МОДИФІКОВАНА ХІМІОТЕРАПІЯ ХВОРИХ НА МІСЦЕВОПОШИРЕНИЙ РАК МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ

Безденежних Н.А., Галахін К.О., Денека Е.Р., Кудрявець Ю.Й., Лигирда Н.Ф., Лигирда О.Ф.

Наведені результати лікування хворих на місцево-поширений рак молочної залози (РМЗ) із застосуванням неоад’ювантної системно-селективної поліхіміотерапії у поєднанні з хіміомодифікатором (глюконатом кальцію). Отримані дані експериментальних досліджень з використанням культур клітин РМЗ in vitro та безпосередні результати лікування довели доцільність та безпечність застосування глюконату кальцію як важливого компонента розробленої авторами схеми терапії.


Лікування хворих на місцево-поширені форми раку молочної залози (РМЗ) залишається актуальною проблемою у сучасній клінічній онкології, оскільки захворюваність на РМЗ в Україні в 2005 р. становила 60,3 випадків на 100 тис. жіночого населення, летальність — 30,1 випадків відповідно [1].

Незважаючи на високий рівень ранньої діагностики початкових стадій захворювання на РМЗ (73,1%), у нашій країні у 2005 р. виявлено до 24,5% випадків РМЗ ІІІ–ІV стадії, що призводить до підвищення затрат на комплексне лікування в 25–30 разів порівняно з ранніми стадіями [2], а також до погіршення показників віддалених результатів (безрецидивна, 3- та 5-річна виживаність). За даними Національного інституту раку США показники 5-річної виживаності залежно від ступеня розповсюдженості пухлинного процесу становлять: 0 стадія — 99, І стадія — 92, ІІА стадія — 82, ІІВ стадія — 65, ІІІА стадія — 47,

ІІІВ стадія — 44, ІV стадія — 14% [3].

Сучасною методологією лікування хворих репродуктивного віку на місцево-поширений РМЗ є комбінований підхід, при якому на першому етапі з метою зменшення ступеня розповсюдженості пухлинного процесу проводиться декілька курсів неоад’ювантної хіміотерапії (НХТ) із наступним хірургічним лікуванням та післяопераційною (ад’ювантною) терапією [4–7]. Відомо, що НХТ спрямована на переведення первинно-неоперабельних форм РМЗ у резектабельні шляхом зменшення розміру пухлини та гальмування метастатичного росту, елімінацію ракових клітин [8–12]. Застосування НХТ дозволяє визначати чутливість пухлини до хіміотерапевтичних препаратів (ХП) для подальшого призначення ад’ювантного лікування. НХТ, як правило, виконується системно — внут-

 

рішньовенно (в/в), найчастіше за схемами CAMF, СAF, AC. Об’єктивна відповідь при даних режимах хіміотерапії (ХТ) становить до 85,0% при загальній патоморфологічній відповіді — 87,8%. При проведенні ХТ найчастіше виникають такі побічні явища як диспепсія (нудота, блювота) та імуносупресія 3– 4-го ступеня токсичності, яку відзначають у 36,0% пацієнтів [12]. Усе це погіршує якість життя хворих, потребує вимушеної перерви у лікувальному процесі, що знижує його ефективність.

Для запобігання вищевказаних негативних наслідків в/в ХТ та підвищення ефективності протипухлинної дії використовується внутрішньоартеріальна поліхіміотерапія (ВАПХТ) [13–28]. Найбільш оптимальним методом ВАПХТ при лікуванні місцево-поширених форм РМЗ є катетеризація внутрішньої грудної артерії. Основна частина кровопостачання молочної залози здійснюється за рахунок гілок внутрішньої грудної артерії (до 60%), та решта — латеральною та верхньою грудними артеріями. Спосіб ВАПХТ через внутрішню грудну артерію дозволяє локально підводити ХП безпосередньо до пухлини, що гальмує її проліферативну активність, мінімізує токсичний вплив НХТ. Методику ВАПХТ проводять у середньому до 3 курсів у режимі тривалої безперервної інфузії ХП у запланованому обсязі перед хірургічним лікуванням. Недоліком цього способу є обмежена можливість вибору ХП для внутрішньоартеріального (в/а) введення. Застосування інтенсивних режимів НХТ (антрациклінів, препаратів платини, таксанів) може призводити до стеатонекрозів шкіри та підшкірної жирової клітковини молочної залози, хімічних опіків ендотелію судин, що катетеризуються, ускладнюючи тим самим виконання радикальної мастектомії.

Відомо, що для підвищення ефективності лікування поряд з НХТ застосовують імунота ензимотерапію, гіпертермію та гіперглікемію, внутрішньосудинне лазерне опромінення крові [3, 13, 29]. Однак сукупні результати оцінки лікувального патоморфозу РМЗ за даними власного досвіду свідчать не тільки про переваги, а й про недоліки цих методів. Так, вищевказані ад’юванти достовірно, хоча і опосередковано, підвищують девіталізуючу дію ХТ на пухлину, однак безпосередньо не впливають на внутрішньоклітинний метаболізм ракових клітин, не пошкоджують їх ядерний апарат, не зумовлюють некроз.

