ІМУНОГІСТОХІМІЧНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ БІЛКІВ P53, Р21WAF1/CIP1, Р16INK4A ТА КІ‑67 В ЕПІТЕЛІАЛЬНИХ КЛІТИНАХ ХВОРИХ НА ЗАЛОЗЕВУ ТА АТИПОВУ ГІПЕРПЛАЗІЮ ЕНДОМЕТРІЯ

ВСТУП

Загальновідомо, що своєчасне виявлення та лікування передпухлинних процесів важливе для попередження розвитку новоутворень, тобто є ключовим етапом вторинної профілактики раку [1]. На сьогодні багато положень щодо передпухлинних станів зазнають перегляду, доповнюються новими даними з урахуванням досягнень цитології, молекулярної біології, цитогенетики. Підтверджено, що розвиток пухлини відбувається як багатостадійний процес, де кожному етапу відповідають певні генетичні зміни клітин, які є відображенням особливостей різних гістологічних форм пухлин. Це зазвичай множинні зміни, які включають експресію кількох онкогенів та інактивацію двох або більше супресорних генів. Такі події є критичним кроком у трансформації нормальної клітини у злоякісну [2]. Все наведене вище стосується і новоутворень ендометрія, який є високооновлюваною тканиною і характеризується високим проліферативним потенціалом у нормі, що зумовлює складність морфологічної діагностики патологічних процесів слизової оболонки матки, особливо диференційної діагностики між атиповою гіперплазією та високодиференційованим раком [3]. Відомо, що гіперпластичні процеси представляють собою гетерогенну групу захворювань з різною потенцією до малігнізації. Так, тільки 2,0% гіперплазій без атипії зазнають малігнізації, і в той же час близько 25,0% атипових гіперплазій трансформуються у рак. Цю закономірність відзначають при типовій ендометріальній карциномі, але вона не є характерною для серозної карциноми [4]. Таким чином, безсумнівно важливою є оцінка моле­

кулярного профілю епітеліальних клітин при залозевій гіперплазії ендометрія та виділення процесів із високим проліферативним потенціалом, що є суттєвим фактором ризику малігнізації.

Важливу роль у регулюванні клітинного циклу і, відповідно проліферативної активності віді­ грають інгібітори циклін­залежних кіназ, зокрема, р21WAF1/CIP1 та р16INK4a, вивченню яких при гіперплазії ендометрія присвячені поодинокі роботи [5, 6]. Проте, значення цих біомолекулярних маркерів для верифікації характеру патологічного процесу до цього часу залишається дискусійним. Наведене вище стало підгрунттям для комплексного вивчення ряду маркерів (р53, р21WAF1/CIP1, р16 INK4a та Ki­67) при гі­ перпластичних процесах ендометрія.

Мета роботи — зіставлення проліферативного потенціалу гіперплазій з експресією білків пухлинних­супресорів р53, р21WAF1/CIP1та р16 INK4a у епі­ теліальних клітинах хворих на залозеву й атипову гі­ перплазію ендометрія.

ОБ‘ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідженні використані зскребки слизової оболонки порожнини матки та операційний матеріал від 41 пацієнтки, віком від 30 до 69 років, із дисфункціональними матковими кровотечами та кровотечами у період менопаузи. Операційний матеріал фіксували у 10,0% розчині нейтрального забуференого формаліну. Гістологічні зрізи товщиною 4–5 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином. При верифікації клінічного діагнозу у 25 хворих виявлено залозеву гіперплазію (ЗГЕ): у 9 — фаза проліферації менструального циклу, у 11 — фаза секреції, у 5 — менопаузальний період; у 11 випадках — атипову гіперплазію

ендометрія (АГЕ). Контролем були зразки слизової оболонки порожнини матки, отримані у 5 жінок ві­ ком 31–69 років із поліпами цервікального каналу, із гістологічно незміненим ендометрієм, який відпові­ дав фазі секреції менструального циклу. Усі пацієнтки знаходились на лікуванні у відділенні онкогінекології Інституту онкології АМН України.

