Експресія гіпоксія-індукованого Фактора-1α та р53 у тканині раку шлунка людини та її клінічна значущість

У тканині раку шлунка (РШ) людини проведено імуногістохімічне визначення наявності експресії гіпоксія-індукованого фактора-1α (ГІФ-1α) та білка р53. Проаналізовано взаємозв’язки експресії досліджуваних білків з деякими клініко-патологічними характеристиками хворих та перебігом захворювання. Для ГІФ-1α(+)/р53(+)-пухлин характерним є нижчий ступінь диференціювання, вищий ступінь інфільтрації (категорія рТ) та наявність метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах порівняно з ГІФ-1α(–)/р53(–). Накопичення білка р53 зворотно корелює з виживаністю хворих на РШ. Одночасна експресія ГІФ-1α і р53 у пухлинах є фактором несприятливого прогнозу перебігу захворювання. Проте виживаність хворих з дуже високою експресією ГІФ-1α (> 45% позитивних клітин) була кращою, порівняно з іншими ГІФ-1α позитивними групами.


ВСТУП

За питомою вагою серед основних нозологічних форм злоякісних новоутворень рак шлунка (РШ) займає друге місце в світі. Незважаючи на комбіновані підходи у лікуванні хворих на РШ, 5-річна виживаність становить лише 10–30% [1]. Україна належить до країн з високою захворюваністю на РШ [2].

Важливою характеристикою, що впливає на злоякісність та перебіг пухлинного процесу, є здатність пухлинних клітин до індукції чи супресії апоптозу. На сьогодні залишається предметом дискусії питання щодо прота антиапоптичного впливу гіпоксії пухлин. При рості пухлини виникають ділянки дефектної мікроциркуляції, які позбавлені достатньої концентрації кисню, глюкози та інших поживних речовин. Такий дефіцит призводить до індукції апоптозу, який певною мірою зрівноважує проліферацію та обмежує ріст пухлини. Гіпоксія індукує експресію білка р53 і відповідно апоптоз іншим шляхом, ніж ДНК-пошкоджувальні агенти [3]. Хоча всі функції р53 на сьогодні остаточно не з’ясовані, ві- домо, що він може діяти як транскрипційний фактор для одних генів і як супресор для інших. Показана його роль у регуляції клітинної проліферації і в неоангіогенезі пухлини [4].

Гіпоксія-індукований фактор-1α (ГІФ-1α) є головним регулятором адаптації пухлинних клітин до гіпоксичного стресу через індукцію ангіогенезу, еритропоезу, гліколізу, підтримку виживання клітини, інгібування апоптозу [5, 6].

Привертає увагу білок-білкова взаємодія ГІФ-1α та p53, яка призводить до стабілізації р53 та зниження рівня ГІФ-1α у результаті його убіквітинізації, опосередкованої MDM2 [4, 7]. Така стабілізація є певним внеском в апоптоз, опосередкований гіпоксією, який може в свою чергу призводити до селекції клонів клітин з втратою функції білка р53. Клональ-

на селекція пухлинних клітин, які здатні виживати за умов гіпоксичного мікрооточення, супроводжується зменшенням їх здатності до індукції апоптозу внаслідок мутацій р53 [4, 6, 7].

Мутації в консервативних кодонах p53 виявляють приблизно в половині різноманітних типів пухлин людини, зокрема раку товстої кишки, легені, стравоходу, шлунка, молочної залози, печінки, новоутвореннях головного мозку, пухлинах ретикулоендотеліальної та кровотворної тканини. Більше 90% виявлених мутацій стосуються структури центрального домена білка, який забезпечує його взаємодію зі специфічною послідовністю ДНК, а також відповідає за білок-білкові взаємодії [8]. Таким чином, у мутантного білка р53 не тільки втрачається транскрипційна активність, але й може зменшуватись здатність білок-білкової взаємодії з ГІФ-1α.