У зв’язку з цим підвищений інтерес викликають

відомості про роль іонних каналів у процесах клі-

внутрішніх квадрантах, а також при наявності вторинного набряково-інфільтративного компонента — 28 хворих.

Розподіл пацієнток на місцево-поширені форми РМЗ за віком і стадією наведено відповідно в табл. 1, 2.

Таблиця 1 Розподіл хворих на місцево-поширені форми РМЗ

за віковими групами

Вік (роки)Група хворих

1-ша (n = 32),

n (%)2-га (n = 29),

n (%)

3-тя (n = 28),

n (%)

30–398 (25,0 ± 7,7)7 (24,1 ± 8,0)7 (25,0 ± 8,2)
40–4916 (50,0 ± 8,8)16 (55,2 ± 9,2)14 (50,0 ± 9,5)
50–558 (25,0 ± 7,7)6 (20,7 ± 7,5)7 (25,0 ± 8,2)

Примітка: в усіх випадках р > 0,05.

тинної проліферації та індукованого апоптозу [30]. На сьогодні активно вивчають вплив іонів кальцію (Ca2+) як модифікатора антибластомного впливу та індуктора апоптозу при карциномах молочної залози та передміхурової залози [31–33]. Саме цей метаболіт є потенційним профілактичним агентом у запобіганні розвитку РМЗ [31, 34]. В експериментах in vivo з використанням перевивних пухлин молочної залози, а також на ракових клітинах молочної залози людини іn vitro показано, що в умовах кальцієвого перевантаження (домінування внутрішньоклітинного Ca2+ над позаклітинним) гальмується клітинний цикл у фазі G1, лімітується або зупиняється клітинне розмноження, розвиваються цитотоксичні ефекти [35].

Метою даного дослідження є підвищення ефек-

тивності протипухлинного лікування хворих на місцево-поширені форми РМЗ шляхом розробки та застосування неоад’ювантної ВАПХТ модифікованої глюконатом кальцію (ГК).

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Клінічні дослідження. Як НХТ у хворих репродуктивного та пременопаузального віку з місцевопоширеними формами РМЗ (T3-4N1-2M0) застосовують ВАПХТ, здійснювану шляхом катетеризації внутрішньої грудної артерії на боці пухлинного ураження молочної залози. Локалізація РМЗ: внутрішні та центральні квадранти молочної залози. Для визначення тактики лікування до початку ВАПХТ виконували тонкоголкову аспіраційну біопсію для цитологічної верифікації РМЗ. Усі пацієнтки у даному дослідженні були розподілені на 3 групи: 1-ша (контрольна) група — неоад’ювантна системна (в/в) ПХТ за схемою CАMF при локалізації пухлини у зовнішніх квадрантах — 32 хворі; 2-га група — неоад’ювантна ВАПХТ за схемою CMF у поєднанні з в/в введенням антрациклінів (епірубіцин у дозі 60 мг/м2) при локалізації пухлини в центральному секторі або внутрішніх квадрантах — 29 хворих; 3-тя група — неоад’ювантна ВАПХТ за схемою CMF у поєднанні з в/в введенням антрациклінів (епірубі- цин у дозі 60 мг/м2) та ГК як модифікатора цитостатичної дії ХП (10% розчин у дозі 5,0 мл на введення) при локалізації пухлини у центральному секторі або

Таблиця 2

Розподіл хворих за стадією процесу

Стадія процесуГрупа хворих
1-ша (n = 32),

n (%)

2-га (n = 29),

n (%)

3-тя (n = 28),

n (%)

ІІІА25 (78,1 ± 7,3)24 (82,8 ± 7,0)22 (78,6 ± 7,8)
ІІІБ7 (21,9 ± 7,3)5 (17,2 ± 7,0)6 (21,4 ± 7,8)

Примітка: в усіх випадках р > 0,05.

У 1-й групі хворим проводили 3 курси системної (в/в) НПХТ за схемою CАMF (циклофосфамід — 500 мг/м2 в/в у 1-й та 8-й день, метотрексат — 40 мг/м2 в/в у 1-й та 8-й день, флуороурацил — 500 мг/м2 в/в у 1-й та 8-й день, епірубіцин — 60 мг/м2 в/в у 1-й та 8-й день) з інтервалом між курсами 3 тиж.

