ЕКСПРЕСІЯ P53, VEGF ТА CD34 У ПУХЛИННІЙ ТКАНИНІ ТА ВИЖИВАНІСТЬ ХВОРИХ НА СЕРОЗНИЙ РАК ЯЄЧНИКА

ВСТУП

Ангіогенез відіграє важливу роль у розвитку пух­ лини і є складним процесом, у регуляції якого бере участь низка біологічно активних речовин. Зокре­ ма, до стимуляторів судиноутворення у пухлинах належать різноманітні фактори росту з ангіоген­ ною активністю, які продукують як клітини пух­ лини і її мікрооточення, так і безпосередньо ендо­ теліальні клітини. Ключова роль серед активаторів ангіогенезу належить VEGF — потужному мітоген­ ному фактору ендотеліальних клітин, який стиму­ лює не тільки проліферацію, а й міграцію клітин ен­ дотелію і утворення трубчастих структур. Вважаєть­ ся, що саме цей фактор є специфічним медіатором, що забезпечує підвищену проникність судин у пух­ линах [1]. Об’єктивним показником, що характе­ ризує ангіогенез у пухлині, є щільність мікросудин (ЩМС), яка може бути визначена за експресією та­ ких маркерів як фактор Віллебранда, антигени CD31 та CD34 [2]. Слід зазначити, що CD34 не експресу­ ється ендотеліоцитами великих артерій та вен, що дає можливість його використання саме як марке­ ра новоутворених кровоносних судин [3].

Значне місце серед негативних регуляторів ангіо­

генезу займає білок р53, який окрім своїх безпосе­ редніх функцій пухлинного супресора та «охорон­ ця геному» відіграє важливу роль у регуляції нео­ ангіогенезу, оскільки активує експресію інгібіторів ангіогенезу. До останніх належать тромбоспонди­ ни­1, ­2, ангіостатин, ендостатин, вазостатин та інші, що запобігають росту кровоносних судин [4]. Поряд з цим білок р53 може опосередковано регулю­ вати експресію VEGF як через протоонкоген c-Src, так і при безпосередній взаємодії з транскрипцій­ ним фактором Sp1, перешкоджаючи таким чином активації промотора цього гена. Показано, що му­ таційні зміни гена ТР53 призводять до одночасного

підвищення експресії c-Src та мРНК VEGF у хворих на рак молочної залози, товстого кишечнику і рак яєчника (РЯ) [5].

Розглядаючи особливості неоангіогенезу пухлин яєчника, слід відзначити, що на сьогодні це питан­ ня ще недостатньо досліджене. Зокрема, показано певний зв’язок експресії р53 і маркерів ангіогене­ зу з прогнозом перебігу процесу при І стадії РЯ [6]. Відомостей щодо прогностичної ролі цих маркерів при більш пізніх стадіях захворювання в доступній літературі ми не знайшли. Крім того, не одностай­ ною є оцінка значення ЩМС для перебігу РЯ. Так, на думку одних дослідників, активація ангіогенезу у новоутвореннях яєчника супроводжується підви­ щеною здатністю пухлини до швидкого росту, інва­ зії та метастазування [7]. Інші автори, навпаки, вва­ жають фактором несприятливого прогнозу РЯ низь­ ку ЩМС у зв’язку з гіпоксією пухлини, яка виникає в цьому випадку і зумовлює надзвичайну агресив­ ність останньої [8].

Мета роботи полягала у зіставленні експресії р53 та VEGF, а також ЩМС у серозних новоутвореннях яєчника з клінічними характеристиками (вік, стадія захворювання) та тривалістю життя хворих.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження було виконано на операційному ма­ теріалі 46 хворих на РЯ віком 36–74 роки (середній вік становив 48,2 ± 7,3 року). Усі хворі були розподілені на дві вікові групи: група І – ≤ 45 років (репродуктив­ ний вік) — 20 (43,5%) пацієнток, група ІІ — > 45 ро­ ків — 26 (56,5%); у групу ІІ увійшли пацієнтки в пе­ рименопаузальний та менопаузальний період. При аналізі результатів враховували стадію захворювання за FIGO та виживаність хворих після операції. Ці дані отримували при вивченні історій хвороби та амбула­ торних карт пацієнток. Усі пацієнтки одержували лі­

кування в період з 1988 по 2007 р. у відділенні онкогі­ некології (керівник – докт. мед. наук, проф. Л.І. Во­ робйова) Інституту онкології АМН України (нині ДУ «Національний інститут раку»). Неоад’ювантну терапію у обстежених хворих не проводили.

