельствуют о роли указанного взаимодействия в формировании воспалительного микроокружения опухоли [15]. В связи с этим показатель Тр/Нф может характеризовать значение и интенсивность системных воспалительных реакций в патогенезе опухолевой болезни ГМ у конкретного больного.

В послеоперационный период у больных ОГМ количество Тр достоверно не изменялось, отмечена лишь незначительная тенденция к его снижению у больных глиобластомами и метастатическими ОГМ. Содержание Л увеличивалось и примерно в 2 раза превышало этот показатель в группе сравнения (табл. 3). Абсолютное содержание Нф было увеличено практически у всех больных ОГМ, по сравнению с контрольной группой, что может указывать на усиление воспалительных реакций, относящихся к системе врожденного иммунитета. Абсолютное содержание Лф имело тенденцию к снижению при злокачественных ОГМ (глиобластомы и метастатические опухоли) и достоверно увеличивалось у больных доброкачественными ОГМ (астроцитомы фибриллярно-протоплазматические). В послеоперационный период относительное содержание Лф достоверно снижалось у больных злокачественными глиомами и метастатическими опухолями и достоверно увеличивалось у больных астроцитомами, что косвенно может указывать на некоторую активацию после хирургического удаления опухоли реакций адаптивного иммунного ответа у больных доброкачественными ОГМ (см. табл. 3).

Показатель соотношения Нф/Лф достоверно возрастал у больных с глиобластомами и имел четкую тенденцию к повышению у пациентов с метастатическими ОГМ (см. табл. 2, табл. 4). Эти данные показывают, что в послеоперационный период у больных злокачественными ОГМ активируются воспалительные реакции, относящиеся к врожденному иммунитету, и снижается активность реакций адаптивного иммунитета. С повышением степени анаплазии глиомы увеличивался в послеоперационный период показатель соотношении Тр/Лф. Наибольшее значение этого показателя отмечали при метастатических ОГМ. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования показателя соотношения Тр/Лф как дополнительного критерия оценки степени анаплазии и степени злокачественности ОГМ. Показатель соотношения Тр/Нф, напротив, достоверно снижался при злокачественных глиомах и метастатических ОГМ и в определенной мере интегрально отражал роль и уровень воспалительных реакций в патогенезе опухолевой болезни у конкретного больного (см. табл. 4). Таким образом, в послеоперационный период у больных со злокачественными ОГМ активируются реакции врожденного иммунитета и угнетаются реакции адаптивного иммунитета.

Воспаление — результат молекулярной активности инфильтрирующих опухоль иммунных клеток, включая продукцию растворимых факторов, которые способствуют пролиферации, выживанию и ограничивают апоптоз ОК, способствуя гиперметилированию опухолевых супрессоров и проапоптотических генов [17–19]. Интенсивность и роль воспалительных реакций (их в определенной мере отражают соотношения Тр/Нф, Нф/Лф) в патогенезе опухолевой болезни постулированы при злокачественных опухолях различных тканей [17, 19, 20].

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что при наиболее злокачественных ОГМ (первичных и метастатических) в ПК больных отмечаются однотипные и однонаправленные изменения: лейкоцитоз и нейтрофилез и достоверное снижение процентного содержания Лф, что совпадает с данными, полученными при раковых опухолях различного происхождения [17, 19, 20]. В патогенезе развития метастазов определенную роль играют Тр. При системном метастатическом процессе отмечают тромбоцитоз свыше 400⋅10⁹/л [16]. Нами не выявлено повышения абсолютного содержания Тр в ПК у больных с метастатическими ОГМ в дооперационный период, однако соотношение Тр/Лф у этих больных достоверно выше, чем у пациентов с глиобластомами. В то же время у больных с глиобластомами указанный показатель был достоверно выше, чем у лиц с доброкачественными глиомами. Соотношение Нф/Лф повышалось с возрастанием степени анаплазии ОГМ. При метастатических ОГМ этот показатель был достоверно выше, чем при глиобластомах. Таким образом, при метастатических ОГМ и при первичных злокачественных глиомах в ПК отмечаются однотипные и однонаправленные изменения, заключающиеся в активации гранулоцитарного ростка кроветворения и подавлении лимфоцитарного, что может косвенно указывать на интенсивность воспалительных реакций. Исходя из полученных данных, последняя при метастазах в ГМ достоверно выше, чем при первичных злокачественных ОГМ.

Активация гранулоцитопоэза и снижение лимфопоэза при наиболее злокачественных опухолях в определенной степени может отражать переход гемопоэза (как при метастатических, так и при глиальных опухолях) на ранние онтогенетические стадии кроветворения. Известно, что в эмбриогенезе имеет место более ранняя активация клеток и сигнальных путей, относящихся к системе врожденного иммунитета. Так, ранний врожденный иммунный ответ осуществляется за счет активации взаимодействия TIR (Toll/IL-1) домена с адаптерным протеином MyD88 (myeloid differentiation protein). В онтогенезе прогениторные эритромиелоидные клетки желточного мешка дифференцируются в микроглиальные клетки, периваскулярные макрофаги и макрофаги хориоидального сплетения [6, 8, 21, 22].

ВЫВОДЫ

1. У больных со злокачественными ОГМ — первичными (глиобластомами) и вторичными (метастазами злокачественных опухолей различных органов и тканей) — в дооперационный период установлены однотипные и однонаправленные изменения абсолютного содержания Л и Нф, повышение соотношения Нф/Лф, снижение соотношения Тр/Нф. Перечисленные изменения могут указывать на повышение активности воспалительных реакций пропорционально увеличению степени анаплазии ОГМ.