У 2-й та 3-й групах хворим проводили катетеризацію внутрішньої грудної артерії на ураженому боці. Під загальним знеболенням у проекції перетину реберної дуги та медіального краю прямого м’яза живота косим розрізом паралельно реберній дузі розтинали шкіру, підшкірну жирову клітковину та поверхневий листок апоневрозу прямого м’яза живота. Волокна прямого м’яза живота відокремлювали до внутрішнього листка апоневрозу. Виконували сепаровку з мобілізацією верхньої епігастральної артерії, дистальний кінець якої перев’язували, а у проксимальний за допомогою судинорозширювача вводили катетер в основний стовбур внутрішньої грудної артерії до рівня ІІ міжребер’я. Судину над катетером перев’язували. Рану пошарово зашивали з виведенням катетера назовні через контапертуру та фіксуванням його до шкі- ри вузловим швом. Катетер промивався розчином гепарину (5000 ОД гепарину на 10,0 мл фізіологічного розчину). Топографію встановленого катетера визначали інтраопераційною ангіохроматографією шляхом введення в/а 2 мл водного розчину метиленового синього та рентгенваскулярного контрастування («Омніпак» виробництва фірми «N»).

Наступного дня після оперативного втручання починали проведення ВАПХТ. Тривалість лікування — 11 днів, сумарна доза ХП: метотрексат — 120 мг, циклофосфамід — 2 г, флуороурацил — 2,5 г та епірубіцин 60 мг/м2. У 3-й групі хворих безпосередньо за 20 хв до проведення ВАПХТ щодня в/а вводили по 5,0 мл 10% розчину ГК з подальшим введенням ХП у стандартних терапевтичних дозах. Сеанс ВАПХТ проводили за допомогою апарата «a -». У подальшому повторні кур-

си проводили кожні 3 тиж. Після закінчення НХТ при досягненні максимальної об’єктивної відповіді на неоад’ювантне лікування проводили операцію — радикальну мастектомію з наступною ад’ювантною терапією (ПХТ, променева, гормональна терапія). Для морфологічного дослідження операційного матеріалу РМЗ з пухлини вирізали три тканинних пластинки (по одній з периферичної, проміжної, центральної зони пухлинного вузла) з подальшим виготовленням гістологічних зрізів, що забарвлювали гематоксиліном-еозіном, пікрофуксином. Проведено кількісні підрахунки патологічних мітозів і апоптозів з розрахунку на 1 поле зору при стандартному збільшенні (х 120) (світловий мікроскоп «a-2»,

«Rih», Австрія). Підрахунок здійснено за відомими формулами, що використовують у морфології

  1. з визначенням середньоарифметичного показника дольового вмісту дослідженого компонента в пухлині РМЗ (М ± м, %). При застосуванні електронної мікроскопії ультратонкі зрізи РМЗ обробляли лантаном (колоїдна форма, H-8,1) за методикою R, Kask. Для порівняльної морфологічної оцінки виділили 0 групу (операційний матеріал РМЗ без неоад’ювантного лікування — контроль).

    Експериментальні дослідження. ГК вивчали in vitro в культурах клітин РМЗ людини (лінії MCF-7, T-47 D, культури пухлинних клітин, отриманих з плеврального ексудату хворих на РМЗ).

    Клітини як постійних ліній, так і первинних культур з плеврального ексудату культивували в повному поживному середовищі DMEM («Фармбіотек», Україна), що містило 4 ммоль/л L-глютаміну, 10% (15% у випадку первинних культур) ембріональної сироватки теляти («GMA», США), 40 мкг/мл гентаміцину та 50 мкг/мл амфотерицину В («GMA», США) у зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 37 °С.

    Заміну середовища проводили кожні 2 доби. Пере-

    сів клітин здійснювали за допомогою розчину трипсин-версена при утворенні клітинами на субстраті суцільного моношару (4–5-та доба росту). Суспензію клітин вносили у 96- або 24-лункові планшети у концентрації відповідно 2–3 × 104 (у 100 мкл)

    або 4–5 × 104 клітин/лунку (в 1 мл). Наступного дня у лунку вносили досліджувані (ГК, ГК + доксорубіцин) препарати та результати їх дії аналізували через 24, 48 та 72 год. Внесення свіжої порції препаратів повторювали щодоби. При використанні 24-лункових планшет візуалізацію живих та мертвих клітин проводили за допомогою забарвлення трипановим синім з наступним підрахунком клітин у гемоцитометрі. У 96-лункових планшетах результати реєстрували через 48–72 год за допомогою RB-тесту [36]. Для морфологічних досліджень препарати клітинних суспензій висушували та забарвлювали за Папенгеймом, аналізували за допомогою бінокулярного мікроскопа Aisa s («Ca iss», Німеччина) при збільшенні 400–1000. Вивчення культур живих клітин (вирощували в 6-луночних планшетах Gi, проводили за допомогою інвертовано-

    го мікроскопа Ai 25 («Ca iss», Німеччина) при збільшенні в 100–320. Препарати живих та забарвлених клітин фотографували за допомогою цифрової фотокамери Ca h G5 (Великобританія).

    Статистичну обробку даних проводили за допомогою критерія Стьюдента.

    РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

    Ефективність передопераційного лікування оці- нювали за безпосередніми результатами терапії (пальпаторне дослідження пухлини молочної залози, мамографія) та показниками лікувального патоморфозу РМЗ (операційний матеріал).

