РІВЕНЬ ЛАКТАТУ ТА 1Н ЯМР МЕТАБОЛІЧНЕ СПІВВІДНОШЕННЯ ЛАКТАТ/КРЕАТИН У ТКАНИНІ РАКУ ШЛУНКА ЛЮДИНИ І ПРОГНОЗ ПЕРЕБІГУ ЗАХВОРЮВАННЯ

Болдескул І.Є., Бубновська Л.М., Ковельська А.В., Меренцев С.П.

Проведений порівняльний аналіз методів визначення рівня лактату в тканині РШ і оточуючій пухлину слизовій оболонці ферментативним методом та за допомогою 1Н ЯМР-спектроскопії перхлорних екстрактів тканини з метою встановлення можливості використання 1НЯМР-співвідношення Lac/Cr у якості достовірного показника рівня лактату в тканині. Отримані дані довели, що рівень лактату в тканині може бути достовірно оцінений метаболічним співвідношенням Lac/Cr, який доцільно використовувати при проведенні 1Н ЯМР-спектроскопії перхлорних екстрактів операційного матеріалу хворих на РШ та 1НЯМР-спектроскопіїinvivо(ЯМР-зображення) при первинній діагностиці РШ у якості маркеру прогнозу перебігу захворювання та індивідуалізації протипухлинної терапії.


Посилений аеробний гліколіз у пухлинній тка­ нині являє собою унікальне явище, відоме ще з ран­ ніх робіт O. Warburg [1]. При високому рівні гліколі­ зу природно очікувати утворення у пухлині великої кількості лактату, який буде затримуватись у її тка­ нині або виходити у кровоносне русло. Підвищення рівня лактатемії у онкологічних хворих та експери­ ментальних тварин з різними пухлинами вказує на вихід лактату з пухлини у кров [2, 3]. Водночас відо­ мо, що судинний простір пухлини у 3 рази менший, ніж, наприклад, печінки, і в різних пухлинах швид­ кість кровообігу знижена у багато разів порівняно з нормальними тканинами [4]. Завдяки цьому вміст лактату у пухлині буде істотно зростати, що вперше було описано в експериментах С. Cori і G. Cori [5] та M. Reiss і A. Hochwald [6].

У роботах останніх років було показано, що в первинних пухлинах шийки матки [7], голови та шиї [8], колоректальних карциномах [9] різко зрос­ тає вміст лактату. Було встановлено, що у високо­ агресивних пухлинах лактат накопичується швидше порівняно з менш злоякісними пухлинами, причо­ му вже на ранніх стадіях розвитку процесу. Збіль­ шене накопичення лактату, що зумовлює позаклі­ тинне зниження рН, може зменшувати адгезивні властивості пухлинних клітин у межах злоякісної тканини і таким чином посилювати їх розповсю­ дження у віддалені органи. Показано, що високий вміст лактату корелює з вищою частотою утворен­ ня як віддалених метастазів, так і невисокими по­ казниками виживаності хворих уже на ранніх ста­ діях розвитку пухлинного процесу [10]. Висловлено припущення, що вміст лактату у первинній пухлині може бути основою нової метаболічної класифіка­ ції пухлин, яка буде сприяти підвищенню ефектив­ ності лікування онкологічних хворих [11].

На шляху до реалізації цієї ідеї необхідним є роз­ ширення спектра пухлин людини, які були б дослі­ джені з позиції встановлення клінічного значення вмісту лактату у пухлині та його зв’язку з перебігом захворювання. Слід також зауважити, що визначен­ ня вмісту лактату у пухлині не тільки біохімічним методом, але і за допомогою ЯМР­спектроскопії, яка дозволяє визначати різні важливі для життєді­ яльності пухлинних клітин метаболіти, зокрема во­ деньвмісні, розширює можливості та підсилює клі­ нічну значущість такого дослідження.