Морфологічну верифікацію діагнозу здійснюва­ ли шляхом дослідження гістологічних препаратів, за­ барвлених гематоксиліном та еозином. Імуногістохі­ мічне виявлення р53 і маркерів ангіогенезу проводили на паралельних депарафінованих зрізах з використан­ ням відповідних МкАТ та системи візуалізації («Dako Cytomation», Данія): МкАТ до р53, клон DO­7; VEGF, клон VG1; CD34, клон QBEnd10. Для візуалізації за­ стосовували систему EnVision; забарвлення здійсню­ вали за допомогою хромогену­3­діамінобензидину тетрахлориду. Ядра клітин дофарбовували гематок­ силіном Майєра. У кожному випадку аналізували по 600–1000 пухлинних клітин. Результати імуногістохі­ мічної реакції по виявленню VEGF та p53 оцінювали напівкількісним методом шляхом визначення кіль­ кості позитивно забарвлених клітин — індекс мітки (ІМ, %). Для оцінки ЩМС у пухлинах яєчника під­ раховували кількість забарвлених судин в 10 полях зору (розмір одного поля зору обмежувався вимірю­ вальною квадратною сіткою зі стороною 0,79 мм) з наступним визначенням їх числа на площі 1 мм2 за формулою: ЩМС = n/0,625 мм2, де n — середня кількість судин на одне поле зору; 0,625 мм2 — пло­ ща одного поля зору.

Аналіз отриманих результатів проводили ме­ тодом описової статистики, порівняння вибірок (U­критерій Манна — Уїтні) — за допомогою про­ грами STATISTICA 6. Достовірними вважали від­ мінності при р < 0,05. Аналіз виживаності прово­ дили за допомогою методу Каплана — Майєра, до­ стовірність відмінностей між кривими виживаності визначали за Cox­тестом [9].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Імуногістохімічне дослідження експресії білків р53 та VEGF показало, що експресію р53 (винят­ ково ядерну) відзначали у 94% пухлин; VEGF вияв­ ляли лише у цитоплазмі у 67% новоутворень. CD34 експресували плазматичні мембрани ендотеліоци­ тів; CD34+­судини були виявлені в усіх дослідже­ них пухлинах.

Зіставлення досліджених показників у хворих з різною стадією РЯ виявило певні закономірнос­ ті (рис. 1).

Рис. 1. Експресія р53 і VEGF (а) та ЩМС (б) у пухлинах хворих з різними стадіями РЯ

Експресія р53 практично не залежала від стадії за­ хворювання (ІМ становив 35,2 ± 0,5% при І–ІІ ст. РЯ та 36,4 ± 0,5% — при ІІІ–IV ст.), тоді як експре­ сія VEGF була майже удвічі вищою у пухлинах хво­ рих з III–IV ст. порівняно з такою при І–II ст. РЯ (16,5 ± 0,3 проти 9,0 ± 0,8%, р < 0,05). Аналогічним чином, але менш виразно, змінювалася ЩМС: спо­ стерігали тенденцію до її підвищення у пухлинах хворих з ІІІ–IV ст. РЯ (72,5 ± 3,8 проти 64,7 ± 3,5 су­ дин/мм2 при РЯ І–ІІ ст., р > 0,05) (див. рис. 1).

При аналізі маркерів васкуляризації залежно від збереження менструальної функції пацієнток (не­ залежно від віку) встановлено, що у жінок у мено­ паузальний період ЩМС (58,1 ± 3,1 судин/мм2) та експресія VEGF (7,0 ± 0,4%) були вірогідно ниж­ чими (р < 0,05), ніж у пацієнток зі збереженою менструальною функцією (відповідно 76,4 ± 5,2 су­ дин/мм2 та 17,0 ± 0,2%). Виявлена розбіжність може бути пов’язана з підвищеним рівнем у жінок ре­ продуктивного віку стероїдних гормонів (зокрема естрогенів), які згідно з даними літератури акти­ вують експресію гена VEGF [11, 12]. У той же час у хворих у менопаузальний період виявлено біль­ шу експресію р53 (38,2 ± 0,6 проти 34,3 ± 0,5%,

р < 0,05) (рис. 2 ).

Рис. 2. Експресія р53 та VEGF у хворих на РЯ залежно від стану менструальної функції

При зіставленні тривалості життя хворих піс­ ля операції з експресією досліджених маркерів та ЩМС встановлено, що у хворих, які прожили 5 і менше років, експресія р53 і VEGF, а також ЩМС були вірогідно вищими порівняно з такими у хво­ рих, які прожили більше 5 років (табл. 1).