2. Интенсивность воспалительных реакций при метастатических ОГМ (в частности соотношение Нф/Лф) достоверно выше, чем при глиобластомах в дооперационный период.

3. Соотношение Тр/Лф увеличивается с повышением степени анаплазии ОГМ и может служить дополнительным критерием степени их злокачественности.

4. После оперативного вмешательства у больных с ОГМ возрастают по сравнению с дооперационным периодом показатели, косвенно отражающие активацию реакций врожденной системы иммунитета.

5. Уровень лимфоцитов в ПК в послеоперационный период снижается по сравнению с дооперационным, что свидетельствует как об отсутствии восстановления в системе адаптивных, специфических иммунных реакций после операции, так и о разнонаправленном (стимулирующем или супрессивном) влиянии опухолевого процесса при первичных и вторичных злокачественных ОГМ на врожденный и приобретенный иммунитет организма.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lowery FJ, Yu D. Brain metastasis: unique challenges and open opportunities. Biochim Biophys Acta 2017; 1867 (1): 49–57.
2. Franchino F, Rudà R, Soffietti R. Mechanisms and therapy for cancer metastasis to the brain. Front Oncol 2018; 8: 161.
3. Lisyaniy NI, Gnedkova IA, Gnedkova MA, et al. The peculiarities of cellular compoud and functions of the ifiltration of gliomas of different degrees of anaplasia. Oncology 2917; 19 (1): 5–10 (in Russian).
4. Gnedkova IA, Lisyaniy NI, Shmeleva AA, et al. Ratio of innate and adaptive immunity cells in peripheral blood in patients with brain tumors. Oncology 2018; 20 (1): 28–33 (in Russian).
5. Wasilewski D, Priego N, Fustero-Torre C, Valiente M. Reactive astrocytes in brain metastasis. Front Oncol 2017; 11 (7): 298.
6. Matias D, Balça-Silva J, da Graça G, et al. Microglia/astrocytes–glioblastoma crosstalk: crucial molecular mechanisms and microenvironmental factors. Front Cell Neurosci 2018; 12: 235.
7. Dai W, Zhu H, Chen G, et al. Orchestration of the crosstalk between astrocytes and cancer cells affects the treatment and prognosis of lung cancer sufferers with brain metastasis. J Thorac Dis 2016; 8 (11): E1450–4.
8. Comen EA, Bowman RL, Kleppe M. Underlying causes and therapeutic targeting of the inflammatory tumor microenvironment front cell. Dev Biol. 2018; 6: 56.
9. Gril B, Paranjape AN, Woditschka S, et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nat Commun 2018; 9 (1): 2705.
10. Zhao, H. Chen, Q, Alam A, et al. The role of osteopontin in the progression of solid organ tumour Cell Death Dis 2018 9 (3): 356.
11. Manini I, Caponnetto F, Bartolini A, et al. Role of microenvironment in glioma invasion: what we learned from In Vitro models. Int J Mol Sci 2018; 19 (1): 147.
12. Sevenich L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Front Immunol 2018; 9; 697.
13. Lorentzen A, Becker PF, Kosla J, et al. Single cell polarity in liquid phase facilitates tumour metastasis. Nat Commun 2018; 9: 887. Published online 2018 Feb 28.
14. Liu CN, Chang CY, Hsueh K-W, et al. Migration/invasion of malignant gliomas and implications for therapeutic treatmentInt. J Mol Sci 2018; 19 (4): 1115.
15. Schernberg A, Mezquita L, Boros A, et al. Neutrophilia as prognostic biomarker in locally advanced stage III lung cancer. PLoS One 2018; 13 (10): e0204490.
16. Franco AT, Corken A, Ware J. Platelets at the interface of thrombosis, inflammation, and cancer. Blood 2015; 126 (5): 582–8.
17. Faria SS, Fernandes Jr PC, Silva MJB, et al. The neutrophil-to-lymphocyte ratio: a narrative review. Ecancermedicalscience. 2016; 10: 702.
18. Redmer T. Deciphering mechanisms of brain metastasis in melanoma — the gist of the matter. Mol Cancer 2018; 17: 106.
19. Willik KD, Koppelmans V, Hauptmann M, et al. Inflammation markers and cognitive performance in breast cancer survivors 20 years after completion of chemotherapy: a cohort study Breast Cancer Res 2018; 20: 135.
20. Wang PF, Meng Z, Song HW, et al. Preoperative changes in hematological markers and predictors of glioma grade and survival. Front Pharmacol 2018; 9: 886.
21. Vallée A, Lecarpentier Y. Crosstalk between peroxisome proliferator-activated receptor gamma and the canonical WNT/β-Catenin pathway in chronic inflammation and oxidative stress during carcinogenesis. Front Immunol. 2018; 9: 745.
22. Hai L, Zhang Ch, Li T, et al. Notch is a prognostic factor that is distinctly activated in the classical and proneural subtype of glioblastoma and that promotes glioma cell survival via the NFkβ-p65 pathway. Cell Death Dis 2018. doi.: 10.10 38/s 41419-017-0119-z.

Адрес для переписки:
Лисяный Н.И.
04050, Киев, ул. Майбороды, 32
ДУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова»
E-mail: nimm.neuro@gmail.com

Получено: 19.04.2019