АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ ОБЛУЧЕНИЕМ IN VITRO

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-21-4-2019-g.8142

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований у мужчин во всем мире. В Украине по удельному весу РПЖ занимает второе место в структуре заболеваемости и третье — в структуре смертности мужского населения от злокачественных новообразований, опережая опухоли бронхолегочной системы и рак желудка [1]. Согласно данным Национального канцер-регистра Украины заболеваемость РПЖ (стандартизированный показатель, мировой стандарт) в нашей стране в 2016 г. составляла 26,2 на 100 тыс., смертность — 11,6 на 100 тыс. мужского населения [1]. Несмотря на совершенствование методов диагностики, более чем в 40% случаев РПЖ диагностируется в III и IV стадии. В 2016 г. от РПЖ в Украине умерли 3222 больных, причем летальность в течение 1 года после установления диагноза составляет около 17%. С возрастом у мужчин наблюдается существенное повышение как заболеваемости, так и смертности от РПЖ [1]. Помимо возраста, важными факторами риска развития заболевания считаются расовая принадлежность, наследственность и ряд приобретенных факторов (чрезмерное употребление животных жиров, жареного мяса, диета с низким содержанием лейкопинов, антиоксидантов, фитоэстрогенов, витамина Е и селена) [2].

Одним из радикальных методов терапии локального РПЖ является дистанционная лучевая терапия (ЛТ). Разработка и внедрение в практику трехмерной конформной дистанционной ЛТ (3DCRT), а также ЛТ с модуляцией интенсивности дозы (IMRT) позволили существенно увеличить подводимую к опухоли дозу излучения без повышения риска развития местных и общих лучевых реакций. Несмотря на конформную «стратегию» радиационной онкологии, в зону облучения, включающую опухоль, неизбежно попадают клетки нормальных тканей, а именно: тканевые структуры, расположенные на входе и выходе терапевтического пучка иони­зирующего излучения (ИИ), кровеносные сосуды, которые подвергаются облучению в той же дозе, что и опухоль, а также микроскопические инфильтраты опухоли в здоровые ткани [3]. Одна из причин радиорезистентности опухолей заключается в том, что восстановление повреждений ДНК в опухолевых клетках происходит более активно, чем в клетках нормальных тканей, поскольку в них наблюдается повышенная экспрессия ферментов репарации ДНК [4]. Поэтому для эффективного воздействия на радиорезистентные опухоли, к которым относится и РПЖ, назначаются достаточно высокие дозы ЛТ, вызывающие в определенной степени разрушение и здоровых тканей. При этом лечение лучевых поражений органов малого таза (пост­лучевой ректит, цистит, уретрит) остается сложной задачей, решение которой требует индивидуального подхода с учетом индивидуальной радиочувствительности организма (ИРО) больного, определяемой хромосомным методом (G₂ radiation sensitivity assay) [5, 6]. По показателю ИРО человеческая популяция гетерогенна: 14–20% составляют лица с радиорезистентностью, 10–20% — с повышенной радиочувствительностью, 7–10% — со сверхрадиочувствительностью [7]. Учитывая вышеизложенное, определение ИРО больных онкологического профиля будет способствовать персонализированной тактике ЛТ.

ИРО можно определять также по содержанию клеток с преждевременной конденсацией хромосом, частоте микроядер, средней длине теломер, количеству однонитевых разрывов ДНК, количеству фокусов гистона γ-H2AX, полиморфным вариантам и мутациям определенных генов (например GYPA или HPRT) [8, 9]. Одним из перспективных подходов к определению ИРО является оценка уровня постлучевого апоптоза (Ап), которая впервые была предложена в 1996 г. [10]. Как оказалось, облучение in vitro лимфоцитов периферической крови (ЛПК) даже без стимуляции митогеном приводит к их гибели путем Ап. Поскольку гибель ЛПК в ответ на воздействие ИИ чаще всего реализуется путем Ап [11], уровень последнего начали рассматривать в качестве одного из критериев определения ИРО [10, 12, 13]. Однако вопрос клинического значения оценки вероятности постлучевых осложнений у больных РПЖ по данным определения Ап в ЛПК остается предметом дискуссии. Некоторые авторы не выявили достоверных различий между уровнем радиационно-индуцированной апоптотической гибели ЛПК и степенью выраженности постлучевых осложнений у больных РПЖ [14, 15].

