ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ CD45 ПРИ АНАЛИЗЕ ПОПУЛЯЦИИ БЛАСТНЫХ КЛЕТОК У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

Вильчевская Е.В.

Представлены результаты исследования распределения экспрессии антигена CD45 на лимфоцитах гематологически здоровых доноров (n = 19) и больных острыми лейкозами на этапе диагностики (n = 74). Зрелые лимфоциты отличались от бластов более выраженной экспрессией CD45. Гейтирование по CD45 позволяет точно идентифицировать лимфоциты при всех вариантах ОМЛ и ОЛЛ и является удобным средством идентификации патологических клеток.


Лабораторная диагностика острых лейкозов (ОЛ) начинается с выявления в периферической крови и костном мозгу бластных клеток, которые идентифицируются методом световой микроскопии. Иммунодиагностика, как следующий этап диагностики, основана на сопоставлении морфофункциональных и иммунофенотипических характеристик лейкозных бластов и нормальных/нетрансформированных клеток гемопоэза. Первым шагом иммунофенотипирования является выделение пула злокачественных клеток из общей популяции. Для этого необходимо отделить собственно бластные клетки от детрита, слипшихся клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце, а также от некоторого количества нормальных клеток, которые могут сохраняться в пробе. Надо также помнить о возможном разведении образца периферической кровью. Все эти факторы могут серьезно повлиять на конечный результат исследования. Недостаточно четкое гейтирование (выделение бластной популяции) может привести к неверным выводам при анализе иммунофенотипа.

Нашей задачей было проанализировать разли-

чия в экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45 на поверхностных мембранах нормальных лимфоцитов и бластов для иммуноцитофлюориметрического разграничения зрелых лимфоцитов и лейкемических клеток при диагностике острых лейкозов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее исследование включены пациенты (n = 74) с ОЛ, находившиеся на лечении в Отделении онкогематологии для детей Института неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака АМН Украины в период 2005–2007 гг. Среди обследованных было 25 девочек (33,8%) и 49 мальчиков (66,2%). Средний возраст пациентов — 7,1 года. Самому младшему ребенку было 3 мес, самому старшему больному — 18 лет. У всех пациентов было проведено иммунофенотипирование методом проточной

цитометрии. Для анализа светорассеяния нормальных лимфоцитов использовали венозную кровь гематологически здоровых доноров (n = 19).

Материалом для проточноцитометрического исследования у больных с ОЛ являлись костный мозг и периферическая кровь. Вид подготовки пробы по протоколу: окрашивание — лизис — отмывка. Процедура настройки прибора и контроль качества его работы осуществлялся сервисной службой украинского представителя Becton Dickinson (BD) фирмой Bioline-Ukraine. Анализ проводили с помощью программного обеспечения FACSComp (BD), программа CellQUEST. При учете результатов регистрировали как процент клеток, экспрессирующих маркер, так и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ), которую выражали в условных единицах (усл. ед.), соответствующих среднему каналу максимального свечения маркера. Позитивность определяли по отношению к негативному изотипическому контролю. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью стандартной прикладной программы Microsoft Ex- cel 2003, рассчитывая средние значения показателей, ошибку средней и достоверность различий по t-критерию Стьюдента. Коэффициент корреляции r рассчитывали по Пирсону.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Объектом исследования при диагностике ОЛ являлась популяция лейкемических клеток, которую было необходимо выявить в общей массе клеток и охарактеризовать. Анализ клеточной популяции методом проточной цитометрии основан на измерении отдельных клеток (или какой-либо «биологической частицы», включая изолированное ядро, хромосомные препараты или микробиологические организмы) в жидком потоке, во время их прохождения через монохроматический свет, продуцируемый лазером. Физические свойства, такие как размер и диаметр ядра, наличие цитоплазматических гранул, могут быть измерены у отдельной неокрашенной клетки. На основании указанной ин-

формации мы можем разделить все лейкоциты на 3 основные популяции: лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Анализ клеток при ОЛ в целом соответствует тому, что используется при лимфопролиферативных заболеваниях. Для этого выделяют определенную популяцию клеток и осуществляют более прицельный анализ с помощью логического ограничения (гейтирования) по физическим характеристикам клеток и/или на основании экспрессии определенного маркера.