У цій роботі була зроблена спроба здійснити по­ рівняльний аналіз методів визначення вмісту лак­ тату у пухлині біохімічним методом і за допомогою 1Н ЯМР­спектроскопії та оцінити його можливе ви­ користання у якості прогностичного маркеру.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Операційний матеріал (пухлинна тканина та ото­ чуюча її нормальна слизова оболонка шлунка) був отриманий від 104 хворих, які підлягали хірургічному втручанню, з діагнозом первинний рак шлунка (РШ). Передопераційної терапії хворі, операційний матеріал яких було використано для досліджень, не отримува­ ли. Матеріал був наданий Київською міською онко­ логічною лікарнею. Усі хворі були проінформовані про обстеження та надали згоду на використання хі­ рургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Kлінічні характеристики наведені у таблиці. Пухлинну та нор­ мальну (за межами обов’язкового оперативного вида­ лення) тканиниотримувалив процесіїхоперативного вилучення і миттєво занурювали в рідкий азот. Оцін­ ку вмісту лактату проводили за допомогою біохіміч­ ного методу та 1Н ЯМР­спектроскопії в перхлорних екстрактах (ПХЕ) тканин (тканина РШ, нормальна слизова оболонка шлунка).

Показник

Кількість хворих, %

Вік (роки; середнє, розподіл)

61,8 (32–80)

Чол.

61 (58,6)

Жін.

43 (41,4)

Категорія рТ

T1

2 (1,9)

T2

17 (16,4)

T3

57 (54,8)

T4

28 (26,9)

Категорія рN

N0

40 (38,5)

N1

38 (36,5)

N2

26 (25,0)

Стадія TNM

I

14 (13,5)

II

23 (22,2)

III

38 (36,5)

IV

29 (27,8)

Гістологічна структура

Аденокарцинома

81 (77,9)

Слизовий рак

5 (4,8)

Персневидно-клітинний рак

6 (5,8)

Недиференційований рак

12 (11,5)

Ступінь диференціювання

G1

0

G2

18 (17,3)

G3

60 (57,7)

G4

26 (25,0)

Локалізація пухлини

Верхня третина шлунка

24 (23,1)

Середня третина

24 (23,1)

Нижня третина

52 (50,0)

Тотальне ураження

3 (2,9)

Віддалені метастази

Відсутні (М0)

92 (88,5)

Присутні М1)

12 (11,5)

Усього

104 (100,0)

Розподіл хворих на РШ

Таблиця

ного користування НАН України на базі Інституту металофізики НАН України.

Вміст лактату (µмоль/г) в тканині РШ та оточую­ чій пухлину «нормальній» слизовій оболонці визна­ чали ферментативним методом за H. Hohorst [12] з використанням лактатдегідрогенази.

Проводили відповідну статистичну обробку отриманих результатів: кореляційний аналіз про­ водили з використанням коефіцієнтів кореляції Pearson (r) та Spearman (rho). Прогностичне зна­ чення показників оцінювали за допомогою про­ порційної моделі Cox з використанням χ2 тесту та коефіцієнту ризику (hazard ratio). Виживаність хво­ рих визначали за методом Kaplan — Meier, розбіж­ ності між кривими виживаності аналізували за до­ помогою тесту log­rank. Статистична значимість прийнята при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При первинному діагнозі хворого на РШ ви­ значити рівень того чи іншого метаболіту в пухли­ ні, який може бути маркером перебігу захворюван­ ня, без отримання принаймні біопсійного матері­ алу неможливо. Новітні методи діагностики, такі як ЯМР­спектроскопія in vivo (NMR imaging — ЯМР­зображення), дозволяють це зробити. Для того, щоб пересвідчитися, чи може 1Н ЯМР­метаболічний показник відображати вміст лактату в пухлині і бути

Для отримання ПХЕ тканину розтирали в рід­ кому азоті до порошковидного стану, давали тро­ хи відтанути та інкубували на льоду при постійно­ му помішуванні. Подалі проводили екстракцію за допомогою охолодженого 1,2 н розчину HClO4. Хо­ лодну деіонізовану воду додавали в певному обся­ зі та центрифугували (9000 об./хв, 40 хв) для вида­

лення клітинного дебрісу. Потім рН ПХЕ доводили

до 7,6–8,0 за допомогою 5 н розчину КОН, центри­ фугували (9000 об./хв, 20 хв) для видалення преци­ пітату КСІО4. Дівалентні іони видаляли за допомо­ гою Chelex (10 мг/5 мл надосадової рідини) (Sigma, США). Зразки фільтрували, ліофілізували та збері­ гали при –20 °С. Перед реєстрацією ЯМР­спектрів ліофілізовані зразки розчиняли в 1,0 мл D2O, цент­ рифугували і переносили в ЯМР­пробірки для по­ дальшого ЯМР­аналізу.