    Об’єктивну відповідь оцінювали за критеріями ВООЗ за методом RECT (табл. 3): повна регресія пухлини (CR) — повна відсутність вимірюваної пухлини; часткова регресія пухлини (R) — регресія пухлини більша за 30%; стабілізація захворювання (D) — регресія пухлини менша за 30% або відсутність змін у розмірах пухлини.

    Таблиця 3

    Об’єктивний ефект після проведення НХТ

    Об’єктивна відповідьГрупа хворих
    1-ша (n = 32),

    n (%)

    2-га (n = 29),

    n (%)

    3-тя (n = 28),

    n (%)

    Повна регресія (CR)2 (6,3 ± 4,3)2 (6,9 ± 4,7)8 (28,6 ± 8,5)а, б
    Часткова регресія (PR)21 (65,6 ± 8,4)20 (79,3 ± 7,5)19 (67,8 ± 8,8)
    Стабілізація хвороби (SD)8 (25,0 ± 7,7)4 (13,8 ± 6,4)1 (3,6 ± 3,5)а
    Прогресування хвороби1 (3,1 ± 3,0)0 (0,0)0 (0,0)

    аРізниця вірогідна відносно показника 1-ї групи (р < 0,05); брізниця

    вірогідна відносно показника 2-ї групи (р < 0,05).

    При дослідженні ефективності лікування хворих на РМЗ встановлено, що CR у 1-й групі відзначено у 2 пацієнток (6,3 ± 4,3%), у 2-й та 3-й — відповідно у 2 (6,9 ± 4,7%) та 8 (28,6 ± 8,5%). R виявлено в усіх 3 групах, але з певною різницею у показниках: у 1-й — у 21 хворої (65,6 ± 8,4%), у 2-й — 20 (79,3 ±

    7,5%), у 3-й — 19 (67,8 ± 8,8%). Вірогідне збільшення загальної об’єктивної відповіді (CR + R) визначено у хворих 2-ї та 3-ї груп (86,2 та 96,4%) порівняно з пацієнтами 1-ї групи (71,9%).

    При порівняльній оцінці побічних ефектів також виявлена достовірна різниця (табл. 4). При зіставленні мієлотоксичності схем НХТ лейкопенію ІІІ– ІV ст. відзначали у 8 (25,0 ± 7,7%) хворих 1-ї групи, 3 (10,3 ± 5,7%) — 2-ї та у 1 (3,6 ± 3,5%) — 3-ї.

    Таблиця 4 Порівняльна оцінка побічних ефектів після проведення НХТ

    Побічні ефектиГрупа хворих
    1-ша (n = 32),

    n (%)

    2-га (n = 29),

    n (%)

    3-тя (n = 28),

    n (%)

    Лейкопенія ІІІ–ІV ст. ток-

    сичності

    8 (25,0 ± 7,7)3 (10,3 ± 5,7)1 (3,6 ± 3,5)*
    Нудота/блювота ІІІ–ІV ст.

    токсичності

    3 (9,4 ± 5,2)1 (3,4 ± 3,4)1 (3,6 ± 3,5)
    Больові відчуття у груд-

    ній клітині

    0 (0,0)3 (10,3 ± 5,7)2 (7,1 ± 4,9)
    Поверхневий епітеліїт0 (0,0)2 (6,9 ± 4,7)1 (3,6 ± 3,5)

    *Різниця вірогідна відносно показника 1-ї групи (р < 0,05).

    Випадків субфебрильної нейтропенії під час лі- кування не зафіксовано. При оцінці побічних ефектів НХТ суттєвих ознак системної токсичності під час проведення ВАПХТ за даною методикою не зареєст-

    ровано. У 3 (9,4 ± 5,2%) пацієнток під час проведення в/в ПХТ відзначали нудоту/блювання ІІІ–ІV ст., що потребувало призначення антиеметичних препаратів, засобів дезінтоксикаційної терапії. При застосуванні ВАПХТ диспептичні явища мали транзиторний характер за інтенсивністю та тривалістю і не потребували значної медикаментозної корекції. 5 пацієнток з 2-ї і 3-ї груп скаржилися на больові відчуття у ділянці грудної клітки при повторних курсах ВАПХТ, що, імовірно, пов’язано з мікротромбозом дрібних судин. Через 1– 2 тиж після проведення ВАПХТ у 2 хворих (6,9 ± 4,7%) у 2-й групі та у 3 (3,6 ± 3,5%) — 3-й групі визначали поверхневий епітеліїт у вигляді гіперемії шкіри молочної залози, якийз часом зникав без виникнення рубців, залишаючи осередки гіперпігментації шкіри. Хімічних опіків та некротичних змін не відзначали.