Імуногістохімічне виявлення р53, р21WAF1/CIP1, р16INK4a та маркера проліферації Кі­67 проводили на депарафінірованих зрізах товщиною 4–5 мкм, із попередньою демаскіровкою антигену у цитратному буфері (pH 6,0) у мікрохвильовій печі протягом 10 хв. Для візуалізації продуктів реакції застосовували систему EnVision. В якості первинних антитіл використовували МкАТ до р21WAF1/CIP1 WAF1/Cip1 (клон SX118), p53 (клон DO­7), p16INK4a (клон DCS­50) та Ki­67 (клон MIB) фірми «DAKO Сytomation». Оцінку результатів імуногістохімічного забарвлення проводили за допомогою світлового мікроскопа (збільшення х1250, масляна імерсія). Результати імуногістохімічної реакції оцінювали напівкількісним методом, шляхом підрахунку відсотка позитивнозабарвлених клітин (індекс мітки — ІМ) із різною інтенсивністю, яку оцінювали візуально. У кожному випадку аналізували від 800 до 1000 епітеліальних клітин. Отримані дані оцінювали за такими параметрами: для р53 ІМ < 10,0% — низький рівень експресії, 10,0% ≤ ІМ < 30,0% — високий рівень, ІМ ≥ 30,0% — гіперекспресія; для р21WAF1/CIP1 ІМ < 7,0% — низький рівень експресії, 7,0 ≤ IМ < 15,0% — високий рівень, ІМ ≥ 15,0% — гіперекспресія; для р16INK4a ІМ ≤ 10,0%

–низький рівень експресії, 10,0% ≤ ІМ < 20,0% — ви­

сокий рівень, ІМ ≥ 20,0% — гіперекспресія.

Проліферативний потенціал (індекс проліферації — ІП) визначали при підрахунку кількості клі­ тин, експресуючих Кі­67: ІП < 10,0% — низька, ІП ≥ 10,0% — висока проліферативна активність

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У контрольній групі пацієнток із незміненим ендометрієм встановлено його низьку проліферативну активність, негативну експресію р53, низький рі­ вень експресії р21WAF1/CIP1 (ІМ 1,4 ± 0,3%) та високий рівень експресії р16INK4a (19,2 ± 0,5%).

На відміну від цього, при ЗГЕ високу проліферативну активність було виявлено у ендометрії 50,0% хворих у фазі проліферації менструального циклу, 54,5% — у фазі секреції. У хворих на ЗГЕ менопаузального періоду та при АГЕ висока проліферативна активність встановлена у 55,5 та 40,0% випадків відповідно. Слід зазначити, що експресія антигену Кі­67 відповідала високому рівню проліферації в усіх групах хворих, але при ЗГЕ у менопаузальному періоді та АГЕ цей показник досягав максимальних значень, відповідно 18,2 ± 0,8 та 15,0 ± 0,5% (рис. 1). Звертає увагу гетерогенність експресії Кі­67 при ЗГЕ, яка була найбільш виражена у хворих репродуктивного віку (індивідуальні коливання становили 1,5–37,1%). Важливо відмітити, що у деяких ви­

падках ЗГЕ у хворих репродуктивного та особливо менопаузально віку виявлено збільшення проліферативної активності до рівня такої у високодиференційованих аденокарциномах [7]. При АГЕ гетерогенність експресії Кі­67 була менш виражена.

Рис. 1. Експресія біомолекулярних маркерів у клітинах гі­ перплазованого ендометрія: 1 — залозева гіперплазія (фаза проліферації менструального циклу); 2 — залозева гіперплазія (фаза секреції менструального циклу); 3 — залозева гіперплазія (менопауза); 4 — атипова гіперплазія.

Експресія р53 при усіх досліджених патологічних процесах була негативною, за виключенням двох випадків ЗГЕ у фазі секреції та проліферації (0,2 та 4,5%, відповідно).

ІМ при визначенні р21WAF1/CIP1 у хворих на ЗГЕ становив 4,3 ± 0,2%, що свідчить про низький рівень експресії цього маркеру. Слід відмітити варіабельність показника від негативної до гіперекспресії у групі хворих на ЗГЕ у фазі проліферації менструального циклу; тобто спостерігалась тенденція до підвищення експресії р21WAF1/CIP1 у порівнянні з такою при ЗГЕ у фазі секреції та менопаузі, де маркер слабо експресувався лише в окремих випадках. У жодному із зразків АГЕ експресію р21WAF1/CIP1 не виявлено.