1Н ЯМР­спектри реєстрували на спектромет­

рі Bruker 400 MHz (Widebore Ultrashield, AV­400 electronics, Німеччина), використовуючи 5 мм кю­ вети. 1Н ЯМР­спектри ПХЕ тканин вимірювали при 400,13 MHz зі спектральною шириною в 8250 Hz та 90° шириною імпульсу, затримкою в 20 с. Натрієва сіль 3­(триметилсіліл)пропіонової кислоти (0,75%

розчин у D2О) слугувала за внутрішній стандарт (0,0 ppm). За таких умов резонансні сигнали лакта­ ту (Lac) та креатину (Cr) на 1Н ЯМР­спектрах реє­ струються на 1,3 ррm та 3,06 ppm відповідно. Облас­ ті спектральних сигналів на спектрах вимірювали­ ся інтегральним способом, які обчислював прилад. 1Н ЯМР­спектри були отримані в Центрі колектив­

надійним в оцінці того, які пухлини слід розглядати як пухлини з високим рівнем лактату, а які ні, була

проведена 1Н ЯМР­спектроскопія ПХЕ тканин РШ і слизової оболонки шлунка. Метод є дуже чутли­ вим і надає повний хімічний склад речовин на мо­ мент фіксації тканини. На рис. 1 представлені ти­ пові 1Н ЯМР­спектри тканин РШ і оточуючої сли­ зової оболонки.

image

Рис. 1. Типовий 1Н ЯМР­спектр тканини РШ (а) та оточуючої її слизової оболонки (б). На рисун­ ку представлені копії спектрів з оригінального запису спектрів хворого З.А.А.

Щоб мати можливість проаналізувати рівні пев­ них речовин в однотипових зразках на усіх спектрах та співставити поміж собою, в ЯМР­спектроскопії біологічних об’єктів користуються так званими ме­ таболічними співвідношеннями, а саме співвідно­ шеннями інтегралів резонансних сигналів речовин, що відображають взаємозв’язок цих речовин у зразку

тканини. Оскільки нас цікавив рівень лактату в тка­ нині, було використано 1Н ЯМР­співвідношення Lac/Cr. Креатин, як відомо, належить до енерге­ тичної складової метаболізму клітини, яка в будь­ яких умовах намагається підтримувати пул креати­ ну на відносно постійному рівні. Тому метаболічне співвідношення Lac/Cr є більш стабільним показ­ ником, який співвідноситься із загальним метабо­ лічним станом клітини. Нами було проведено спів­ ставлення 1Н ЯМР­спектрів метаболічних співвід­ ношень Lac/Cr для тканини РШ і слизової оболонки з вмістом лактату в тих самих тканинних зразках, що визначався ферментативним методом.

image

image

image

image

Так як у клінічних дослідженнях користуються медіаною як відправною точкою для розподілу хво­ рих за групами, була знайдена медіана рівня лакта­ ту, визначеного кожним окремим методом. Медіана метаболічного співвідношення Lac/Cr для тканини РШ дорівнювала 4,6 (1,4–32,5), тоді як для слизової оболонки, розміщеної на певній відстані від пухли­ ни, — 1,5 (0,6–4,4) (рис. 2а). Медіана вмісту лактату, визначеного ферментативним методом, для тканин РШ дорівнювала 18,7 µмоль/г (8,3–49,9), для слизо­ вої оболонки — 9,5 µмоль/г (3,3–22,1) (рис. 2б).

но медіани усі пухлини умовно поділяються на такі, що мають низький рівень лактату (< 4,6 для співвід­ ношення Lac/Cr або < 18,7 µмоль/г при визначенні ферментативним методом) або високий, — більше значення медіани. Як видно з розкиду, рівень лак­ тату в тканині РШ дуже варіює: вміст лактату в пух­ лині може бути як відносно низьким, так і виключ­ но високим. У середньому рівень лактату в пухлин­ ній тканині згідно зі значеннями метаболічного співвідношення Lac/Cr приблизно в 3 рази вищий (р = 0,039), а згідно з визначеним ферментативним методом у 2 рази вищий (р = 0,027) порівняно з та­ ким у нормальній слизовій оболонці шлунка.