    Заслуговують на особливу увагу виявлені при

    мікроскопічному дослідженні РМЗ відмінності у розвитку терапевтичного патоморфозу (табл. 5, рис. 1– 5). Порівнянно з контролем, де зареєстровані лише дрібноосередковані локальні некрози окремих ракових клітин та їх груп (комплексів), у 2-й і 3-й групах зафіксовані більш поширені зміни РМЗ, переважно периваскулярної локалізації. Незворотня альтерація виникала навколо власних судин карцином (рис. 1) з явищами мікротромбозу (рис. 2) та геморагічної імбібіції паренхіматозно-стромальних структур РМЗ з їх втратою (рис. 3). Виходячи з таких особливостей лікувального патоморфозу (див. рис. 1, 2, 3) є очевидним факт переносу молекул ХП через стінки судин у пухлинні клітини та оточуючу їх строму. З часом через 2–3 тиж після ВАПХТ у хворих 2-ї та 3-ї груп некротичні ділянки поєднуються з розростанням сполучної тканини, внаслідок чого вміст непухлинного компоненту значно домінує над резидуальним пухлинним (рис. 4). Логічне питання щодо визначення порівняльної ефективності ВАПХТ у хворих 2-ї та 3-ї груп, що оцінювали на підставі кількісного підрахунку (табл. 5) залишкового пухлинного компонента — структурно збережених ракових клітин без ознак альтерації ядерного апарату (патологічних мі- тозів, апоптозу), що дозволяло такі клітини вважати потенційно спроможними до проліферації.

    image

    Рис. 1. Поширена зона некрозу навколо двох судин РМЗ. Стан після кальцієвої модифікації ВАПХТ. Гематоксилінеозін. Зб. × 200

    Таблиця 5 Порівняльна ефективність НПХТ за результатами вивчення

    життєздатного резидуального пухлинного компоненту (ЖРПК)

    Дольовий вміст ЖРПК (М ± m, %)
    Контроль

    (n = 30)

    1-ша група

    (n = 32)

    2-га група

    (n = 29)

    3-тя група

    (n = 28)

    62,2 ± 6,356,8 ± 5,840,1 ± 4,28,4 ± 1,3а, б, в

    аРізниця вірогідна відносно показника контрольної без неоад’ювантного лікування) групи (р < 0,05); брізниця вірогідна відносно показника 1-ї групи (р < 0,05); врізниця вірогідна відносно показника 2-ї групи (р < 0,05). Аналіз отриманих даних переконливо свідчить, що системна в/в НХТ є недостатньо ефективною, оскільки не приводить до суттєвого збільшення кількості пухлинних клітин з виходом в апоптоз.

    image

    Рис. 2. Мікротромбоз, некроз РМЗ. Стан після кальцієвої модифікації ВАПХТ. Гематоксилін-еозін. Зб. × 200

    image

    Рис. 3. Геморагічна інфільтрація РМЗ з втратою паренхі- матозно-стромальної будови. Стан після кальцієвої модифікації ВАПХТ. Гематоксилін-еозін. Зб. × 200

     

    image

    Рис. 4. Некрози РМЗ в оточенні розростань сполучної тканини. 3 тиж після кальцієвої модифікації ВАПХТ. Гематоксилін-еозін. Зб. × 200

     

    image

    Рис. 5. Електронно-щільні гранули лантану в позаклітинному просторі і на плазмалемі пухлинної клітини. Контроль (операційний матеріал пацієнтки, якій не проводили неоад’ювантне лікування). Зб. × 6000

     

    image

    Рис. 6. Лінійні преципітати лантану контрастують контури плазмалем декількох суміжних пухлинних клітин. Контроль (операційний матеріал пацієнтки, якій не проводили неоад’ювантне лікування). Зб. × 12 000

     

    image

    Рис. 7. Гранулярні та лінійні преципітатилантану в мітохондріях. Стан після кальцієвої модифікації ВАПХТ. Зб. × 20 000

     

    image

    Рис. 8. Преципітати лантану на каріолемі ядра пухлинної клітини. Стан після кальцієвої модифікації ВАПХТ. Зб. × 15 000

    Вірогідна ефективна антибластомна дія визначається у 2-й і 3-й групах при порівнянні з групою контролю. Найбільш поширена (порівняно не тільки з контролем, але й з 1-ю та 2-ю групами) девіталі- зація ділянок РМЗ із втратою спроможності до подальшої репродукції ракових клітин зафіксована у 3-й групі. Виходячи з особливостей лікувального патоморфозу РМЗ, відзначених у хворих, які отримували ГК, ми вважали за доцільне з’ясувати механізми розвитку такого високого хіміотерапевтичного ефекту цієї схеми.