Таблиця 1 Експресія р53, VEGF та ЩМС у пухлинах хворих з різною

тривалістю життя

*р < 0,05.

Отримані дані співпадають з результатами ін­ ших дослідників, згідно з якими при низькій ЩМС у епітеліальних злоякісних пухлинах яєчника 5­річ­ на виживаність пацієнток збільшується незалежно від стадії захворювання [10].

Ми провели також порівняльний аналіз дослі­ джених показників, враховуючи одночасно вік па­ цієнток та термін їх життя після операції (табл. 2).

Таблиця 2 Експресія р53,VEGF та ЩМС у пухлинах хворих на РЯ залежно

від віку та термінів виживаності пацієнтів

*р < 0,05 у межах однієї вікової групи залежно від тривалості життя;

**р < 0,05 у межах однієї градації тривалості життя залежно від віку пацієнток.

Такому аналізу передувало визначення вижива­ ності хворих залежно від віку. Було встановлено, що 5­річна виживаність пацієнток, які захворіли у віці старше 45 років (група ІІ) складала 47%, у той час як у хворих репродуктивного віку (група І) лише 18% (р = 0,02) (рис. 3).

Рис. 3. Криві виживаності хворих на РЯ залежно від віку пацієнток

При цьому в групі ІІ експресія VEGF та ЩМС становила в середньому 13,9 ± 0,5% та 62,6 ± 3,9 су­ дин/мм2, а у групі І відповідно 18,4 ± 0,4% (p < 0,05) та 64,4 ± 4,1 судин/мм2 (p > 0,05).

Як видно з табл. 2, у пухлинах хворих репродуктив­ ного віку (≤ 45 років), які прожили після операції біль­ ше 5 років, експресіяр53 буладостовірнонижчою, ніж у хворих, тривалість життя яких не перевищувала 5 ро­ ків (29,2 ± 0,5 проти 37,1 ± 0,6%, p < 0,05). У хворих віком старше 45 років відзначали аналогічну законо­ мірність: експресія р53 була нижчою у пацієнток, що прожили більше 5 років (35,3 ± 0,5 проти 41,0 ± 0,6%, p < 0,05 відповідно). У той же час аналіз у межах однієї градації тривалості життя показав, що як у групі паці­ єнток, які прожили більше 5 років, так і у групі з три­ валістю життя 5 і менше років експресія р53 була до­ стовірно нижчою у хворих віком до 45 років порівняно з такою у пацієнток старше 45 років. Експресія VEGF незалежно від вікової групи (до 45 або старше 45 ро­ ків) була достовірно нижчою у хворих, термін життя яких не перевищив 5 років: в 1,9 раза при обох варіан­ тах порівняння. При аналізі залежності цього показ­ ника від віку пацієнток у межах однієї градації трива­ лості життя виявилося, що в обох випадках експресія VEGF у пухлинах хворих віком старше 45 років була достовірно нижчою за таку у хворих віком до 45 років (при тривалості життя більше 5 років — 6,5 ± 0,2 проти

12,3 ± 0,4% (p < 0,05), 5 років і менше — 12,3 ± 0,4 про­ ти 23,2 ± 0,7% (p < 0,05) відповідно). ЩМС у пухлинах хворих віком до 45 років, які прожили 5 років і менше, буладостовірновищою, ніжухвориханалогічноговіку, тривалість життя яких перевищила 5 років; у хворих ві­ ком старше 45 років достовірна різниця ЩМС залеж­ но від тривалості життя була відсутня. Не виявлено та­ кож вірогідної різниці показників ЩМС у пацієнток різних вікових груп у межах однієї градації тривалості життя. За сукупністю результатів, наведених в табл. 2, можливо підсумувати, що: 1 — за умови більш висо­ кого рівня експресії досліджених маркерів тривалість життя пацієнток була меншою; 2 — незалежно від три­ валості життя експресія VEGF і показник ЩМС були вищими у пацієнток віком до 45 років, експресія р53, навпаки, у пацієнток віком старше 45 років.

Аналіз індивідуальних даних про тривалість життя пацієнток дозволив визначити медіану ЩМС, що має прогностичне значення та може бути точкою розподі­ лу хворих на прогностичні групи. Медіана (при града­ ції виживаності — більше 5 років або 5 років і менше) дорівнювала 59,0 судин/мм2. У групі хворих, у пухли­ нах яких ЩМС була меншою за медіану, кумулятивна 5­річна виживаність склала 63,0% і була вірогідно біль­ шою порівняно з такою 51,0% (р < 0,05) у групі пацієн­ ток, у яких ЩМС була вище медіани (рис. 4).