image

image

image

image

Проведений порівняльний аналіз як значень ме­ таболічного показника Lac/Cr, так і вмісту лакта­ ту, визначеного ферментативним методом, з основ­ ними клініко­патологічними характеристиками РШ. Не було виявлено кореляції ні співвідношен­ ня Lac/Cr, ні вмісту лактату з гістологічним ти­ пом чи ступенем диференціювання пухлини, але спостерігалася статистично достовірна кореля­ ція співвідношення Lac/Cr (р = 0,0413) зі стадією розвитку процесу (рис. 3а). Аналогічна кореляція (р = 0,029) була встановлена і для вмісту лактату у тканині РШ, визначеного ферментативним ме­ тодом (рис. 3б).

image

image image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

image

Рис. 2. Розподіл індивідуальних значень та величин медіани: а — 1Н ЯМР­співвідношень Lac/Cr в тканині РШ та оточуючій її слизовій оболонці; б — вмісту лакта­ ту, визначеного ферментативним методом, у тканині РШ та оточуючій її слизовій оболонці

За обох методів визначення спостерігали досто­ вірну різницю між значеннями медіан для пухли­ ни і слизової оболонки шлунка (р < 0,001). Віднос­

image

Рис. 3. Рівень лактату в тканині РШ відповідно до стадій процесу за TNM: а — згідно з 1Н ЯМР метаболічним по­ казником Lac/Cr; б — при визначенні ферментативним методом

Слід також відзначити, що співвідношення Lac/Cr у пухлинах хворих з категорією рТ3 + рТ4 було дещо більшим (в 1,4 раза, р = 0,785) порівняно

image

image

image

image

image

image

з таким у хворих з категорією рТ1 + рТ2. (рис. 4а). Така ж тенденція була виявлена і при аналізі даних вмісту лактату, визначеного ферментативним мето­ дом (в 1,5 раза, р = 0,0652) (рис. 4б).

image

image

image

image

image

image

Рис. 4. Рівень лактату в тканині РШ відповідно до стадій процесу за TNM: а — згідно з 1Н ЯМР метаболічним по­ казником Lac/Cr; б — при визначенні ферментативним методом

Слід при цьому зазначити, що у хворих на РШ з категорію рТ4 не спостерігали суттєвого збільшен­ ня вмісту лактату у пухлині порівняно з такими при рТ3: 20,3 ± 1,0 µмоль/г при рТ3 і 22,9 ± 1,5 µмоль/г при рТ4. Пояснити це спостереження, яке співпа­ дає з літературними даними, може та обставина, що у великих пухлинах зони некрозу значно біль­ ші; лактат же, як відомо, продукується життєздат­ ними клітинами, які знаходяться у добре перфузо­ ваних ділянках пухлини [13]. Виходячи з цього, стає зрозумілим, чому вміст лактату в первинній пухли­ ні корелює зі злоякісною прогресією тільки на ран­ ніх стадіях процесу [10, 11].

При аналізі зв’язку вмісту лактату в тканині РШ з виживаністю хворих, яким було запроваджено тіль­ ки хірургічне втручання, виявилося, що при низь­ кому рівні лактату в пухлині (менше медіани), спо­ стерігається достовірно довша тривалість життя, ніж за умов, коли рівень лактату в пухлині був високим (вище медіани). Це положення дійсне у випадках, коли рівень лактату оцінювали як метаболічним співвідношенням Lac/Cr (χ2 = 3,876, р = 0,049), так і ферментативним методом (χ2 = 9,086, р = 0,026) (рис. 5а, б).

image

image

image

image

Рис. 5. Криві виживаності хворих на РШ за Капланом — Майєром (розподіл хворих: а — відповідно до медіани 1Н ЯМР метаболічного показника Lac/Cr у пухлині; б — відповідно до медіани вмісту лактату в пухлині, визначе­ ного ферментативним методом)

Несприятливий перебіг захворювання пацієнтів з пухлинами з високим вмістом лактату може бути пов’язаний з високим рівнем внутрішньопухлинної гіпоксії, яка, як відомо, є однією з основних харак­ терних особливостей злоякісної пухлини [14]. Аналіз отриманих даних показав, що спостерігається статис­ тично достовірний зворотний кореляційний зв’язок (р = 0,0487) між рівнями гіпоксії і лактату у ткани­ ні РШ за умов, коли пухлинна тканина є умовно гі­ поксичною. Водночас рівень лактату у пухлині може надати ще й додаткову інформацію щодо перебі­ гу захворювання. Зважаючи на той факт, що ткани­ на РШ відносно добре оксигенована (за оцінкою 31Р ЯМР­спектроскопії [15]), коли за таких умов, тобто за сприятливих для перебігу захворювання, спосте­ рігається високий вміст лактату (вище медіани), ри­ зик несприятливого перебігу захворювання зростає майже вдвічі (коефіцієнт ризику (hazard ratio) для співвідношення Lac/Cr і для вмісту лактату, визна­ ченого ферментативним методом, дорівнював 1,76; р = 0,0446 і 2,0; р = 0,0398, відповідно).