    Беручи до уваги значну роль Сa2+ як модулятора проліферації клітин та апоптозу, логічно проаналі- зувати можливість кальцієвого перевантаження як дієвого механізму ефективності схем лікування з використанням ГК. З цією метою застосований метод контрастування ультратонких зрізів РМЗ іонами рідкоземельного металу La3+. Він є одним з найкращих маркерів мембранної проникності клітин, що застосовують в електронній мікроскопії (розмір часточок 0,114 нм), контрастує надмембранні структури клітин (глікокалікс) і є трейсером-пенетрантом для тих клітин, у яких відбувалась альтерація глікокаліксу і/або їх зовнішніх мембран (плазмалем). У рамках виконаної науково-дослідної роботи «Вивчення морфологічних основ патології мембран клітин пухлин та особливостей їх лікувального патоморфозу» (1989–1991 рр.) в Інституті онкології доведено, що катіони лантану в інтактних клітинах (без неоад’ювантного впливу) розподіляються у вигляді чисельних електронно-щіль-

     

    image

     

    image image

     

    image

     

    image

     

    image

     

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    image

    Рис. 9. Вплив ГК на проліферацію клітин ліній MCF-7 (а) і T- 47D (б)

     

    image

    е

     

    Рис. 10. Морфологія та проліферативна активність первинних культур клітин з плеврального ексудата пацієнток з РМЗ при дії in vitro ГК: а — контрольна культура; б — ГК 0,1 мг/мл; в – ГК 1 мг/мл; г — 10 мг/мл; д — ГК 10 мг/мл (короткочасна обробка протягом 1 год щоденно); е — діаграма цитотоксичної дії ГК у різних концентраціях та протягом різного часу. Облік результатів проводився через 3 доби після початку досліду. Живі культури. Зб. х 320

    них гранулярних часточок у міжклітинних просторах (рис. 5), утворюють лінійні преципітати ззовні плазмалем, контрастуючи їх (рис. 6); при застосуванні гіпертермії, опромінення, фармакоагентів цитостатиків, покривний глікокалікс стоншується, аж до втрати в окремих локусах плазмалем з ви-

    никненням дефектів (пошкодження фосфоліпідів), через які відбувається підвищений внутрішньоклі- тинний вхід лантанових мікрочасточок. Відомо, що в локусах зв’язування лантану органелами клітин, La3+ заміщує собою катіони Са2+ [37], тобто за топографією розподілу лантану можна судити про ло-

    калізацію кальцію, оскільки локуси їх накопичення є ідентичними [38]. При виконанні даної роботи встановлено, що в 3-й групі обробка лантаном препаратів пухлин призводить до пенетрації його мікрочасточок у цитоплазму з утворенням депозитів на мембранних профілях ендоплазматичної сітки, мітохондрій (рис. 7) та каріолеми (рис. 8). Подібні результати отримано і в 2-й групі, однак з суттєвою різницею: кількість пухлинних клітин, що містять лантан у хворих 3-ї групи в 10–15 разів більше ніж у 2-й. Таким чином завдяки в/а застосуванню ГК закономірним явищем стає феномен кальцієвого перевантаження ракових клітин, який забезпечує підвищення входу в пухлинні клітини ХП. Звідси зрозуміло, що ГК виступає модифікатором-підсилювачем протипухлинної дії ХТ, однак поряд з цим виникає думка і про здатність ГК безпосередньо пригнічувати метаболізм ракових клі- тин, оскільки гіпернакопичення кальцію на профі- лях мембран ендоплазматичної сітки, мітохондріях та ядер призводить до синтетичних, енергетичних та генетичних порушень, навіть до «кальцієвої смерті» пухлинних клітин, зокрема з утворенням кальцифікатів. Останні, як загальновідомо, є морфологічним маркером структурних незворотніх змін у клітинах.

    Результати експериментів in vitro свідчать, що ГК дійсно пригнічує проліферацію пухлинних клі- тин при постійній його присутності в ростовому середовищі у концентрації від 10 мг/мл до 0,1 мг/мл (рис. 9–11). Особливістю його дії є відсутність прямого токсичного ефекту на клітини навіть при високій концентрації — переважно відзначають лише пригнічення проліферації, що відзначають уже на першу добу інкубації. Максимальний ефект ГК відзначають через 48–72 год після внесення препарату. Клітини різних ліній відрізняється за чутливістю до ГК. Так, клітини лінії MCF-7 виявились більш чутливими до ГК, ніж клітини лінії T-47D (рис. 9а, б). Пухлинні клітини з біоптатов також чутливі до антипроліферативної дії ГК. На рис. 10а, б, в, г показано, що підвищення концентрації ГК супроводжується не тільки пригніченням проліферації, але й загибеллю клітин. Як вищезазначено, за схемою клінічного використання ГК вводиться хворим щоденно в/а, створюючи протягом щонайменш 1 год достатньо високу його концентрацію в крові, що поступає в пухлину. У зв’язку з цим in vitro ми спробували відтворити аналогічні умови дії ГК на пухлинні клітини — їх піддавали короткочасному впливу ГК у підвищеній концентрації (протягом 1 год), після чого ГК видаляли, змі- нюючи середовище. Цю процедуру повторювали щоденно протягом 9 днів. У контрольних клітинах лише проводили заміну середовища. Виявилено, що навіть короткочасна дія ГК у високій концентрації на клітини приводить до різкого пригнічення їх проліферативної активності: вже протягом перших діб відбувається рефракція моношару клітин

    у культурі і пригнічення їх ділення з поступовою загибеллю (див. рис. 10е, рис. 11). Через 7–9 діб у дослідній культурі залишаються лише поодинокі клітини або їх острівки (рис. 11б, в). Цитологічний аналіз пухлинних клітин показав, що вже на першу добу після дії ГК у культурі відзначають появу великої кількості конденсованих клітин з гіперх-