Известно, что Ап связан с оксидативным стрессом, развивающимся вследствие нарушения равновесия между генерированием активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантной защитой. Антиоксидантные системы способны предотвращать образование АФК и инициацию ими цепных реакций, а также нейтрализовать образующиеся АФК. Избыточное формирование АФК может вызывать активацию процессов перекисного окисления липидов, что может приводить к разрушению клеточных мембран, а также повреждению белков и нуклеиновых кислот [16]. Кроме того, АФК могут запускать внутриклеточные пути передачи сигнала, приводящие к активации эффекторных механизмов клеточной гибели, а проявление токсического действия свободнорадикальных со­единений обусловливает структурно-метаболические нарушения в клетках с последующим их некрозом.

Оценка возможных корреляций между показателями Ап, индуцированного тест-облучением in vitro, в ЛПК больных РПЖ на различных этапах ЛТ, а также корреляций между показателями Ап и биохимическими показателями, характеризующими уровень оксидативного стресса и состояние антиоксидантных систем, может быть важной при последующем их сопоставлении с отдаленными последствиями ЛТ. С целью дальнейшего отбора соответствующих показателей в настоящей работе анализировали, как коррелируют уровни индуцированного тест-облучением in vitro Ап ЛПК больных РПЖ до начала проведения курса ЛТ, на промежуточном и конечных этапах терапевтического облучения. Нас интересовало также, существует ли связь между уровнем индуцированного тест-облучением Ап ЛПК и уровнем продукции АФК в плазме крови, рядом клинических показателей или частотой пострадиационных нарушений хромосом.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании приняли участие 16 пациентов в возрасте от 51 до 77 лет (медиана 68,5 года) с верифицированным диагнозом РПЖ. Диагноз установлен на основании комплексного обследования больных, находящихся на стационарном лечении в клинической больнице «Феофания» Государственного управления делами (Киев, Украина), с обязательной гистологической верификацией. Характеристика пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных РПЖ (n = 16)

¹ПСА — простатический специфический антиген.
*Значение показателя до проведения лучевой терапии; **данные отсутствуют.

ЛТ проводили на медицинском линейном ускорителе Clinac iX («Varian Medical Systems, Inc.», США) с использованием фотонов энергии 6 МэВ, фракциями по 2,5 Гр ежедневно до суммарной дозы 76,0 Гр. Получено информированное согласие всех больных на дополнительное лабораторное обследование и использование их биологических материалов в исследовательских целях. Пробы венозной крови собирали до начала курса ЛТ, после первой фракции терапевтического облучения и по окончании курса. В качестве контроля исследовали образцы периферической крови условно здоровых доноров мужского пола в возрасте старше 60 лет.

Периферическую кровь собирали в стерильные флаконы Vacuette («Greiner Bio-One», Австрия) с напылением гепарина. Фракцию, обогащенную ЛПК, выделяли стерильно центрифугированием в градиенте плотности Histopaque^®-1077 («Sigma», США). Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике, используя суправитальное окрашивание трипановым синим. Одну из двух проб (0,5•10⁶ жизнеспособных клеток/мл) от каждого больного подвергали однократному воздействию рентгеновского облучения в дозе 2,0 Гр на аппарате РУТ-250-15-2 («РУМ-17», СССР; фильтры 0,5 мм Cu + 0,5 мм Al, сила тока 10 мА, напряжение 180 кВ, фокусное расстояние 40 см, мощность дозы 63 сГр/мин). Контролем служил образец ЛПК без тест-облучения. После этого клетки культивировали в течение 48 ч при 37 °С в содержащей 5% СО₂ атмосфере, в питательной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота («Sigma», США), 2 ммоль/л L-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина.

После культивирования in vitro содержание гиподиплоидных (апоптотических) клеток в образцах ЛПК, которые подвергались рентгеновскому облучению, и в контрольных пробах определяли методом проточной цитометрии после окрашивания клеток раствором пропидия йодида («Sigma», США), как описано в работе [17]. Флуоресценцию клеток измеряли на цитофлуориметре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). В каждой пробе подсчитывали не менее 10 тыс. клеток. Мертвые клетки и их фрагменты исключали из анализа. Для количественной оценки содержания гиподиплоидных клеток применяли программу CELLQuest PRO («BD Biosciences Pharmingen», США).