Результат аналізу експресії р16INK4a показав, що найбільш високі показники відзначали при ЗГЕ менопаузального періоду та АГЕ, де у 100,0% випадків встановлена гіперекспресія цього маркера. У хворих на ЗГЕ у фазі проліферації та у у фазі секреції менструального циклу гіперекспресія р16INK4a виявлена у 44,4 та 90,0%, відповідно.

Цікавим є факт, що у спостереженнях ЗГЕ, яким був властивий високий рівень експресії р21WAF1/CIP1 (7,0 ≤ IМ < 15,0%), була виявлена низька проліферативна активність (до 10,0% експресуючих клітин) та гіперекспресія р16INK4a. Отримані результати, можливо, відображають тандемну дію представників двох родин інгібіторів циклін­залежних кіназ (CIP/KIP та INK4), яка і приводить до зменшення проліферації. Враховуючи виявлену нами негативну експресію антигену р53, природним є питання, яким чином стимулюється експресія р21WAF1/CIP1 у цих випадках. Ві­ домо, що ген р21WAF1/CIP1 може активуватись двома шляхами: р53­залежним та р53­незалежним, тобто на рівень його експресії можуть безпосередньо впливати і інші фактори (а саме фактор росту фібробластів, епідермальний фактор росту) та мітогенні сигнали,

але тільки у клітинах із немутованим геном ТР53 [8]. Прогестерон також може безпосередньо активувати інгібітори p21WAF1/CIP1 та p27КIP1 і таким чином гальмувати клітинний цикл і значно зменшувати кількість проліферуючих клітин [9]. Враховуючи той факт, що 60,0–70,0% ЗГЕ виникають на фоні гіперпродукції естрогенів і зниження рівня прогестерону імовірні­ ше за усе виявлене підвищення експресії р21WAF1/CIP1 в епітеліальних клітинах гіперплазованого ендометрія відображає комплексну дію багатьох факторів, але на нашу думку, в даному випадку переважна роль належить гормональному впливу [10].

На особливу увагу заслуговують результати дослідження рівня експресії біомаркерів у двох спостереженнях АГЕ (хвора К.,51 рік, хвора М., 47 років). В одному із них (хвора К.), у гістологічному препараті на фоні АГЕ виявлено вогнища початкової малігнізації, у другому (хвора М.) — у матеріалі зскребків були виявлені розростання аденоматозної карциноми, проте у операційному матеріалі було визначено діагноз — АГЕ. У матеріалі цих хворих встановлена низька проліферативна активність епітеліальних клітин (ІП < 10,0%) із одночасно високою експресією антигену р16INK4a (рис. 2). При аналізі р53 та р21WAF1/CIP1 у цих хворих виявлена різна спрямованість змін їх експресії, а саме, у хворої М. встановлена гіперекспресія р53 (ІМ= 91,0%) тар21WAF1/CIP1 (ІМ= 28,5%), аухворої К. виявлено низький рівень експресії р53 (ІМ < 10,0%) та негативну експресію р21WAF1/CIP1 з одночасно достовірно більш високимрівнемекспресіїр16INK4a. Нанашпогляд, отримані дані відображають різні шляхи регуляції проліферативної активності епітеліальних клітин ендометрія. Якщо у хворої М. цей процес відбувається за механізмом р53→р21WAF1/CIP1 та р16INK4a, то у хворої К. інгібування проліферації забезпечується лише р16INK4a­залежним механізмом (Rb/cyclinD/cdk4/p16INK4a) і можливо іншими шляхами. При цьому гіперекспресія білків р53 та р21WAF1/CIP1 може бути результатом гормонального впливу, оскільки їх гени є мішенями дії естрогену та прогестерону [9]. Підтвердженням чутливості ендометрія до гормональної дії у цьому випадку є виявлена нами висока експресія у матеріалі естрогенових та прогестеронових рецепторів. Таким чином, наведені приклади ілюструють різні кооперації генів, щовизначають проліферативний потенціал ендометрія.