На двухмерных гистограммах (FSC/SSC), где ось x отражает размеры клеток, а ось y — гранулярность, положение нормальных клеток определяется в зависимости от их физических параметров (рис. 1).

image

Рис. 1. Расположение кластеров нормальных клеток

image

Из представленных данных видно, что лимфоциты, как клетки довольно небольшого размера, с невысокой степенью гранулярности, имеют низкие значения как по оси x, так и по оси y. Моноцитарный гейт касается лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в 1,5 раза. Гранулоцитарный гейт касается моноцитарного гейта и распространяется вверх по всей оси SSC.

Анализ клеток при ОЛ также начинается с выделения популяции бластных клеток. В большинстве случаев он ведется в полигоне, по светорассеянию, соответствующему лимфоцитам. Если количество бластных клеток велико (70–90%), анализируется весь регион. Если популяция малоклеточная (до 50%) и присутствуют в большом количестве оставшиеся нормальные лимфоциты, то по параметрам светорассеяния невозможно разграничить бластные клетки и нормальные лимфоциты периферической крови (ЛПК). Как видно на рис. 2, популяция бластов вследствие большой гетерогенности клеток, входящих в ее состав, не может быть идентифицирована по параметрам FSC/SSC. Поэтому для более детальной характеристики клеточного полигона мы анализировали уровень экспрессии CD45 в сочетании с боковым светорассеянием (SSC/CD45). Оценка экспрессии данного антигена представляется важной потому, что общелейкоцитарный антиген CD45 (трансмембранный гликопротеин) присутствует на всех лейкоцитах вне зависимости от степени дифференцировки, однако уровень экспрессии может быть различным на нормальных и патологически измененных клетках.

В подавляющем большинстве проанализированных нами случаев ОЛ гистограмма SSC/CD45 (ось x отражает уровень экспрессии CD45, а ось y — гранулярность) позволяла более точно, по сравнению с возможностями гистограммы FSC/SSC, разделить низкогранулярные клетки на нормальные (нетрансформированные) лимфоциты и опухолевые (лейкемические) бласты, то есть выявить патологическую популяцию. На рис. 3 показано, что бластные клетки занимают по оси x (на гистограмме справа) место, которое пустует в образце здорового донора. То есть, бластные клетки, обладая одинаковой гранулярностью с нормальными лимфоцитами, имеют более низкий уровень экспрессии CD45.

image

Однако визуальная оценка интенсивности экспрессии CD45 не позволяет обеспечить абсолютную надежность гейтирования, так как можно отмечать случаи, когда часть или все лейкозные клет-

image

Рис. 2. Расположение бластной популяции при остром лейкозе

image

ки отрицательны по этому антигену или значения экспрессии CD45 приближаются к таковым на нор-

мальных лимфоцитах.

Мы проанализировали и такие характеристики антигена CD45, как плотность его распределения на мембране позитивных клеток по СИФ. Зна-

чение показателей интенсивности флюоресценции image

в настоящее время активно изучается с точки зре

ния возможности их потенциального использова-

ния для повышения точности диагностики лейкозов, для получения более глубокой информации о биологической сущности бластных клеток, что мо-

жет оказаться полезным для прогнозирования исхода заболевания. При учете результатов мы реги-

стрировали как процент клеток, экспрессирующих маркер CD45, так и СИФ. СИФ во всех пробах с отрицательным изотипическим контролем определялась в диапазоне от 2,9 до 4,5 усл. ед. как по оси FL1 (соответствующей МкАТ, меченным FITC), так и по оси FL2 (соответствующей МкАТ, меченным РЕ). Диапазон СИФ маркерa CD45 на бластных клетках колебался от 25 до 1400 усл. ед., что в 10–50 раз превышало интенсивность свечения изотипического контроля и исключало возможность ошибки.