Для определения индуцированной ионами Fe²⁺ продукции АФК в плазме крови использовали краситель N,N-диэтилпарафенилендиамин (DEPPD) [18]. Образцы плазмы крови сразу после получения замораживали и до проведения исследований хранили в жидком азоте. Реакцию проводили в 96-луночных прозрачных планшетах с плоским дном с использованием планшетного ридера Synergy HT («BioTek Instruments, Inc.», США) с термостатом. Образцы плазмы крови (5 мкл в 145 мкл 0,1 М Na-ацетатного буфера, рН 4,8) инкубировали 5 мин при 37 °С. После этого в лунки вносили по 50 мкл растворов DEPPD (конечная концентрация 0,38 мкмоль/л) и FeSO₄ (конечная концентрация 4,37 мкмоль/л) на 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,8) и инкубировали образцы еще 6 мин при 37 °С с измерением интенсивности поглощения при длине волны 511 нм каждые 30 с. Расчеты проводили в интервале 1–4 мин при линейном приросте поглощения. Калибровочную кривую получали при внесении в реакционную смесь вместо плазмы крови стандартных растворов Н₂О₂ в концентрациях 0,368–4,412 ммоль/л.

Оценку ИРО больных осуществляли на основании разработанного нами алгоритма, основанного на «провокативном» рентгеновском облучении культуры ЛПК в конце G₂-фазы митотического цикла в дозе 1,5 Гр [19]. Аппаратура и условия облучения аналогичны указанным выше. Метафазный анализ аберраций хромосом проводили в первом постлучевом митозе. Облученные образцы крови переносили во флаконы с питательной средой RPMI-1640 («Sigma», США) и 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и культивировали в течение 51–52 ч при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО₂, в присутствии митогена фитогемагглютинина (M-форма; «Gibco», США) в концентрации 15 мкг/мл. Для накопления метафазных пластинок через 48 ч инкубации в культуру добавляли раствор колцемида в концентрации 0,1 мкг/мл. После гипотонической обработки раствором 0,075 моль/л КСl при 37 °С и фиксации суспензии клеток в смеси 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты при 4 °С готовили препараты метафазных пластинок. Метафазный анализ аберраций хромосом проводили с использованием светового микроскопа Nikon Eclipse E100 («Nikon Co», Япония).

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением t-критерия Стьюдента. Коэффициент корреляции рассчитывали по критерию Спирмена с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6 («GraphPad Software Inc.», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Репрезентативные гистограммы распределения клеток по содержанию ДНК в нестимулированных ЛПК больного РПЖ без тест-облучения или с тест-облучением после культивирования представлены на рисунке.

Рисунок. Гистограммы распределения ДНК по интенсивности флуоресценции пропидия иодида в нестимулированных ЛПК больного РПЖ без тест-облучения (гистограммы красного цвета) или с тест-облучением в дозе 2,0 Гр (гистограммы зеленого цвета) после культивирования 48 ч. Гиподиплоидные клетки соответствуют участку М1. ЛПК больного № 0024: а, б — до начала ЛТ; в, г — после первой фракции терапевтического облучения (2,5 Гр); д, е — по окончании курса ЛТ (76,0 Гр); а, в, д — ЛПК без тест-облучения; б, г, е — ЛПК после тест-облучения

Как можно видеть, большая часть клеток (> 95%) находится в фазе G1 и отличия выявляются только по увеличению содержания гиподиплоидных клеток. Следует отметить, что если в начале наблюдения уровень постлучевого Ап ЛПК превышает таковой без тест-облучения (21,5 ± 2,8% по сравнению с 11,4 ± 0,6%; р < 0,05), то после первой фракции терапевтического облучения эти показатели практически не отличались (соответственно 3,1 ± 0,3 и 3,1 ± 0,4%), а в конце наблюдения уровень радиационно-индуцированного Ап ЛПК оказался даже ниже такового без тест-облучения (4,7 ± 0,2% по сравнению с 10,0 ± 1,7%; р < 0,05).

Результаты определения доли апоптотических клеток в пробах ЛПК больных РПЖ (до ЛТ, после первой фракции облучения и по завершении ЛТ) представлены в табл. 2. Пробы ЛПК в полной питательной среде культивировали, как указано выше, после рентгеновского тест-облучения в дозе 2,0 Гр или без него. Сравнение проводили для тех больных, у которых присутствовали соответствующие попарные показатели. При отсутствии одного из показателей данные из расчетов исключали.