Наявність мутантного р53 у пухлинних клітинах позитивно корелює з прогресією і метастазуванням. Слід зазначити, що накопичення мутантного р53 зумовлює проангіогенні процеси, оскільки р53 дикого типу задіяний у стимулюванні деяких інгібіторів ангіогенезу та негативній регуляції експресії VEGF [4]. У свою чергу з накопиченням мутантного білка p53 пов’язана гіперекспресія ГІФ-1α [7], що призводить до підвищеної експресії VEGF та подальшого розвитку неоваскуляризації. Ці дані вказують на те, що інактивація білка р53 дикого типу в клітинах пухлини сприяє ангіогенезу через посилену відповідь на гіпоксію, опосередковану ГІФ-1α [4].

Особливості взаємозв’язків експресії ГІФ-1α і р53 та їх вплив на перебіг захворювання у хворих на РШ мало досліджені. Метою роботи було імуногістохімічне (ІГХ) виявленння експресії ГІФ-1α та р53 у тканині РШ, аналіз кореляції експресії досліджуваних білків з клініко-патологічними характеристиками хворих та оцінка їх прогностичного значення.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Хворі. У роботі були використані операційні зразки пухлин 100 хворих (68 — чоловіків, 32 — жі- нок) на РШ, які попередньо не отримували протипухлинної терапії і знаходилися на лікуванні в Міській онкологічній лікарні МОЗ України (Київ). Пацієнти були проінформовані та дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Середній вік пацієнтів становив 61 ± 9,6 року (мінімальний — 31 рік, максимальний — 79). За гістологічною структурою пухлини ідентифіковані як аденокарциноми (69) та недиференційований рак (31).

ІГХ-методи. ІГХ-дослідження експресії ГІФ-1α та р53 було проведено з використанням відповідних МкАТ на парафінових зрізах пухлинної тканини. Зрізи товщиною 4–5 мкм депарафінували у ксилолі та регідратували у серії спиртів, після чого препарати занурювали у дистильовану воду. Ендогенну пероксидазу блокували 3% водним розчином Н2О2. В якості субстрат-хромогену

використовували 3,3′-діамінобензидин тетрагідрох-

лорид (ДАБ). Після виявлення активності пероксидази препарати дофарбовували гематоксиліном Мейєра протягом 2–3 хв. Експресію ГІФ-1α виявляли, використовуючи Сatalyzed Signal Amplification (CSA) system («Dako Cytomation», Denmark) та МкАТ проти ГІФ-1α (IgG2b, клон Н1alpha67-sup, «Abcam», UK) [1 : 1000]. Для ІГХ-виявлення білка р53 застосовували полімер-пероксидазний метод (EnVision+/HRP,

«Dako Cytomation», Denmark). Як первинні антитіла використовували МкАТ проти р53 (IgG2b, клон DO-7,

«DakoCytomation», Denmark) [1 : 50]. Для негативного контролю використовували IgG2b («Dako Cytomation», Denmark). У ролі позитивного контролю слугували МкАТ проти цитокератинів (Clone MNF116, «Dako Cytomation», Denmark). Слід зазначити, що МкАТ клону DO-7 реагують як з білком дикого, так і мутантного типу. На відміну від білка р53 дикого типу (період напіврозпаду до 20 хв), мутантний білок р53 є більш стабільним (період напіврозпаду до 24 год), що призводить до його накопичення переважно в ядрі і можливості виявлення ІГХ-методом [10].

Оцінку результатів ІГХ-дослідження проводили за допомогою світлового мікроскопа (збільшення х 400). Застосовували наступні критерії оцінки: пухлинні клі- тини класифікували як позитивні, якщо після виконання ІГХ-реакції було виявлено ядерне забарвлення; результати ІГХ-забарвлення ГІФ-1α та р53 оцінювали напівкількісним методом: у кожному препараті підраховували ≈ 1000 клітин і визначали відсоток р53- та ГІФ-1α-позитивних клітин; пухлину вважали негативною (–) за експресією ГІФ-1α та р53, якщо в тканині пухлини була відсутня ядерна реакція з відповідними антитілами або кількість забарвлених клітин була

< 10%; і позитивною (+), якщо спостерігали ядерне забарвлення в ≥ 10% пухлинних клітин.