Рис. 4. Криві виживаності хворих на РЯ за Капланом — Майєром (розподіл хворих відповідно медіани ЩМС у пухлинах)

Як можливі механізми підвищення ЩМС у пух­ линах хворих доцільно згадати, перш за все, поси­ лену продукцією VEGF, що може бути пов’язана як з гіпоксією новоутворення, так і з підвищенням вмісту макрофагів у пухлинному мікрооточенні [13]; поряд з цим мутаційні зміни гена­супересора ТР53 призводять до порушення його інгібуючої дії на VEGF [14, 15].

ВИСНОВКИ

1. Виявилено залежність експресії р53, VEGF та ЩМС у РЯ від віку хворих та стадії захворювання.

2. Встановлено, що у хворих, термін життя яких менше 5 років після операції, ЩМС у пухлинах і екс­ пресія р53 та VEGF були достовірно вищими порів­

   няно з такими у пухлинах хворих, що були живі піс­ ля операції більше 5 років.

3. Показано, що у хворих віком до 45 років екс­ пресія VEGF та ЩМС вірогідно перевищують такі у пацієнток у менопаузальний період; тенденцію до підвищення експресії р53 виявлено у хворих у ме­ нопаузальний період.

4. Загальна безрецидивна виживаність хворих ві­ ком старше 45 років була вірогідно вищою, що є під­ ґрунтям для визначення віку хворих як незалежно­ го фактора прогнозу РЯ.

5. Комплекс показників, що відображають інтен­ сивність васкуляризації — ЩМС, експресія VEGF та р53 є перспективними для оцінки перебігу сероз­ ного РЯ і можуть бути використані в якості прогнос­ тичних маркерів пухлинного процесу.

ЛІТЕРАТУРА

1. Канцерогенез / Под ред ДГ Заридзе / Москва: Меди­ цина, 2004. 576 с.

2. Pal S, Datta Mukhopadhyay KD. Central Role of p53 on Regulation of Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor (VPF/VEGF) Expression in Mammary Carcinoma. Cancer Res 2001; 61: 6952–7.

3. Mukhopadhyay D, Tsiokas L, Sukhatme VP. Wild­type p53 and v­Src exert opposing influences on human vascular endothelial growth factor gene expression. Cancer Res 1995; 55: 6161–5.

4. Michael J, Goodheart M, Rose L, et al. The Relationship of Molecular Markers of p53 Function and Angiogenesis to Prognosis of Stage I Epithelial Ovarian cancer. Clin Cancer Res 2005; 11 (10): 3733–42.

5. Kohn EC. Аngiogenesis in Ovarian carcinoma. Cancer 1997;

   80 (12): 1452–63.

6. Petzelbauer P, Halama T, Groger M. Endothelial adherens junctions. J Invest Dermatol Symp Proc 2000; 5: 13–21.

1. Сметник ВП. Системные изменения у женщин в кли­ мактерии. Рус мед журн 2001; 9 (9): 354–8.

2. Крючков АН, Фрейд ГГ. Неоангиогенез и плотность сети микрососудов в раке молочной железы. Арх патологии 2008; 70 (1): 62–5.

3. Ravi R, Mookerjee B, Bhujwalla ZM, et al. Regulation of tumor angiogenesis by p53­induced degradation of hypoxia­ inducible factor 1 alfa. Genes Dev 2000; 14: 34–44.

4. Черноглазова ЕВ, Дбар ЖН, Степанова ЕВ. Молеку­ лярные механизмы опухолевого неоангиогенеза. Успехи со­ врем биол 2004; 124 (5): 480–8.

1. Brown MR, Blanchette JO, Kohn EC. Angiogenesis in

   ovarian cancer. Clin Cancer Res 2000; 14 (6): 901–18.

2. Bamberger ES, Perrett CW. Angiogenesis in epithelial ovarian cancer. J Clin Pathol 2002; 55: 348–59.

3. Kaplan EL, Meier PN. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assos 1958; 53: 457–81.

4. Chan JK, Loizzi V, Lin F, et al. Stages III and IV invasive epithelial ovarian carcinoma in younger versus older women: what prognostic factors are important? Obst Gynecol 2003; 102: 156–61.

5. Boussat S, Eddahibi S, Coste A, et al. Expression and regulation of vascular endothelial growth factor in human pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000; 279 (2): 371–8.