image

image

В результате анализа 19 образцов ЛПК здоровых доноров мы установили, что интенсивность экспрессии CD45 на ЛПК в контрольной группе колебалась от 212 до 576,3 усл. ед. При фенотипировании 74 больных ОЛ (В-ОЛЛ, n = 54; Т-ОЛЛ, n = 14; ОМЛ, n = 6) на этапе диагностики выявлено, что зрелые лимфоциты отличались от бластов более яркой экспрессией CD45 во всех случаях. На одномерной гистограмме были хорошо различимы два пика CD45+-клеток (рис. 4). Пик с более высокой плотностью экспрессии соответствовал оставшимся нормальным клеткам и располагался правее по оси х. СИФ CD45 на остаточных нормальных лимфоцитах колебалась от 235,0 до 506,3 усл. ед., что было близко к таковым показателям ЛПК здоровых доноров.

Рис. 4. Одномерная гистограмма СИФ CD45+-клеток

Эффективность разделения лимфоцитов и бластов при ОЛЛ подтверждена на основании того, что на лимфоцитах отсутствовали маркеры клетокпредшественников (TdT, CD10 и CD34), которые были экспрессированы на бластах различных линий дифференцировки.

Интенсивность экспрессии CD45 на бластах в группе пациентов с ОЛ варьировала от 13,32 до 201,65 усл. ед. Таким образом, экспрессия панлейкоцитарного антигена CD45 на ЛПК здоровых доноров и остаточных нормальных лимфоцитах пациентов с ОЛ была значительнее интенсивной, чем на бластных клетках. На рис. 4 показана одномерная гистограмма СИФ CD45+-клеток (р ≤ 0,001) у пациентов с ОЛ. Правый пик соответствует оставшимся нормальным лимфоцитам, левый — популяции бластов. Цифровые значения полученных результатов отражены в таблице.

Таблица Сопоставление СИФ CD45 лимфоцитов и лейкемических бластов

Нозологические группы

СИФ CD45 (усл. ед.)

лимфоциты

бласты

Здоровые лица — доноры, n = 19

393,65 ± 11,0

В-ОЛЛ, n = 54

203,34 ± 11,2

142,7 ± 25,3*

Т-ОЛЛ, n = 14

197,8 ± 24,3

99,6 ± 27,7*

ОМЛ,n = 6

221,1 ± 2,7

113,6 ± 21,8*

*p < 0,001.

Рис. 3. Уровень экспрессии CD45 на бластных клетках и нормальных лимфоцитах (слева — здоровый донор, справа — пациент с ОЛ)

Различия СИФ CD45 лимфоцитов и бластов были достоверны во всех группах больных ОЛ, что подтверждает визуальную информацию раздельного расположения кластеров этих типов клеток на гистограммах, учитывающих экспрессию CD45.

Отличия СИФ CD45 лимфоцитов и бластов пациентов с различиными формами ОЛ представлены графически на рис. 5.

image

Рис. 5. СИФ CD45 на лимфоцитах и бластных клетках при различных формах ОЛ

Таким образом, при выполнении иммунофенотипической диагностики показатель СИФ общелейкоцитарного маркера CD45 помогает отличить сохранившиеся нормальные клетки от бластов и благодаря этому избежать ошибочных заключений при характеристике ОЛ. При анализе лейкозов с наличием бластных клеток с атипичной экспрессией антигенов СИФ CD45 можно рассматривать как дополнительный критерий дифференциальной диагностики цитологических вариантов ОЛ.