Статистичні методи. Статистичну обробку даних проводили з використанням методів варіаційної та кореляційної статистики із застосуванням пакету

прикладних програм «STATISTICA 6.0». Для визначення наявності статистичної залежності між ознаками використовували таблиці спряженості 2 х 2 (χ2).

Виживаність хворих визначали методом Kaplan — Meier, розбіжності між кривими виживаності аналізували log-rank-тестом. Результати вважали достовірними при рівні вірогідності р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Експресію ГІФ-1α та р53, виявлену ІГХ-методом, спостерігали у ядрах клітин (рис. 1). 93% пухлин хворих на РШ були ГІФ-1α-позитивні; у 7% відзначено відсутність експресії ГІФ-1α. Кількість ГІФ-1α- позитивних клітин варіювала в межах 5,1–71,5%, медіана — 26%. Негативна експресія р53(–) була встановлена у 20%, позитивна (+) — у 80% випадків. Кількість клітин, що експресували р53, варіювала від 1 до 70%, медіана — 23%.

 

image

Рис. 1. Експресія і локалізація ГІФ-1α (а) та р53 (б) у тканині РШ; а — х 200, б — х 1000

Для аналізу взаємозв’язків експресії досліджуваних білків з деякими клініко-патологічними характеристиками виділяли 4 групи хворих: ГІФ-1α(–)/р53(–), ГІФ-1α(–)/р53(+), ГІФ-1α(+)/р53(–), ГІФ-1α(+)/

р53(+). Результати аналізу, представлені в таблиці, вказують на існування статистично значимих відмінностей за ступенем диференціювання пухлинних клітин, у яких наявна або відсутня експресія ГІФ-1α та р53. Так, ГІФ-1α(+)/р53(+) та ГІФ-1α(+)/р53(–) пухлини були

низькота недиференційованими (G3–4) частіше, ніж ГІФ-1α(–)/р53(–)-пухлини (р < 0,01). Були виявлені вірогідні відмінності між групами ГІФ-1α(–)/р53(–) і ГІФ-1α(+)/р53(+) і за категорією рТ: за наявності експресії ГІФ-1α/р53 частіше виявляли рТ2, рТ3, рТ4 (р < 0,01). Серед хворих з ГІФ-1α(+)/р53(+)-пухлинами (на відміну від ГІФ-1α(–)/р53(–)-пухлин) була більшою кількість пізніх стадій захворювання (III–IV) (р < 0,05). Слід зазначити також, що у хворих з ГІФ-1α(+)/р53(+)- пухлинами вірогідно частіше (p < 0,05), ніж у хворих з ГІФ-1α(–)/р53(–)-пухлинами, спостерігали метастази в регіонарних лімфатичних вузлах (pN1-2), проте не було виявлено відмінностей між цими групами за наявністю віддалених метастазів (М-категорія).

Таблиця

Експресія ГІФ-1α і р53 у пухлинній тканині та деякі клініко-патологічні характеристики хворих на РШ

 

Показник

 

ГІФ-1α(–)/р53(–) (n = 3)

 

ГІФ-1α(–)/р53(+) (n = 4)

 

ГІФ-1α(+)/р53(–) (n = 17)

 

ГІФ-1α(+)/р53(+) (n = 76)

Вік (роки)63,3 ± 9,155,8 ± 4,057,4 ± 10,362,0 ±9,5
Cтать    
жін.01724
чол.331052
Стадія рTNM    
I–II331129
III–IV01647*
Ступінь    
диференціювання    
G1–231120
G3–40316**56**
рТ-категорія    
Т11030
Т202112**
Т322948**
Т400416**
рN-категорія    
N0331232
N1–201544*
M-категорія    
M0341666
M100110

*р < 0,05; **р < 0,01.