Таблица 2. Показатели уровня Ап ЛПК больных РПЖ в течение курса ЛТ

*Не определяли.

Отмечены значительные колебания фракции апоптотических клеток в пробах ЛПК как до начала терапевтического облучения пациентов (3,1–20,7%), так и после первой фракции облучения (2,2–28,5%), а также после его завершения (4,5–35,7%). После тест-облучения суспензий ЛПК, выделенных на всех этапах ЛТ пациентов, отмечен еще более широкий диапазон значений апоптотического индекса (соответственно 1,6–42,6%, 2,8–43,0%, 4,3–36,6%), что свидетельствует о вариабельности ИРО. Следует отметить, что уровень спонтанного Ап (без тест-облучения) в ЛПК доноров был ниже, чем у больных РПЖ до начала ЛТ (соответственно 5,1 ± 1,4 и 10,6 ± 2,3%; 0,05 < p < 0,1). Низкие значения относительного содержания апоптотических клеток в культурах ЛПК сохранялись и после их тест-облучения in vitro, что может указывать на меньшую вариабельность ИРО практически здоровых лиц по сравнению с больными РПЖ.

При проведении анализа по Спирмену выявлена положительная корреляция между показателями апоптотической гибели с тест-облучением и без него в ЛПК больных РПЖ, выделенных как до начала терапевтического облучения (r = 0,88), так и после его первой фракции (r = 0,77). В то же время после окончания курса ЛТ такая корреляция не была выявлена (r = 0,48). Обнаружена слабая корреляция между показателями спонтанного Ап ЛПК до начала ЛТ и по ее окончании (r = 0,60). Показатели спонтанного Ап ЛПК до начала терапевтического облучения и после первой его фракции не коррелируют между собой (r = 0,36).

Поскольку процессы Ап связывают в том числе и с генерированием АФК, были исследованы возможные корреляции между уровнем спонтанного Ап в ЛПК больных и содержанием АФК в плазме крови до начала терапевтического облучения и после его первой фракции. Результаты определения Ап и содержания АФК приведены в табл. 3. При сравнительном изучении указанных показателей до начала терапевтического облучения корреляции между ними не выявлено (r = 0,13). В то же время отмечена корреляция между фракцией апоптотических клеток в ЛПК и уровнем АФК в плазме крови при исследовании, проведенном после первой фракции ЛТ (r = 0,77).

Таблица 3. Уровень спонтанного Ап в ЛПК, содержание АФК в сыворотке и выход аберраций хроматидного типа в ЛПК больных РПЖ

*Не определяли.

Следует отметить, что в проведенных нами ранее исследованиях [20] после первой фракции терапевтического облучения больных РПЖ в дозе 2,5 Гр не наблюдалось значительных изменений интенсивности образования АФК в плазме крови, однако коэффициент вариации этого показателя возрастал в 1,26 раза, прослеживалась обратная корреляционная зависимость между уровнем образования свободнорадикальных соединений в ЛПК и ИРО пациентов до начала ЛТ. Это может быть одним из объяснений отсутствия корреляционной связи между уровнями Ап и продукции АФК до начала ЛТ, а также ее наличием после первой фракции облучения. В наших исследованиях активность образования АФК в ЛПК больных РПЖ (которая характеризовалась высокой индивидуальной вариабельностью) после проведения первой фракции ЛТ возрастала в 1,32 раза. Сходные результаты получены в работе [21]. Уровень образования АФК в ЛПК больных с РПЖ превышал контрольный в 1,48 раза, наблюдалась высокая степень индивидуальной вариабельности этого показателя. Таким образом, корреляция между уровнем Ап ЛПК больных с РПЖ и интенсивностью образования АФК в плазме крови может быть связана также с изменениями продукции свободнорадикальных соединений в ЛПК в результате их повреждения под воздействием ИИ. Отмечено [22], что повышение интенсивности образования свободнорадикальных соединений и возрастание концентрации восстановленного глютатиона во время прохождения митотического цикла подтверждают гипотезу о наличии регуляторной связи между окислительными метаболическими процессами и функциями клеточного цикла, а нарушения равновесия между этими процессами могут привести к образованию аберрантных клеток. В наших исследованиях повышенный уровень спонтанных аберраций хромосом в ЛПК больных РПЖ наблюдался на фоне развития оксидативного стресса и истощения звеньев антиоксидантной защиты [20].