     

    image

     

    Рис. 11. Вплив in vitro ГК у високій концентрації (20 мг/мл протягом 1-ї години, повторення процедури — 9 днів) на клітини РМЗ: а — контрольна культура; б, в — дослідні культури

    image

    Рис. 12. Вплив ГК на клітини лінії MCF-7: а — контроль; б — ГК (1 мг/мл, 48 год). Забарвлення за Папенгеймом (цитоспінові препарати; конденсовані клітини позначені стрілками). Зб. х 1000

    ромним ядром і вузькою зоною цитоплазми, що може вказувати на загибель клітин за механізмом апоптозу (рис. 12).

    Відомо, що препарати глюконатів металів, зокрема ГК, здатні знижувати токсичну дію антрациклінових антибіотиків [39–42]. У наших експериментах також показано, що включення до терапевтичних схем ГК супроводжується значним зниженням мієлотоксичних проявів ХТ. Виникає питання відносно модифікації ГК специфічної протипухлинної дії цитостатиків на клітини РМЗ. У зв’язку з цим досліджено на моделі клітин лінії MCF-7 комбіновану дію ГК і антрациклінів на пухлинні клітини in vitro. Доведено, що ГК, подібно до інших глюконатів [41–42], не впливає на специфічну активність цитостатика і навіть сам має певну цитотоксичну активність проти пухлинних клітин (рис. 13).

     

    image

    Рис. 13. Комбінована дія ГК (1 мг/мл, 48 год) та епірубі- цину (0,5; 5 та 10 мкг/мл, 48 год) на клітини РМЗ людини лінії MCF-7

     

    ВИСНОВКИ

    1. Результати проведених досліджень демонструють, що розроблена нами нова схема ХТ у поєднанні з використанням у неоад’ювантному режимі в/а ГК достовірно підвищує ефективність лікування хворих на місцево-поширений РМЗ.
    2. Клінічна доцільність застосування ГК як важливого компонента розробленої нами схеми

підтверджена в експериментальних дослідженнях з використанням культур клітин РМЗ.

ЛІТЕРАТУРА

  1. Федоренко ЗП, Гулак ЛО, Горох ЄЛ та ін. Рак в Україні, 2003–2004. Захворюваність, смертність, виживаність, показники діяльності онкологічної служби. Бюл Націон канцер-реєстру України. К: 2005; (6): 97.

  2. Сенютович РВ, Тащук ВІ, Станкевич ВВ. Скринінг раку молочної залози. Рута, Чернівці. 1999. 200 с.

  3. Зотов АС, Белик ЕО. Мастопатии и рак молочной железы. МЕДпресс-информ, М, 2005. 111 с.

  4. Штегер Г. Адъювантная, неоадъювантная и паллиативная химиотерапия рака молочной железы. Oi(онкологическое обозрение). 2006; (2): 10–7.

  5. Гольдгирш А, Глик ДжГ, Гельбер РД и др. Междунароный консенсус по первичной терапии раннего рака молочной железы. Ст-Галлен, Швейцария, 2005 г. O i (онкологическое обозрение) 2006; (2): 23–38.

6. Kim R, Osaki A, Toge T. C a f s f a-

ahhaiabbasa. CiBasCa 2005;

6 (s 3): 223–32.

  1. Maraz R, Boross G, Svebis M, et al. Rss as f- ig aa hha a bas sig a i a-

    isihaaabasa. Magb 2005; 58 (s 4): 225–32.

    8. Schwartz G. Naa ii hha. Mia Gi 2005; 57 (s 3): 327–48.

    9. Insa A, Chirivella I, Lluch A. Naa ha f ab bas-a. M Ci (Ba) 2006; 126 (8): 295–303.

    10. Suzuki E, Toi M. Naa Chha i bas a-

    . Ni Rish 2006; 64 (3): 536–9.

    1. Kaufmann M, von Minckwitz G, Rody A. ai (- aa) ssi a f bas a. Bas 2005; 14 (6): 576–81.

    2. Moon YM, Rha SY, Jeung HC, etal. Naahha-

      ih ifsia 5-fai, aiai a hshai (iFAC) i a aa bas a: a a ss is g gsis. A O 2005; 16 (11): 1778–85.

    3. Бондар ГВ, Сєдаков ІЄ, Шлопов ВГ. Первинно-неоперабельний рак молочної залози. Донецьк: Каштан, 2005. 347 с.

    4. Югрінов ОГ, Литвиненко ОО, Тельний ВВ и др. Неоад’ювантна селективна внутрішньо артеріальна хіміотерапія місцево поширеного раку молочної залози. Променева діагностика, променева терапія 2004; (4): 32–7.

    5. Takatsuka Y, Shin E, Kikkawa N. A iia iaf aa iaaiahhafhafaaabas

      a. Ga T Kagak R 1996; 23 (11): 1523–5.