Рис. 2. Зіставлення рівнів експресії маркерних білківу двох хворих на АГЕ.

Окремо слід проаналізувати значення виявленого нами у хворої К. високого рівня експресії білку р16INK4a. За даними літератури недостатність або втрата експресії гена INK4a асоціюється з агресивним фенотипом, а висока експресія р16INK4a є позитивною прогностичною ознакою [11]. У той же час, на наш погляд при визначенні прогнозу перебігу захворювання, некоректно орієнтуватися на значення лише одного показника, оскільки такий підхід може привести до хибно­позитивних результатів. Доказом цього є, по­перше, виявлена у цієї пацієнтки при морфологічному дослідженні початкова малігнізація, а по­друге, наявність в анамнезі рецедивуючих маткових кровотеч. Тобто ця хвора потребує подальшого лікування у закладі онкологічного профілю.

ВИСНОВКИ

1. Кі­67 є об’єктивним показником темпу росту епітеліальних клітин ендометрія, який можна використовувати як уточнюючу характеристику при визначенні інтенсивності проліферативних процесів у хворих на ЗГЕ та АГЕ.

2. Хворі на ЗГЕ менопаузального періоду та АГЕ з високим рівнем експресії Кі­67 складають групу ризику по малігнізації і підлягають подальшому динамічному спостереженню. У той же час у деяких хворих на гіперплазію відзначають низький рівень проліферативної активності епітелію, що може свідчити про позитивний прогноз захворювання.

3. Показники експресії р53, р21WAF1/CIP1 та р16INK4a можуть бути використані в якості характеристик для оцінки шляхів регуляції проліферативного потенціалу при гіперпластичних процесах ендометрія.

ЛІТЕРАТУРА

1. Чернышова АЛ, Коломиец ЛА, Крицкая НГ, Суходоло ИВ. Прогностические критерии онкологического риска при пролиферативных процессах эндометрия. Росс онкол журнал 2000; (3): 23–5.

2. Дерижанова ИС. Эволюция представлений о предопухолевых процессах и возможности их морфологической верификации. В: Тезисы доклада IV Конференции российских паталогоанатомов “Новые методы и разработки в онкоморфологии”. Москва, 2005: 46–9.

3. Новикова ЕГ, Чулкова ОВ, Пронин СМ. Лечение атипической гиперплазии эндометрия. Практ онкология 2004; 5 (1): 52–9.

4. Ambros RA. Simple hyperplasia of endometrium. Estimation proliferative activity on level Ki­67. Int J Gyn Path 2000; (19): 206–11.

5. Ioachim E, Kitsiou E, Mitselou A, et al. p21(WAF1/Cip1) protein expression in normal, hyperplastic and malignant endome­ trium. Correlation with hormone receptor status, C­ERBB­2 on­ coprotein, BCL­2 and other cell cycle related proteins (RB, P53, Ki­67, PCNA). Experimental Oncology 2003; 25 (3): 200–5.

6. Pallazo JP, Mercer WE, Kovatich MS, Hugh M. Immunohistochemical Localization of p21 WAF1/Cip1 in Normal, Hyperplastic, and Neoplastic Uterine Tissues. Human Pathol 2004; 28 (1): 60–6.

7. Бучинськая ЛГ, Полищук ЛЗ, Воробъева ЛИ и др. Экспрессия маркеров пролиферации в клетках аденокарцином эндометрия. Онкология 2004; 6 (4): 265–8.

8. Michieli P, Chedid M, Lin JH, et al. Induction of WAF1/CIP1by a p53­independent Pathway. Cancer Res 1994; 54 (13): 3391–5.

9. Donghai D, Wolf DM, Litman SE, et al. Progesterone inhibits human endometrial cancer cell growth and invasiveness: Down­ Regulation of cellular adhesion molecules through progesterone B receptors. Cancer Res 2002; 62 (1): 881–6.

10. Бохман ЯВ. Руководство по онкогинекологии. Л.: Медицина, 1989. 463 с.

11. Salvesen HB, Das S, Akslen LA. Loss of nuclear p16 protein expression is not associated with promoter methylation but defines a subgroup of aggressive endometrial carcinomas with poor prognosis. ClinCancer Res 2000; (6): 153–59.