Частота радиационно-индуцированных аберраций хроматидного типа по данным G₂-теста находилась в диапазоне 11,0–19,0 аберраций/100 метафаз. При анализе возможной связи между ИРО больных РПЖ (по выходу аберраций хромосом хроматидного типа, данные G₂-теста) и уровнем спонтанного Ап ЛПК (см. табл. 3) до начала ЛТ статистически значимой корреляции не отмечено (r = 0,244). Это может быть связано с недостаточным количеством цитогенетических наблюдений. Не исключено, что в хромосомном G₀-тесте эта связь могла бы оказаться более значимой, так как индуцированные в этот период лучевые маркеры — дицентрики, препятствуя митозу облученных клеток, способствуют их гибели.

Анализ возможных корреляций уровня Ап ЛПК крови больных РПЖ с клиническими характеристиками (значения показателя по шкале Глисона, уровень ПСА) до проведения ЛТ дал отрицательные результаты.

Одной из главных причин развития поздних лучевых осложнений у больных РПЖ является применение больших разовых и суммарных доз облучения, превышающих толерантность здоровых тканей к ИИ [23]. Поэтому для оптимизации отдаленных результатов ЛТ при ее планировании следует учитывать индивидуальную вариабельность ответа организма больных онкологического профиля. Однако до сих пор не существует надежных биомаркеров, способных прогнозировать ответ на ЛТ [24]. В стадии исследования находится в том числе метод количественной оценки радиационно-индуцированного Ап ЛПК для оценки тяжести лучевых реакций со стороны здоровых тканей, попадающих в зону терапевтического облучения. Исследования в данном направлении в дальнейшем предполагается продолжить, в том числе для изучения возможностей определения показателей Ап клеток периферической крови больных со злокачественными опухолями в сочетании с другими биомаркерами постлучевой токсичности.

ВЫВОДЫ

1. Широкий диапазон значений апоптотического индекса ЛПК больных РПЖ после тест-облучения in vitro свидетельствует о вариабельности ИРО.
2. До начала ЛТ больных РПЖ и после первой фракции облучения выявлена положительная корреляция между уровнями Ап в культурах нестимулированных ЛПК с тест-облучением in vitro и без него. Такой корреляции не отмечено в ЛПК, исследованных после окончания курса ЛТ.
3. После первой фракции терапевтического облучения выявляется корреляция между содержанием апоптотических клеток в ЛПК и уровнем АФК в плазме крови больных.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы выражают искреннюю благодарность доктору медицинских наук, профессору Э.А. Стаховскому (Национальный институт рака, Киев) и кандидату медицинских наук Е.В. Сафоновой (клиническая больница «Феофания» Государственного управления делами, Киев) за оказанное содействие в проведении исследований. Работа выполнена в рамках целевой программы научных исследований ОБФМБ НАН Украины «Молекулярно-­биологические факторы гетерогенности клинического течения гормонозависимых опухолей».