    6. Matsumoto Y, Terakado H, Ikawa M, et al. a-aia i- fsi hha f bas a. Ga T Kagak Rh 1996; 23 (11): 1526–8.

    7. Roversi R, Rossi G, Ricci S, Roversi M, et al. a-aia a-

      ibasi a f bas aia. Rai M (Ti) 1998;

      95 (3): 211–6.

    8. Morandi C, Colopi S, Cantore M, et al. a-aia h-

      haiaaabasasa. RaiM (Ti) 1996; 92 (1–2): 101–4.

    9. Chang HT, Mok KT, Tzeng WS, et al. i iaaia

      hhafT4 basahghaiaab-ah-

      ss. A J Ci O 1997; 20 (5): 493–9.

    10. Toda K, Hirata K, Sato T, et al. Hisgia aai f

    h ffs f iaaia hha f aa bas a: a g- f s ih s h sia. g Ta 1998; 28 (5): 509–16.

    21. Stephens FO. aaia ii hha i a aa sag bas a. Ca 1990; 15 (4): 645–50.

    22. Скляр СЮ. Ефективність застосування селективної рентгеноваскулярної внутрішньоартеріальної поліхіміотерапії при лікуванні хворих на рак молочної залози. Онкологія 2006; 8 (2): 196–200.

    23. Nicolato A. a-aiaRgiaChhaaisi

    gia Raiha i h Ta f a Aa a-

    f Bas. Rai M (Ti) 1990; 80 (3): 347–51.

    1. Murakami M, Yoden E, Kono K, etal. Eiia

      faisihaaabasa: iaai- a ifsihhabiih aiha. Nigak Hshas Gakkai asshi 1997; 57 (4): 189–94.

    2. Kramer S, Gorich J, Hasan I, et al. si ia-a-

    ia hha i ha-fa h s f bas aia. Rf 1996; 164 (5): 422–6.

    26. Gorich J, Hasan I, Majdali R. is a, a —

    bas a: a ih ssi iaaia h-

    ha. Raig 1995; 197 (1): 199–203.

    1. Nitz U, Havenith B, Rost B, et al. Lgia ia-aia

      hha f ia iab a f bas a. Gbshif Fahik 1993; 53 (11): 760–7.

    2. Takatsuka Y, Okamura Y, Kawahara T, etal. Ag-f-

      s f ia-aia ifsi hha i a aa bas a. Ga T Kagak Rh 1990; 17: 1682–6.

    3. Тарутинов ВИ. Молочная железа: рак и предраковые заболевания. К, 2006. 415 с.

    4. Schonherr R. Ciia a f i has f iagsis a ha f a. J Mb Bi 2005; 205 (3): 175–84.

    5. Berube S, Diorio C, Verhoek-Oftedahl W, Brisson J. Viai D,

    ai, aagahibassiis. CaEiiBi-

    aks 2004; 13 (9): 1466–72.

    32. Sergeev I. Cai as a ia f 1,25-ihiai D3-i asis. J i Bih M Bi 2004; 89–90 (1–5): 419–25.

    1. Sergeev I. Cai sigaig i a a iai D. J —

      i Bih M Bi 2005; 97 (1–2): 145–51.

    2. O’Kelly J, Koeffler HP. Viai D aag a bas a. R Rss Ca Rs 2003; 164: 333–48.

    3. Ganapathy V, Shyamala Devi C. Efff hisH1 h-

      si ai s i ha bas a MCF-7 s. Lif i 2005; 76 (22): 2631–41.

    4. Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al. N ii —

      iiiassafaia-gsig. JNah Cas 1990;

      82 (13): 1107–12.

    5. Shanlai M, Tavassoli M. Laaas aEMisi sai. J Hish a Ch 1982; 30 (12): 1325–30.

    6. Doggenweiler C, Frenk S. aiig is f aha

      bas. Nah Aa i 1965; 53: 425.

    7. Богуш ТА, Смирнова ГБ, Вихлянцева НО, Сыркин АБ. Влияние глюконата кальция на острую и хроническую токсичность доксорубицина у мышей. Антибиотики и химиотерапия 1997; 42 (1): 17–22.

    8. Богуш ТА, Смирнова ГБ, Вихлянцева НО, Сыркин АБ. Влияние глюконата кальция на токсичность и противоопухолевую активность доксорубицина у мышей. Антибиотики и химиотерапия 1999; (1): 6–10.

    9. Кутняк ВП, Кудрявець ЮЙ, Горчакова НО та ін. Кардіопротекторна ефективність ритмокору при застосуванні антрациклінових антибіотиків. Науковий вісник НМУ 2006; (3): 68–71.

    10. Конкина ИГ, Іванов СП, Князева ОА и др. Физико-химические свойства и фармакологическая активность глюконатов M (), F (), C (), C () и (). Химико-фармацевтический журн 2002; 36 (1): 18–21.

    11. Автандилов ГГ. Медицинская морфометрія. М: Медицина, 1990. 383 с.


Без комментариев » Добавить комментарий