Таким чином, отримані дані вказують на те, що співвідношення Lac/Cr є достовірним показни­ ком рівня лактату в тканині РШ, який може слугу­ вати фактором прогнозу перебігу захворювання та виживаності хворих. Слід зазначити, що це може бути особливо важливим при первинному діагно­ зі РШ за допомогою 1Н ЯМР­спектроскопії in vivo (ЯМР­зображення).

ВИСНОВКИ

  1. Метаболічне співвідношення Lac/Cr є досто­ вірним показником рівня лактату в тканині РШ, що підтверджено даними, отриманими при визначенні вмісту лактату ферментативним методом.

  2. Метаболічне співвідношення Lac/Cr може слу­ гувати маркером прогнозу несприятливого перебі­ гу захворювання.

  3. 1Н ЯМР­спектроскопія перхлорних екстрак­ тів пухлинної тканини, отриманої під час оператив­ ного втручання, та 1Н ЯМР­спектроскопія in vivo (ЯМР­зображення) хворих на РШ може бути запро­ ваджена при первинній діагностиці та з метою про­ гнозування перебігу захворювання та індивідуаліза­ ції протипухлинної терапії.

ЛІТЕРАТУРА

  1. Warburg O. The metabolism of tumors. London: Constable, 1930.

  2. Jurga L, Klvana M, Matula P, et al. Importance of determinations of serum hexokinase, aldolase and lactate dehydrogenase activities and of the lactate/pyruvate quotient in the diagnosis of malignant tumors. Neoplasma 1978; 25: 95–106.

  3. Осинский СП, Повжиткова МС. Новые данные о селек­ тивности закисления опухолевой ткани. Онкология вып 9. Киев: Наук думка, 1977: 38–40.

  4. Gullino PM, Grantham FH. The vascular space of growing tumors. Cancer Res 1964; 24: 1727–32.

  5. Cori CF, Cori GF. The carbohydrate metabolism of tumors. J Biol Chem 1925; 64: 11–22.

  6. Reiss M, Hochwald A. Experimentelle Beeinflussung des Tumorstoffwechsels am lebenden Tier. Med Klin 1932; 28: 1391–5.

  7. Walenta S, Wetterling M, Lehrke M, et al. High lactate levels predict likelihood of metastases, tumor recurrence, and

  1. Hohorst Н. L­(+) lactate determination with lactic dehydrogenase and DPN. In: Methods of Enzymatic Analysis / Ed. H Bergmeyer / Acad Press, 1965: 266–70.

  2. Carcia-Martin M-L, Herigault G, Remy C, et al. Mapping extracellular pH in rat brain gliomas in vivo by 1H Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging: comparison with maps of metabolites. Cancer Res 2001; 61: 6524–31.

  3. Осинский СП, Глузман ДФ, Клифф Й и др. Молекуляр­ ная диагностика опухолей. Киев, 2007. 246 с.

  4. Осинський СП, Бубновська ЛМ, Ковельська АВ та ін. Рівень гіпоксії у тканині раку шлунка та перебіг захворюван­ ня. Онкология 2009; 11 (1 (39)): 39–44.

restricted patient survival in human cervical cancers. Cancer Res

2000; 60: 916–21.

  1. Brizel DM, Schroeder T, Scher RL, et al. Elevatedtumorlactate concentrations predict for an increased risk of metastases in head­and­ neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001; 51: 349–53.

  2. Walenta S, Chau TV, Schroeder T, et al. Metabolic classification of human rectal adenocarcinomas: A novel guideline for clinical oncologists? J Cancer Res Clin Oncol 2003; 129: 321–6.

  3. Walenta S, Mueller-Klieser WF. Lactate: mirror and motor of tumor malignancy. Semin Rad Oncol 2004; 14: 267–74.

  4. Walenta S, Schroeder T, Mueller-Klieser WF. Lactate in solid malignant tumors: potential of metabolic classifition in clinical oncology. Curr Med Chem 2004; 11: 2195–204.


Без комментариев » Добавить комментарий