Дані літератури щодо взаємозв’язків експресії ГІФ-1α та р53 з прогнозом захворювання не є однозначними. За висновком Y. Sumiyoshi і співавторів

  1. «… комбінація гіперекспресії ГІФ-1α з тенденцією до нефункціональності білка р53 вказує на несприятливий прогноз». За результатами інших досліджень гіперекспресія цих білків вірогідно не була пов’язана з прогнозом [11]. При гіперекспресії p53 у ГІФ-1α-позитивних пухлинах яєчника спостерігали кращу виживаність [12]. Деякі дослідники вважають, що неоднозначність і суперечливість даних літератури щодо взаємозв’язків експресії ГІФ-1α, р53 та прогнозу захворювання може бути зумовлена подвійною функцією ГІФ-1α, коли він, з одного боку, сприяє прогресії пухлини, з іншого — опосередковує апоптоз пухлинних клітин. Гіпоксичні пухлини з низьким aпоптотичним індексом, як повідомляли, були надмірно агресивними [13, 14]. Комбінація дисфункції

    білка p53 і гіперекспресії ГІФ-1α, очевидно, є необхідною для сприяння прогресії пухлини внаслідок індукції внутрішньоклітинної відповіді на гіпоксію без підтримки проапоптотичних механізмів [12].

    Однофакторний аналіз виживаності виявив зворотний зв’язок експресії р53 з тривалістю життя хворих: у групі хворих з р53(+)-пухлинами виживаність є вірогідно нижчою, ніж у р53(–)-групі (р < 0,01) (рис. 2а). При дослідженні взаємозв’язку експресії ГІФ-1α і виживаності було виявлено, що в групі хворих з ГІФ-1α(–)-пухлинами на момент аналізу всі пацієнти були живі, хоча показники виживаності між ГІФ-1α(–)- та ГІФ-1α(+)-групою вірогідно не відрізнялися (р = 0,2). Останнє може бути зумовлене недостатньою вибіркою хворих з ГІФ-1α(–)-пухлинами. Для більш детального аналізу виживаності хворих з ГІФ-1α(+)-пухлинами виділяли наступні умовні рівні за кількістю ГІФ-1α-позитивних клітин: 1+ (10– 25% позитивних клітин), 2+ (26–45%), 3+ (> 45%). За умов такої градації спостерігається тенденція до зниження виживаності хворих при збільшенні кількості клітин, що експресують цей маркер від ГІФ-1α(–) до ГІФ-1α(2+) умовного рівня. Неочікуваним виявилося те, що у хворих, у пухлинах яких кількість ГІФ1α-позитивних клітин перевищує 45% (3+), виживаність є вірогідно кращою, ніж при ГІФ-1α (1+) та ГІФ-1α (2+) (р < 0,05) (рис. 2б).

    Аналіз значення експресії ГІФ-1α і р53 для

    прогнозу перебігу захворювання виявив наступні закономірності: на момент аналізу не відзначено відмінності у виживаності хворих на РШ у групах ГІФ-1α(–)/р53(–) та ГІФ-1α(–)/р53(+). Се-

    редня тривалість спостереження за цими хворими становила 82 ± 20 тиж (спостереження за хворими триває). Проте виживаність хворих з ГІФ-1α(+)- пухлинами є вірогідно вищою в групі з ГІФ-1α(+)/ р53(–)-пухлинами, ніж у групі з ГІФ-1α(+)/р53(+)- пухлинами (р < 0,05) (рис. 2в).