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

• 1. Fedorenko ZP, Michailovich YY, Goulak LO, et al. Cancer in Ukraine 2016–2017. Incidence, mortality, activities of oncological service. Bulletin of National Cancer Registry of Ukraine, vol 19. Kyiv: National Cancer Institute of Ukraine, 2018. 82 p.
• 2. Alekseev BYa, Kaprin AD, Matveev VB, Nyushko KM. Clinical guidelines for the diagnosis and and treatment of prostate cancer. Russian Association of Oncologists. Moscow: NN Blokhin National Medical Research Centre of Oncology of the Health Ministry of Russia, 2014. 43 p. (in Russian).
• 3. Basic Clinical Radiobiology, 4th ed. Joiner MC, van der Kogel A (eds). Boca Raton, FL: CRC Press; 2009. 375 p.
• 4. Ciszewski WM, Tavecchio M, Dastych J, Curtin NJ. DNA-PK inhibition by NU7441 sensitizes breast cancer cells to ionizing radiation and doxorubicin. Breast Cancer Res Treat 2014; 143 (1): 47–55.
• 5. Borgmann K, Haeberle D, Doerk T, et al. Genetic determination of chromosomal radiosensitivities in G0- and G2-phase human lymphocytes. Radiother Oncol 2007; 83 (2): 196–202.
• 6. Domina EA, Druzhyna MO, Ryabchenko NM. Individual radiosensitivity of a person. Kyiv: Logos, 2006. 126 p. (in Ukrainian).
• 7. Kovalev EE, Smirnova OA. Estimation of radiation risk based on concept of individual variability of radiosensitivity. Bethesda: Armed Forces Radiobiology Research Institute, 1996. 198 p.
• 8. Pernot E, Hall J, Baatout S, et al. Ionizing radiation biomarkers for potential use in epidemiological studies. Mutat Res 2012; 751 (2): 258–86.
• 9. Domina EA, Philchenkov A, Dubrovska A. Individual response to ionizing radiation and personalized radiotherapy. Crit Rev Oncogen 2018; 23 (1–2): 69–92.
• 10. Boreham DR, Gale KL, Maves SR, et al. Radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: potential as a biological dosimeter. Health Phys 1996; 71 (5): 685–91.
• 11. Radford IR, Murphy TK. Radiation response of mouse lymphoid and myeloid cell lines. Part III. Different signals can lead to apoptosis and may influence sensitivity to killing by DNA double-strand breakage. Int J Radiat Biol 1994; 65 (2): 229–39.
• 12. Ozsahin M, Ozsahin H, Shi Y, et al. Rapid assay of intrinsic radiosensitivity based on apoptosis in human CD4 and CD8 T-lymphocytes. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1997; 38 (2): 429–40.
• 13. Ozsahin M, Crompton NE, Gourgou S, et al. CD4 and CD8 T-lymphocyte apoptosis can predict radiation-induced late toxicity: a prospective study in 399 patients. Clin Cancer Res 2005; 11 (20): 7426–33.
• 14. Brzozowska K, Pinkawa M, Eble MJ, et al. In vivo versus in vitro individual radiosensitivity analysed in healthy donors and in prostate cancer patients with and without severe side effects after radiotherapy. Int J Radiat Biol 2012; 88 (5): 405–13.
• 15. Vogin G, Merlin JL, Rousseau A, et al. Absence of correlation between radiation-induced CD8 T-lymphocyte apoptosis and sequelae in patients with prostate cancer accidentally overexposed to radiation. Oncotarget 2018; 9 (66): 32680–9.
• 16. Tang D, Kang R, Berghe TV, et al. The molecular machinery of regulated cell death. Cell Res 2019; 29 (5): 347–64.
• 17. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods 1991; 139 (2): 271–9.
• 18. Hayashi I, Morishita Y, Imai K, et al. High-throughput spectrophotometric assay of reactive oxygen species in serum. Mutat Res 2007; 631 (1): 55–61.
• 19. Domina EA, Mikhailenko VM, Glavin OA, Makovetska LI. Detection of individuals with high individual sensitivity to protect their genome from exposure to background radiation doses. Methodical Recommendations. Kyiv: DIA, 2018. 30 p. (in Ukrainian).
• 20. Glavin OA, Domina EA, Mikhailenko VM, Makovetska LI. Determination of correlation between the state of pro- and antioxidant processes in the blood of patients with prostate cancer and chromosomal instability of blood lymphocytes. Oncology (Kyiv) 2019; 21 (2): 135–141 (in Ukrainian).
• 21. Pelevina II, Aleshchenko AV, Antoshchina MM, et al. The content of ROS in blood lymphocytes of healthy individuals, individuals irradiated as a result of Chernobyl disaster and patients with prostate cancer. Radiats Biol Radioecol 2016; 56 (5): 469–74 (in Russian).
• 22. Sarsour EH, Kumar MG, Chaudhuri L, et al. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal 2009; 11 (12): 2985–3011.
• 23. Sycheva IV. Treatment of radiation-induced pelvic damage after radiation therapy for prostate cancer. Sib J Oncol 2018; 17 (3): 64–71 (in Russian). [Cited 2019 March 25]. Available from: https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/765/539.
• 24. Uemura N, Kondo T. Current status of predictive biomarkers for neoadjuvant therapy in esophageal cancer. World J Gastrointest Pathophysiol 2014; 5 (3): 322–34.

Адрес для переписки:
Фильченков А.А.
03022, Киев, ул. Васильковская, 45
Институт экспериментальной патологии,
онкологии и радиобиологии
им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины
E-mail: a.philch@gmail.com

Получено: 21.05.2019