ВЫВОДЫ

По параметрам светорассеяния и экспрессии антигена CD45 бластные клетки четко характеризуются невысоким уровнем гранулярности и низким уровнем экспрессии CD45 (СИФ 118,6 ± 13,1) по сравнению с лимфоцитами (СИФ 393,65 ± 11,0). Гейтирование по CD45 позволяет достаточно точно идентифицировать лимфоциты при ОМЛ и цитологических вариантах ОЛЛ, что является удобным средством идентификации лейкемических клеток, обычно занимающих (на гистограмме SSC/CD45) то положение, где располагается малое количество сохранившихся нормальных клеток.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Перехрестенко ПМ, Назарчук ЛВ, Федоренко ЗП, Суханова ТГ. Стан захворюваності злоякісними новоутвореннями лімфатичної та кровотворної тканини населення України. Укр журн гематол трансфузіол 2003; (4): 5–10.

  2. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. Pathology and genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press, 2001. 352 p.

  3. Бутенко ЗА, Глузман ДФ, Зак КП и др. Цитохимия и электронная микроскопия клеток крови и кроветворных органов. Киев: Наук думка, 1974. 248 с.

  4. Бутенко ЗА. Стволовые кроветворные клетки и лейкоз. Киев: Наук думка, 1978. 179 с.

  5. Буглова СЕ, Белевцев МВ, Потапнев МП. Значение интенсивности флюоресценции маркеров дифференцировки в

    иммунофенотипической диагностике острых лейкозов у детей. Гематол трансфузиол 2002; 47 (1): 6–9.

  6. Тупицын НН. Иммунодиагностика гемобластозов. В кн: Клиническая онкогематология. Под ред МА Волковой. Москва: Медицина, 2001: 124–45.

  7. Зуева ЕЕ, Афанасьев ББ, Тотлян АА. Иммунофенотипическая характеристика острых лейкозов методом проточной цитометрии. Мед иммунол 2004; 6 (1–2): 9–24.

  8. Сейц ИФ, Луганова ИС. Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при лейкозе. Ленинград: Медицина, 1967. 331 с.

  9. Тупицын НН, Андреева ЛЮ, Кадагидзе ЗГ. Иммунодиагностика гемобластозов человека: пособие для врачей. Москва: РОНЦ, 2003. 42 с.

  10. Тупицын НН. Лимфоциты и иммунокомпетентная система. В кн: Руководство по гематологии. Под ред АИ Воробьева. Т 1. Москва: Медицина, 2002: 106–25.

  11. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proc 7th Intern Conf Ed by D Mason et al. Oxford: Univ Press, 2002. 945 p.

  12. Глузман ДФ, Скляренко ЛМ, Надгорная ВА, Крячок ИА. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. Киев: МОРИОН, 2003: 156 с.

  13. Глузман ДФ, Абраменко ИВ, Скляренко ЛМ и др. Диагностика лейкозов. Атлас и практическое руководство. Киев: МОРИОН, 2000. 224 с.

  14. Galigiuri MA, Strout MP, Gilliland DG. Molecular biology of acute myeloid leukemia. Semin Oncol 1997; 24 (1): 32–44.

  15. Bakels V, Van Oostveen JW, Geerts ML, et al. Diagnostic and prognostic significance of clonal T-cell receptor beta gene rearrangements in lymph nodes of patients with mycosis funqoides. J Pathol 1993; 170: 249–55.

  16. Delabesse E, Bernard M, Meyer V, et al. TAL1 expression does not occur in the majority of T-ALL blasts. Br J Haematol 1998; 102: 440.

  17. Bain B. Leukemia diagnosis. 2nd ed. Oxford etc: Blackwell Science, 1999. 200 p.

  18. Imamura N, Kriatchok IA, Klimenko VI. Expression and point mutation of p53 supressor oncogene in patients with myelodysplastic syndrome among atomic-bomb survivors and Chernobyl accident. Victims Exp Oncol 1996; 18 (2): 333–7.


Без комментариев » Добавить комментарий