     

    image

     

    image

     

    image

    Рис. 2. Виживаність (оцінка за методом Kaplan — Meier) хворих на РШ залежно від експресії р53 (a), ГІФ-1α (б), а також ГІФ-1α/р53 (в) у пухлинній тканині

    ВИСНОВКИ

    1. Серед хворих на РШ з ГІФ-1α(+)/р53(+)- пухлинами (порівняно з ГІФ-1α(–)/р53(–)) статистично достовірно більша частка пацієнтів з такими клініко-патологічними характеристиками, як стадія захворювання ІІІ–IV, категорія рТ2, 3, 4, наявність метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах (рN1–2), низький ступінь диференціювання (G3–4).
    2. Однофакторним аналізом встановлено зворотний зв’язок експресії р53 у пухлинних клітинах з виживаністю хворих на РШ.
    3. На момент аналізу не відзначено смертності у групі хворих на РШ з ГІФ-1α(–)-пухлинами.
    4. Виживаність хворих на РШ, у пухлинах яких кількість ГІФ-1α(+)-клітин перевищувала 45%, ві- рогідно вища порівняно з виживаністю пацієнтів, у яких кількість клітин, що експресують ГІФ-1α, знаходилася в межах 10–45%.
    5. У групі хворих на РШ з ГІФ-1α(+)/р53(–)- пухлинами виживаність є вірогідно вищою, ніж у групі з ГІФ-1α(+)/р53(+)-пухлинами.

ЛІТЕРАТУРА

  1. Dicken BJ, Bigam DL, Cass C, et al. Gastric Adenocarcinoma. Review and Considerations for Future Directions. Ann Surg 2005; 241 (1): 27–39.
  2. Рак в Україні, 2006–2007. Захворюваність, смертність показники діяльності онкологічної служби. Бюл Нац канцерреєстру України. Київ, 2008; 9. 96 с.
  1. Zhong H, De Marco A, Laughner E, et al. Over-expression of hypoxiainducible factor 1a in common human cancers and metastases. Cancer Res 1999; 59 (15): 5830–5.
  2. Фильченков АА, Стойка РС. Апоптоз и рак. Киев: Морион, 1999. 184 с.
  3. Sumiyoshi Y, Kakeji Y, Egashira A, et al. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1α and p53 is a marker for an unfavorable prognosis in gastric cancer. Clin Cancer Res 2006; 12 (17): 5112–7.
  4. Hall PA, Lance DP. p53 In tumor pathology: Can we trust immunohistochemistry? – revisited. J Pathol 1994; 172: 1–4.
  5. Urano N, Fujiwara Y, Doki Y, et al. Overexpression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in gastric adenocarcinoma. Gastric Cancer 2006; 9 (1): 44–9.
  6. Birner P, Chindl M, Obermair A, et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in epithelial ovarian tumors: its impact on prognosis and on response to chemotherapy. Clin Cancer Res 2001; 7: 1661–7.
  7. Volm M, Koomagi R. Hypoxia-inducible factor (HIF-1) and its relation to apoptosis and proliferation in lung cancer. Anticancer Res 2000; 20: 1527–34.
  8. Hockel M, Schlenger K, Kockel S, et al. Hypoxic cervical cancer with low apoptotic index are highly aggressive. Cancer Res 1999; 59: 4525–8.
    1. Graeber TG, Peterson JF, Tsai M et al. Hypoxia induces

      accumulation of p53 protein, but activation of a G1-phase checkpoint by low-oxygen condition is independent of p53 status. Mol Cell Biol 1994; 14: 6264–77.

    2. Ravi R, Mookerjee B, Bhujwalla ZM, et al. Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxia- inducible factor la. Gen Develop 2000; 14 (1): 34–44.
    3. Vaupel P. The Role of Hypoxia-Induced Factors in Tumor Progression. Oncologist 2004; 5: 10–7.
    4. Осинский СП, Глузман ДФ, Клифф Й и др. Молекулярная диагностика опухолей: фундаментальные основы и практическое применение. Киев: ДІА, 2007. 248 с.

Без комментариев » Добавить комментарий